由以上綠色化學製程中所取得的12個帶(bands)，本實驗另一方面以傳統管柱 層析的方式進行化合物的分離與純化，除了能比較綠色化學製程與傳統分離的異 同外，藉由傳統分離的方式所得到的活性指標化合物主成份及綠色化學製程的12 個帶(bands)經薄板層析分析比較後更可以確定綠色化學製程中各個帶(bands)的 主成份為何、分布於哪個帶(bands) 上。
分離流程如下：
將經過二氧化碳超臨界流體萃取出來的粗萃取物(ZR-1, 2克)以正相管柱層析 (normal phase open column chromatography)進行分離，溶媒系統為(n-hexane：
EtOAc=25：1→ n-hexane：EtOAc=15：1→ n-hexane：EtOAc=5：1→ n-hexane：
EtOAc=1：1→ EtOAc → EtOAc：MeOH=8：1)經薄板層析分析比較後共合併成25 個劃分。此25個劃分進一步進行各劃分主成份的分離與純化，所使用的器材為 Sephadex-LH20 以 及 正 相 製 備 型 TLC 。 於 劃 分 1 分 離 與 純 化 得 curzerenone 以 及 curdione、於劃分4分離與純化得zedorone、於劃分7與劃分8合併，分離與純化得 curcumenone、於劃分13分離與純化得procurcumenone、於劃分17分離與純化得 zedoarondiol。以上6個主成分的結構鑑定藉由核磁共振光譜(NMR,Nuclear magnetic resonance)及質譜(Mass)比對過去文獻確定。
化合物的結構如下所示。
以下為莪朮的二氧化碳超臨界萃取的製造方法：
Sc-CO2+Ethanol
ZR-8
觀察薄層層析片後，ZR-1-1其重量約為650mg，經由管柱層色層分析進行純化
ZR-1-4-S4 (108.mg)利用分子篩管柱層析的方式(sephadex-LH20)，溶媒系統為 CH2Cl2：EtOAc：Methanol=1：1：6，將分子篩管柱填充完成，用濾紙將ZR-1-4-S4 過濾後，經減壓濃縮的方式，將ZR-1-4-S4濃縮到體積不到0.2毫升，打開管柱開關
以溶媒系統為CH2Cl2：EtOAc：Methanol=1：1：6進行沖堤，經TLC噴上50%濃硫
酸加熱後，檢測TLC上的5個次劃分，其中第2個次劃分，重量約為35.4mg，再經 過一次管柱色層分析(silic gel chromatography)純化後，得到10個次劃分，經TLC 判讀後，決定將次劃分3、次劃分4、次劃分5合併，以製備型TLC純化的方式，拿 到純化物4.(curcumenone) ，重量約為13.45mg。
ZR-1-13重量約為191.27mg，觀察薄層層析片後，利用矽膠管柱層析的方式進 行純化，其溶媒系統為n-hexane：EtOAc=2：1進行沖堤後，總共得到10個劃分，
其中第三個劃分其重量約為58.33mg，此部分透過製備型薄層層析片方式進行純 化 ， 其 溶 媒 系 統 為 n-hexane ： EtOAc=1 ： 1 進 行 純 化 ， 得 到 一 純 化 物 質 5.
(procurcumenone)其重量為11.61mg。
ZR-1-17重量約為79.54mg，經由TLC判讀後，利用製備型薄層層析方式進行 純化，得到了5個劃分，其中第二個劃分重量約為14.11mg，經由分子篩管柱層析 (sephadex-LH20)進行進一步精緻純化，以溶媒系統為CH2Cl2：EtOAc：Methanol =1：1：6進行沖堤，經TLC噴上50%濃硫酸加熱後，可以得到一個純化物質6.
(zedoarondiol)，重量約為11.48mg。
圖2-5 ZR-1的傳統分離流程圖：
The extract of rhizome of Curcuma zedoaria (ZR-1) 2.0克
Silica gel chromatography 22.5cm×4.7cm×4.7cm
圖 2-6 從ZR-1(100 bar)分離出25個劃分之重量：
fr.01：658.52mg fr.02：110.54mg fr03：111.58mg fr04： 108.00mg fr05：178.00mg fr06： 5.28mg fr07： 15.65mg fr08： 14.66mg fr09： 57.18mg fr10： 24.67mg fr11： 45.51mg fr12： 36.41mg fr13：191.27mg fr14： 41.48mg fr15： 28.46mg fr16： 37.17mg fr17： 91.53mg fr18： 21.28mg fr19： 17.13mg fr20： 7.86mg fr21： 23.00mg fr22： 8.34mg fr23： 5.23mg fr24： 9.70mg fr25： 22.02mg
圖2-7 ZR-1(100 bar)之薄層層析法(TLC)圖示：
圖 2-8 二氧化碳超臨界流體萃取之TLC最佳展開條件：
n-hexane : EtOAc 1 : 2
n-hexane : EtOAc 6 : 1
n-hexane : EtOAc 3 : 2 n-hexane : EtOAc
1 : 1
圖 2-9 二氧化碳超臨界流體添加無水乙醇共萃取之TLC最佳展開條件
n-hexane : EtOAc 1 : 5 n-hexane : EtOAc
3 : 2
表 2-2 利用不同二氧化碳超臨界萃取條件所得到之萃取產率
編碼 ZR-1 ZR-2 ZR-3 ZR-4 ZR-5 ZR-6 ZR-7 ZR-8
重量(mg) 518.5 340.6 300.5 103.9 701.7 286.0 359.6 133.6
圖 2-11 二氧化碳超臨界萃取儀裝置：
收集瓶 微量調節閥
出口閥
洩壓閥 入口閥
壓力指示器
電源開關 反應管柱溫度 實際溫度
壓力調節機
共溶劑注射器
超臨界萃取反應烘箱
空氣鋼瓶 二氧化碳鋼瓶
低溫循環機
第三章 化合物之結構證明
acetate=8：1, Rf=0.66)，以 UV 燈觀察(短波 254nm，長波 365nm)可發現相當明顯 的點，噴50%硫酸溶液加熱後為深藍色的點。由 ESI-MS 得知其假性分子離子峰 在低磁場區有 4 組雙鍵訊號，δc165.5 (C-8)、δc145.4 (C-1)、δc141.0 (C-4)、δc139.5(C-12)、δc120.1 (C-7)、δc119.2 (C-11)、δc115.5 (C-2)、δc112.9 (C-3)，剩下 δc42.8 (C-10)、δc64.0 (C-5)為 4 級碳之訊號。
綜合以上光譜分析，經文獻比對後60，確定此化合物結構為curzerenone。
圖3.1.1 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 1H-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.1.2 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之13C-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.1.3 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.1.4 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 HMQC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.1.5 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 COSY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.1.6 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 HMBC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.1.7 Curzerenone (ZR-1-1-si5-S2-1)之 NOESY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.1.8 Curzerenone(ZR-1-1-si5-S2-1)之質譜儀分析
圖3.1.9 curzerenone 之紫外光譜分析
圖3.1.10 curzerenone 之紅外光譜分析
表 3.1 Spectra data of curzerenone (1)
3.2 Curdione 之結構證明
化合物 2 為白色油狀物形式分離得到，其 TLC 片展開後(n-hexane：ethyl acetate=
5：1, Rf=0.46)，以 UV 燈觀察(短波 254nm，長波 365nm)可發現相當明顯的點，
噴 50%硫酸溶液加熱後為深藍色的點。由 ESI-MS 得知其假性分子離子峰為 m/z (C-8)有 carbonyl group 吸收訊號，並於 δc131.5 (C-1)、δc129.8 (C-10)上有一組雙鍵 之吸收訊號，從 DEPT 光譜上可以觀察到有 4 支甲基的吸收訊號，分別為 δc16.5 (C-14)、δc18.5 (C-15)、δc19.8 (C-12)、δc21.0 (C-13)，另外可觀察到 4 支四級碳之
吸收訊號，分別為δc46.7 (C-4)、δc129.8 (C-10)、δc214.3 (C-5)、δc211.1 (C-8)和 4 支三級碳訊號，分別為δc26.3 (C-2)、δc30.8 (C-11)、δc53.5 (C-7)、131.5 (C-1)，二 級碳之訊號分別為δc33.9 (C-3)、δc44.1 (C-6)、δc55.7 (C-9)、δc26.3 (C-2)。
經由上述光譜分析，在經與相關文獻比對後61，確定化合物 2 為curdione。
圖3.2.1 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 1H-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.2.2 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之13C–NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.2.3 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.2.4 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 HMQC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.2.5 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 COSY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.2.6 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 HMBC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.2.7 Curdione (ZR-1-1-si6-S1-2) 之 NOESY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.2.8 curdione (ZR-1-1-si6-S1-2)之質譜儀分析
圖3.2.9 curdione 之紫外光譜分析
圖3.2.10 curdione 之紅外光譜分析
表3.2 Spectra data of curdione (2)
3.3 Zederone 之結構證明
片展開後(n-hexane：EtOAc＝5：1, Rf：0.39)，以 UV 燈觀察(短波 254nm)有明顯 的點，噴50%硫酸容易加熱後呈褐色(如下圖所示)測此化合物為sesquiterpenoid 類骨架。
此doublet 甲基受去遮蔽影響而訊號移至 δH2.09 (3H, d, J=1.2 Hz)，推測其接在 3 級碳的雙鍵上，由其 coupling constant (J=1.2 Hz)，以及在低磁場所觀察到 δH 7.06 (1H, q, J=1.2 Hz)的訊號，推測此結構含 2-methylfuran 片段，兩者具 long-range coupling，即 W-shape conformation；在 δH 5.47 (1H, dd, J=11.5, 4.0 Hz)另可觀察到 雙鍵上氫的訊號，由上述特徵光譜訊號可推測此化合物為 furannogermacrane sesquiterpene 類化合物。
除以上氫訊號外，還有δH 3.68 (1H, br s, J=16.5 Hz)、δH 3.71(1H, br s, J=16.5 Hz)以及 δH 3.79 (1H, s)，比對過去文獻，以上各為 zederone 之 H2-9 和 H-5 的特徵 訊號。所以推測此化合物為zederone。
經由上述光譜分析，在經與相關文獻比對後 62，確定化合物 3 為 Zederone。
圖3.3.1 Zederone (ZR-1-4-S4)之 1H-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.3.2 Zederone (ZR-1-4-S4)之13C–NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.3.3 Zederone (ZR-1-4-S4)之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.3.4 Zederone (ZR-1-4-S4)之 HMQC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.3.5 Zederone (ZR-1-4-S4)之 COSY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.3.6 Zederone (ZR-1-4-S4)之 HMBC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.3.7 Zederone (ZR-1-4-S4)之 NOESY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.3.8 Zederone(ZR-1-4-S4)之質譜儀分析
圖3.3.9 Zederone 之紫外光譜分析
圖3.3.10 Zederone 之紅外光譜分析
表.3.3 Spectra data of zederone (3)
3.4 Curcumenone 之結構證明
純化合物 4 為無色油狀物，經 TLC 展開後(n-hexane：EtOAc= 4：1)，從正相 薄層層析片上短波觀察有強UV 吸收，由 ESI-MS 得知其假性分子離子峰為 m/z 235 [M+H]+，配合 1H-NMR 及 13C-NMR 圖譜推算其分子式為 C15H22O2。
由1H-NMR 圖譜 (CDCl3，400MHz) 觀察到 0.44 (1H, dt, J=7.3, 4.4 Hz)，0.68 (1H, q, J=4.4 Hz)為典型環丙烷氫質子之吸收訊號，此外從碳譜可觀察到 2 個 vinylic methyls、2 個 tertiary methyls、4 個 methylene 吸收訊號
從1H-NMR 圖譜(CDCl3，400MHz)上觀察到 δH1.61 (H-2, q)造成 δH0.44 (1H, dt,
峰訊號。
搭配13C-NMR 圖譜(CDCl3，400MHz)觀察，得知此化合物具有 15 個碳訊號，
推測此為一sesquiterpene 類化合物。在 13C-NMR 圖譜上觀察到二支酮基吸收訊號 δc201.5(C-8)、δc208.6 (C-8)及一組雙鍵吸收訊號 δc128.0 (C-7)、δc147.3 (C-11)，
其中 δc 24.2 (C-1)及 δc 24.2 (C-5)有訊號重疊的現象且 δc 23.4 (C-2)及 δc 23.4(C-12)、δc 23.4(C-13)也有訊號重疊的現象。
綜合以上光譜分析，經文獻比對後63，確定此化合物結構為 curcumenone
。
圖3.4.1 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之 1H-NMR 光譜圖(CDCl3，200 MHz)
圖3.4.2 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之13C -NMR 光譜圖(CDCl3，200 MHz)
圖3.4.3 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.4.4 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之質譜儀分析
圖3.4.5 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之紫外光譜分析
圖3.4.6 Curcumenone (ZR-1-7-8-S2-si3)之紅外光譜分析
表3.4 Spectra data of curcumenone (4)
C H
C1 24.2 0.44 (1H, dt, J=7.3, 4.4) C2 23.4 1.61 (H-2, q, J=7.4 Hz) C3 43.9 2.46 (H-3, t, J=7.4 Hz)
C4 208.6 -
C5 24.2 0.68 (1H, q, J=4.6 Hz)
C6 28.0 2.81
C7 128.0 -
C8 201.5 -
C9 48.9 2.52 (d, J=15.6) 2.51 (d, J=15.6)
C10 20.1 -
C11 147.3 -
C12 23.4 2.08
C13 23.4 1.78
C14 29.7 2.12
C15 19.0 1.10
3.5 Procurcumenone 之結構證明
(C-2)、δC28.5 (C-3)、δC39.8 (C-6)為亞甲基之吸收訊號。
綜合上述光譜分析，在經與相關文獻比對後 64，確定其結構為 procurcumenone。
圖3.5.1 procurcumenone (ZR-1-13-si3-1)之1H-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.5 .2 procurcumenone (ZR-1-13-si3-1)之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.5.3 procurcumenone (ZR-1-13-si3-1)之質譜儀分析
圖3.5.4 procurcumenone (ZR-1-13-si3-1)之紫外光譜分析
圖3.5.5 procurcumenone (ZR-1-13-si3-1)之紅外光譜分析
表 3.5 Spectra data of procurcumenone (5)
C H
3.6 Zedoarondiol 之結構證明
化合物 6 為無色針狀物質，其 TLC 片展開後(n-hexane：ethyl acetate=1：1, Rf=0.38)，以 UV 燈觀察(短波 254nm，長波 365nm)可發現相當明顯的點，噴 50%
硫酸溶液加熱後為暗粉紅色之點。由 ESI-MS 得知其假性分子離子峰為 m/z 253
之訊號。
由 13C-NMR 光譜得知此化合物具有 15 個碳訊號，推測此為一 sesquiterpene 類 化 合 物 。 經 1 3C-NMR 圖譜上觀察，在 δC202.88 上有一支酮基訊號，
δC142.17、δC134.59 為四取代雙鍵之訊號，δC79.95、δC72.74 則為三級碳之訊號，
在 δC55.90、δC51.96 有 2 支 methine 之訊號，另外在 δC59.78、δC39.68、
δC28.46、δC22.65 有 4 支 methylene 之訊號，最後由 DEPT 圖譜上判讀，在 δC22.86、δC22.65、δC21.84、δC20.57 為 zedoarondiol 上 4 支甲基特徵訊號。
綜合上述光譜分析，在經與相關文獻比對後65，結果一致而確定其結構，推斷 本化合物6 為已知化合物：zedoarondiol。
圖3.6.1 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之 1H-NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.6.2 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之13C -NMR 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.6.3 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之 DEPT 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.6.4 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之 HMQC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.6.5 Zedoarondiol (ZR-1-17-si2-S1)之 COSY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.6.6 Zedoarondiol (ZR-1-17-si2-S1)之 HMBC 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖 3.6.7 Zedoarondiol(
圖 3.6.7 Zedoarondiol (ZR-1-17-si2-S1)之 NOESY 光譜圖(CDCl3，400 MHz)
圖3.6.8 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之質譜儀分析
圖3.6.9 Zedoarondiol (ZR-1-17-si2-S1)之紫外光譜分析
圖3.6.10 Zedoarondiol(ZR-1-17-si2-S1)之紅外光譜分析
表 3.6 Spectra data of zederondiol (6)
3.7 抗血小板凝集生物活性結果：
(
inducer: collagen 10μg/ml)
樣本代號標示(粗萃取物) 條件 結果
ZR-1 100 bar 86.67
ZR-2 300 bar 97.33
ZR-3 500 bar 53.33
ZR-4 Residues add MeOH Promote aggregation
ZR-5 100 bar add
co-solvent
86.67
ZR-6 300 bar add co-solvent 70.67 ZR-7 500 bar add co-solvent 76.00
ZR-8 Residues add MeOH Promote aggregation
第四章、討論
本實驗以傳統天然物化學的分離純化由 ZR-1 共分離純化到 6 個主成 分，以溶媒系統為 n-hexane：EtOAc=6：1 展開時，各化合物的比移植(R
f
, retention factor)如下：curzerenone(1)(Rf
：0.66)、curdione(2)(Rf
：0.56)、zedorone(3)(R
f
：0.36)、curcumenone(4)(Rf
：0.27)，另外純化物 5、6 的部 分 再 以 溶 媒 系 統 n-hexane ： EtOAc=1 ： 1 展 開 ， 其 比 移 值 如 下 ， procurcumenone(5)(Rf
：0.4)，zedoarondiol(6)(Rf
：0.38)。若以相同溶媒系統進行綠色化學製程所得到的 12 個帶(bands)(ZR-1 到 ZR-12)之薄板層析分析，可發現 curzerenone (1)(R
f
：0.66)應為綠色化學製程 中的 ZR-1-4 得主成分，curdione (2)(Rf
：0.56)應為綠色化學製程中的 ZR-1-5 的主成分，zedorone (3)(Rf
：0.36)為綠色化學製程中的 ZR-1-7 的主成分，curcumenone (4)(R
f
： 0.27) 為 綠 色 化 學 製 程 中 ZR-1-8 的 主 成 分 ，ht
http://tcam.ccmp.gov.tw/meun_know_1_content.asp?aaa=336
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