陸、 、 、參考文 、 參考文 參考文獻 參考文 獻 獻 獻
B. 以軟體計算 SulA 之 surface-burial scores，值愈高表示具有較高的疏水性質。陰 影區域為 C-端第 20 - 30 個胺基酸序列。
Figure 5. Alignment of E.coli SulA with similar SulA sequences in other enterobacterial species.
參照 Freudl et al., 1987 繪製，四種腸道菌分別為 Salmonella typhimurium、Enterobacter aerogenes、Yersinia pestis、Serratia marcescens。
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pB42AD pB-sulA F143Y F143A I144N M145I R146L R156L N136LN139L
ββββ-galactosidase unit Figure 6. Interaction between SulA point mutants and ClpY in yeast two-hybrid system.
pGilda 帶有 BD domain 與 ClpY 形成融合蛋白，pB42AD 帶有 AD domain 與 SulA 及其各種點突變形成融合蛋白，於酵母菌 EGY48 [p8op-lacZ]中進行分析。A. LacZ expression：β-galactosidase 活性分析。B. LacZ expression：X-gal 測試。C. LEU2 expression：生長測試。F143A、M145I、R146L、R156L 的 SulA 突變蛋白與 ClpY 有較好的交互作用，在β-galactosidase 活性測試中具有活性表現；在 X-gal 培養基 上呈現藍色菌落，在缺乏 leucine 的培養基中可正常生長。而 F143Y、I144N、
N136LN139L 的 SulA 突變蛋白與 ClpY 則沒有交互作用。D. 在西方墨點法中以 anti-HA 抗體，偵測酵母菌中 AD domain 與 SulA 形成之融合蛋白表現情形，各種 SulA 點突變蛋白表現量均相一致。
A
B
C
pB42AD-Lon 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
pGilda pG-sulA ΔC10 ΔC20 ΔC30 ΔC45 ΔC20-30 ΔC20-45
ββββ-galactosidase unit
pB42AD-Lon
pB42AD-Lon
圖七、以酵母菌雙雜交系統測試各個 SulA 突變蛋白與 Lon 交互作用情形
Figure 7. Interaction between SulA deletion mutants and Lon in yeast two-hybrid system.
pB42AD 帶有 AD domain 與 Lon 形成融合蛋白，pGilda 帶有 BD domain 與 SulA 及 其各種缺失突變形成融合蛋白，於酵母菌 EGY48 [p8op-lacZ]中進行分析。A. LacZ expression：β-galactosidase 活性分析。B. LacZ expression：X-gal 測試。C. LEU2 expression：生長測試。SulA ∆C20-30 和 SulA ∆C20-45 與 Lon 有較強的交互作用，
在β-galactosidase 活性測試中，有較高的活性表現；在 X-gal 培養基上呈現深藍色 菌落，在缺乏 leucine 的培養基中生長較野生型的 SulA 快速。
80 pGilda
pG-ClpY pG-ClpY ∆L1 pG-ClpY ∆L2 pG-ClpY ∆L1&∆L2
圖八、以酵母菌雙雜交系統測試各個 SulA 突變蛋白與 ClpY 之 loop 缺失突變 蛋白交互作用情形
Figure 8. Interaction between SulA deletion mutants and loop deletion mutants of ClpY in yeast two-hybrid system.
pGilda 帶有 BD domain 與 ClpY 及其突變蛋白形成融合蛋白，pB42AD 帶有 AD domain 與 SulA 及其各種缺失突變形成融合蛋白，於酵母菌 EGY48 [p8op-lacZ]中，
分析 LEU2 表現之生長測試。ClpY ∆L2 的結果和野生型的 ClpY 相近，與 SulA
∆C45、SulA ∆C20-30 及 SulA ∆C20-45 之間交互作用較弱；而 ClpY ∆L1 則與各種 SulA 突變蛋白之間均有交互作用的情形，在缺乏 leucine 的培養基上均可生長。
+ + + + - + - +
10-110-2 10-3 10-4 10-5 10-6 MMS ClpYQ
AC3112 sulA -strain -strain
圖九、AC3112 菌株及 sulA- 菌株 YT10010 之 MMS 生長測試 Figure 9. MMS growth test of AC3112 strain and sulA- strain YT10010.
AC3112 菌株及 sulA- 菌株 YT10010 分別帶有 pBAD24-clpY 及 pBAD33-clpQ 質體，
以葡萄糖抑制其表現或以阿拉伯糖誘導其表現，經序列稀釋後，滴於含有 0.025%
MMS 及適當抗生素之培養基。當缺乏 ClpYQ 蛋白酶時，AC3112 菌株無法生長於 含 MMS 之培養基，sulA- 菌株 YT10010 則不受影響。
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A
B
Plasmid SulA
- - + - + - +
SulA ClpYQ
-
wt ∆∆∆∆C10 ∆∆∆∆C20Genomic SulA
- - + - + - + - - + - + - +
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 SulA ClpYQ
- wt ∆∆∆∆C10 ∆∆∆∆C20 - wt ∆∆∆∆C10 ∆∆∆∆C20
AC3112strain sulA-strain
圖十、SulA ∆C10 和 SulA ∆C20 突變蛋白活性表現及受 ClpYQ 蛋白酶降解之情形 Figure 10. The activity of SulA ∆C10 / SulA ∆C20 and the degradation by ClpYQ.
A. 在 AC3112 菌株 (左) 或 sulA- 菌株 YT10010 (右) 中，分別誘導 (+) 或抑制 (-) ClpYQ 蛋白酶表現，經序列稀釋後滴在含有 1 mM IPTG 之培養基。
B. 以西方墨點法偵測 SulA 蛋白累積情形，分別誘導 (+) 或抑制 (-) ClpYQ 蛋白 酶表現後，以 anti-HA 抗體偵測質體上 SulA 蛋白的表現，以 anti-FLAG 抗體偵測 染色體上 SulA 蛋白的表現。
A A
Figure 11. The activity of SulA deletion mutants and the degradation by ClpYQ.A. 在 AC3112 菌株 (上) 或 sulA- 菌株 YT10010 (下) 中，分別誘導 (+) 或抑制 (-) ClpYQ 蛋白酶表現，經序列稀釋後滴在含有 1 mM IPTG 之培養基。
B. 以西方墨點法偵測 SulA 蛋白累積情形，分別誘導 (+) 或抑制 (-) ClpYQ 蛋白 酶表現後，以 anti-HA 抗體偵測質體上 SulA 蛋白的表現，以 anti-FLAG 抗體偵測 染色體上 SulA 蛋白的表現。
84 Figure 12. The activity of SulA point mutants and the degradation by ClpYQ.
A. 在 AC3112 菌株 (左) 或 sulA- 菌株 YT10010 (右) 中，分別抑制 (上) (-) 或誘 導 (下) (+) ClpYQ 蛋白酶表現，經序列稀釋後滴在含有 1 mM IPTG 之培養基。
B. 以西方墨點法偵測 SulA 蛋白累積情形，分別誘導 (+) 或抑制 (-) ClpYQ 蛋白 酶表現後，以 anti-HA 抗體偵測質體上 SulA 蛋白的表現，以 anti-FLAG 抗體偵測 染色體上 SulA 蛋白的表現。
A A B B
(Song et al., 2000) 附圖一、大腸桿菌 ClpYQ 結構圖
Appendix figure 1. The structure of ClpYQ complex from E. coli.
A. 大腸桿菌 ClpYQ 複合體之結構，是由四個平行排列的圓環所組成，中間部份為