一、目的要求
1．熟悉培养基配方。
2．掌握培养基的配制方法。
二、仪器、药品
小锅、灭菌锅、天平、电炉、漏斗、纱布、试管、培养皿、pH 试纸、橡皮 筋、报纸、棉花、烧杯、烘箱、移液器、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、NaCl 等。
二、方法步骤 (一)、制备培养基
1. 称量药品 按照培养基配方称量药品，要求精确至 0.1g.需要注意的是，
牛肉膏要用小烧杯称重，称量净重。
2. 溶化药品 将药品放到小锅中，置于电炉上加热，直至琼脂溶解，加热 过程中要不断搅拌，防止沸腾溢出，同时要注意补水，防止糊锅。
3. 调节 pH 将溶液定容至 100mL，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.0-7.2。
4. 过滤 将溶液用纱布过滤，直至培养基澄清。
5. 分装 将培养基分装于试管和三角瓶中，试管不得超过试管的三分之一，
三角瓶不得超过五分之一。
6. 加塞 将棉塞塞入试管和三角瓶中，应松紧适度。
7. 包扎 用牛皮纸包扎好，一般 7 支试管一包，一个三角瓶一包。
8. 灭菌 加水——装锅——加热排气（2-3 次）——升压——保压灭菌
（0.1MPa,121.5℃，20-30min）——降压——出锅——搁置斜面或倒平板——无 菌检查（37℃，24-48h）
（二）、包扎培养皿（倒平板使用）
将培养皿 10 个一包，用报纸包好。
（三）、包扎移液管
将移液管每支用报纸包好，然后再用报纸将所有的移液管包成一包。
（四）、制备无菌水
在三角瓶中加入自来水，包扎好。
细菌培养基：牛肉膏 3g,蛋白胨 5g，NaCl 0.5g,琼脂 20g,水 1000mL,pH 7.0-7.2。
四、作业与思考题 1.完成实训报告。
2.培养基配制时应该注意什么问题？
3.灭菌应该注意什么问题？
五、考核评价
六、注意事项 1. 药品称量要精确
2. 溶化药品时应注意搅拌，防止沸腾。
3. 要注意培养基的 pH 值。
4. 培养基的分装：试管不超过三分之一，三角瓶不超过五分之一。
5. 使用灭菌锅应注意加水和用电安全。
评分标准(满分 100 分)
序号 考核内容
正确熟练 正确不熟 练
在指导下
完成 不能完成
得分
1 培养基配制 40 35 25 10
2 高压灭菌锅的使用 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
任务二土壤中放线菌的分离 一、实验目的
1．学习稀有放线菌的选择性分离方法。
2．从以上稀有放线菌中寻找新型抗生素。
二、实验原理
放线菌是新型生物活性代谢产物的重要来源。然而由于大多数放线菌菌株已 被反复研究过，从中发现新化合物的概率在逐渐降低。新菌种必然有新的基因，
新基因必然产生新的代谢产物，这一观点早已为微生物学及微生物药物工作者所 接受。由瓦克斯曼( Waksman)建立的抗生素筛选系统适于从土壤微生物（主要是 从链霉菌）的代谢产物中来寻找抗生素，但要用该法发现新抗生素已变得越来越 难。20 世纪 50 年代后，人们发现稀有放线菌也具有产生抗生素的潜力，如紫色 小单孢菌可产生庆大霉素，诺卡氏菌可产生利福霉素，马杜拉放线菌可产生马杜 拉霉素、洋红霉素等。此外，稀有放线菌也能产生酶、维生素、氨基酸等其他生 理活性物质，因此，从稀有放线菌中寻找新型生理活性物质已成为当今发酵研究 的热点之一。
分离稀有放线菌的操作与实验 1-1 大致相同，只不过需要用更高选择度的分 离培养基和分离条件。样品需先经干燥及高温处理以杀灭不耐热、不耐干燥的非 目的菌，再根据稀有放线菌对某些化学药品的抗性较强这一原理，用这些化学药 剂处理样品稀释液，以杀死链霉菌属的放线菌。为了尽可能增加目的放线菌的数 量，在培养基中还可加入这类稀有放线菌特有的抗生素。
三、实验器材与试剂
各小组根据选择的目标稀有放线菌，在查阅资料的基础上确定所需要的器材 与培养基，按方案申请器材，并领用（负责保管）
器材按以下主要器材，数量、规格及说明列表申请，并于表格上注明小组信 息。
如：培养皿（D=90mm, 50×6 套），
移液管（1mL ，8×6 支），
三角瓶(250mL, 8×6)，……
注：建议全班分 6 小组，各器材请按小组配置；
试剂：按培养基内容及预制数量申请，配制后灭菌备用。
常用稀有放线菌培养基配方如下：
(1) HV 琼脂培养基(HVA)： 腐殖酸 1.0 g，CaCO3 0.02 g，Na2 HPO40.5 g，
MgS04.7H20 0.5 g， KCl 1.7 g，FeS04.7H20 0.01 g，维生素 B2 0.5 mg，维生素 B1 0.5 mg，维生素 B6 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 0.5 mg，泛酸 0.5 mg，生物素 0.25 mg，对氨基苯甲酸 0.5 mg，琼脂 20 g，水 1000 mL， pH 7.2。
(2) LSV - SE 琼脂培养基：木质素 1.0 g，豆饼粉 0.2 g，CaCO3 0.02 g，
Na2HP040.5 g，MgSO4．7H20 0.5 g，KC1 1.7 g，FeS04. 7H2 O 0.01 g，维生素 B2 0.5 mg，维生素 B1 0.5 mg，维生素 B6 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 0.5 mg，
泛酸 0.5 mg，生物素 0.25 mg，对氨基苯甲酸 0.5 mg，琼脂 20 g，水 1000 mL，pH 7.2。
(3) 土壤浸汁琼脂培养基：把富含有机物质的园土风干后过筛，称细土 400 g 加至 900 mL 自来水中，121℃(0.1 MPa)下蒸煮 30 min，静置冷却（过夜），上 清液用滤纸过滤，取滤液 250 mL，加腐殖酸（或木质素）1 g，琼脂 20 g，定容 至 1000 mL，调 pH 至 7.2。
(4) 淀粉酪素琼脂培养基：可溶性淀粉 10 g，水解酪素 2g，琼脂 20 g，水 1000 mL，pH 7.2。
(5) GYEA 培养基：葡萄糖 20 g，酵母浸膏 10 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，pH 自然。
四、实验步骤
各小组按以下资料或自己查阅资料，针对某一种类的稀有放线菌，进行分
离设计。
静止 2 min 后，吸取上层菌悬液 0.5 mL 至 4 mL 无菌水中，摇匀后再加 0.5 mL 15%的 苯酚溶液，制成 10-2 土壤悬浮液（含 1.5 %苯酚），30℃处理 30 min 后，吸取 0.5mL 10-2 悬浮液至 4.5 mL 无菌水中，制成 10-3 悬浮液，同法制成 10-4 悬浮液。
(4)吸取 10-3 和 10-4 稀释液各 0.2 mL 涂布 HVA 平板，30℃恒温箱中倒置培 养，5d 后逐日观察。根据菌落形态挑取小单孢菌（可占总菌落数的 60%以上）。
2．小双孢菌的选择性分离 小双孢菌（Microbispora）的基内菌丝不产生 孢子，而气生菌丝上可形成成对的孢子。大多数小双孢菌需要 B 族维生素，特别
4．游动放线菌的选择性分离
( GYEA)培养基中添加适量的利福平可以有效地抑制细菌和非目的放线菌的生长，
利福平也可用新生霉素( 25 mg/L)代替。分离程序为：
土样风干→100℃干热处理 15 min→制备土壤稀释液（10-1，10-2，10-3）→
吸 10-3 稀释液 0.2 mL 涂平板（GYEA+放线酮 100 mg/L+利福平 5 mg/L）。