一、实验目的：
1. 了解常用培养基的组成成分与特点；
2. 能根据培养的要求配制出适宜的培养基；
3. 掌握培养基灭菌的操作方法。
二、实验原理：
培养基的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养 基的组成成分和特点显得尤为重要。目前所使用的培养基有10 余种之多，大部 分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。培养基含有植物细胞生 长所必需的各类营养物质，同时也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此 必须对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。
评分标准(满分 100 分)
序号 考核内容
正确熟练 正确不熟练 在指导下完
成 不能完成
得分
1 各母液配制配方 40 35 25 10
2 母液配制方法 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成
情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
三、实验器材及试剂：
【实验药品和试剂】
蔗糖、琼脂、活性炭、1mol/L HCl，1mol/L NaOH；6-BA、NAA、2,4-D 等植 物激素母液及 MS 基本培养基母液。
【实验仪器及用具】
电子天平、烧杯（1000mL, 500mL, 100mL, 50mL）、量筒（1000mL,500mL, 100mL, 50mL）、药勺、称量纸、玻璃棒、移液枪（5mL, 1mL,0.2mL）、电炉
（1000W）、石棉网、标签纸、记号笔、培养瓶、酸度计或 pH 试纸（5.0~9.0）、
冰箱、卧式电压力蒸汽灭菌锅。
四、实验步骤：
（1）根据培养基的配方计算取用量 生姜试管苗增殖培养基：
MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+ 3%蔗糖+ 0.8%琼脂条(pH5.8)，已知各种母 液浓度如下表所示：
试计算配制 1L 生姜试管苗增殖培养基，所需各种母液的用量，蔗糖和琼脂 条各称取多少克？（完成上述表格）
（2）培养基的配制过程
①加水、琼脂及蔗糖：取 1000mL 烧杯一个，倒入 800mL 左右的蒸馏水，将 预先准备好的琼脂倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全 溶化后，加入蔗糖，充分溶解。
注意：在加热琼脂过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就 需要重新称量、制备。此外要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯 容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
母液名称 母液浓度 浓缩倍数 1000mL 培养基吸取量
大量元素 20
微量元素 1000
有机成分 100
铁盐 100
NAA 0.2 mg/mL 6-BA 0.5 mg/mL
②取母液：根据计算结果，将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻 璃器皿等放在指定位置。取 100mL 烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用 各母液专用移液枪分别吸取微量元素母液，有机成分母液、铁盐母液和生长物质 母液，置于烧杯中备用。
注意：各种母液的枪头不要混用，以免污染药品。
③培养基定容：将准备好的各种母液混合液缓慢倒入 1000mL 的烧杯（已溶 解了蔗糖和琼脂）中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入烧杯 中，并用玻棒不停搅拌,使其充分混匀。加蒸馏水定容到 1000mL。
④ 调 节 pH 值 ： 用 1mol/L HCl 或 1mol/L NaOH 将 培 养 基 pH 值 调 节 至 5.8~6.0。用酸碱调节 pH 值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用 pH 试纸或 pH 计测 试培养基的 pH 值。
注意：1mol/L HCL 配制：用量筒量取 8.3mL 配成 100mL 溶液。
1mol/L NaOH 配制：称取 NaOH 4g 配成 100mL 溶液。
⑤分装：溶化的培养基应该趁热分装，每瓶大约 40~50mL（1/4～1/3），盖 上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌 用。
注意：倒入培养基时要注意不要将培养液沾在瓶口，以免让杂菌顺培养液侵 入瓶内。
（3）培养基的灭菌：（灭菌条件：121℃，20-25 分钟）
①检查灭菌锅内水位，水量过少时应添加适量水。把分装好的培养基及其他 需灭菌的各种器具和蒸馏水放入灭菌锅的消毒桶内。
②拧紧锅盖控制阀，注意最好是呈对角线拧紧。然后关闭放气阀，打开电源，
设置好温度和时间参数，按启动键开始加热。
③当高压锅的温度达 121℃，压力为 0.105MPa 时，保持此压力15~30 分钟进 行灭菌。
④灭菌时间结束后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表 指针降到 0 时，打开排气阀，旋松控制阀，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。
刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基 沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置 3 天，观察有无微生物 生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。
要求：每人准备培养基 5 瓶。
注意：①锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅 内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。
②当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过 长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。
③培养瓶中的液体不超过总体积的 50%，否则当温度超过 100℃时，培养基 会喷溢，造成培养瓶壁和瓶盖的污染。
④消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置 24-72h。放置后如果培养 基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。
⑤做好的培养基一般应在 1-2 周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能 尽快用完，应放在 4℃条件下。
【练习与思考】
培养基配制过程中应注意哪些问题？培养基为什么要煮沸后再分装？
五、考核评价
任务三植物外植体初代培养 一、实验目的
1.掌握初代培养的关键技术。
2.学会进行外植体的选择和接种。
3.熟悉外植体初代培养过程中易出现的问题，并学会分析和解决这些问题。
评分标准(满分 100 分)
序号 考核内容
正确熟练 正确不熟 练
在指导下
完成 不能完成
得分
1 各母液配制配方 40 35 25 10
2 母液配制方法 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
二、实验仪器
1.电子天平（感量为 0.0001g）、烧杯、接种瓶、容量瓶、试剂瓶、药勺、
玻璃棒、电炉、石棉网、称量纸、滴管、冰箱、超净工作台、接种器械、pH 试 纸
2.母液（大量元素、微量元素。铁盐、有机成分）、激素 6-BA、NAA、
2,4-D、升汞(0.1%)、蒸馏水、活性炭、琼脂粉、酒精(75%和 95%).
三、内容说明
（一）外植体选择
1.材料易得且遗传稳定。
2.再生能力强。
3.容易灭菌。
4.外植体的大小。材料越小，成活率越低，除非用于脱毒，否则不宜将外植 体切得太小。
（二）外植体增殖方式
1.从生芽增殖/直接器官途径。
2.不定芽增殖/间接器官途径。
3.原球茎增殖。
4.胚状体增殖。
四、操作步骤（以薄荷为例）
（1）无菌操作前 30min，首先用 70%酒精棉擦拭超净工作台，然后把接种器 具和培养基等移入接种室，并用 70%酒精喷洒，开启超净工作台和接种室内的紫 外灯照射 20~30min 后，再开启工作台气流 20~30min；
（2）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并用 75%酒精喷洒全 身。
（3）进入无菌操作室，检查接种所用的各种器具和物品是否齐全。
（4）接种前，用酒精棉球擦拭双手，然后在酒精灯火焰附近进行各项操作，
操作时动作要轻捷。组培过程中，将消毒的薄荷茎段放到初代诱导培养基上进行 培养，约 7d 后茎段芽开。
五、作业及思考 1.完成实训报告。
2.外植体初代培养中易发生的污染有哪些？
2,4-D、升汞(0.1%)、蒸馏水、活性炭、琼脂粉、酒精(75%和 95%).
增殖培养基:
MS +NAA1.0mg/ L＋3％蔗糖＋6％琼脂 MS +IAA2.0mg/L＋3％蔗糖＋6％琼脂 三、内容说明
四、操作步骤
接着初代培养后操作，诱导培养 15d 后将已长出的无菌苗剪成 1—1.5cm 的 茎段接种到增殖培养基中，一星期以后丛生芽较多且生长健壮旺盛。
五、培养条件
本次实验的培养条件为：培养基 pH：5.8；培养温度：(25 士)2℃；光照：
10~12 小时，光照度 2000 lx。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的 主要因素有温度、光照、湿度、氧气、培养基的渗透压及 pH 值等。1.温度植物 组织培养中，大多数植物最适温度为 25±2℃。低于 15℃时，培养的组织生长停 顿，高于 35℃对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备。
视植物生态习性采用变温培养。2.光照光照对植物生长发育有重要作用，是离体 培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光周期，对细胞的增殖、器官 的分化都有很大影响。①光照强度，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、
细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。一般来说，光照强度较强，幼苗 生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。除特殊要求外，一般都采用日光灯 作光源，光照强度 3000~4000Lx 左右。光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以 及器官的分化都有明显的影响。3.湿度湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条 件。培养初期，培养瓶内相对湿度通常是 100%，主要受培养基水分含量和封口 材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将 使培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。环境的相 对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求 70~80%的相对湿度，常用加湿器 或经常洒水的方式来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基 的各种成成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行；湿度 过高时，易导致杂菌滋生，大量污染。4.pH 值 pＨ值适度因植物材料而异，不同 的材料对培养基最适 pＨ值的要求也是不同的，大多在 5.0～6.5 左右，一般培 养基 pＨ值皆掌握在 5.8 左右，这基本能适应大多数植物培养的需要。
5. 氧气离体培养的试管苗是需要氧气的，因此，接种时要有部分组织与空 气接触。振荡培养是解决液体培养通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，
培养物也不能（很好）生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气。
培养室要经常换气，改善室内的通气状况。一般来说当 pＨ值高于 6.5 时，培养
培养室要经常换气，改善室内的通气状况。一般来说当 pＨ值高于 6.5 时，培养