護肝作用

從莪朮根莖部經由丙酮萃取具有保護肝臟的倍半萜烯類化合物有：

sesquiterpene、furanodiene、germacrone、curdione、neocurdione、curcumenol、

isocurcumenol、aerugidiol、zedoarondiol、curcumenone、curcumin，這些化合物在 老鼠模式中D-galactosamine / lipopolysaccheride 誘導急性肝損傷具有很好的保護效 果。其保護肝臟的可能機轉：LPS 在老鼠巨噬細胞中誘導一氧化氮(NO)的產生和 D-Gal N/TNF-α 誘導肝臟損傷。⁴⁸ hMF（human hepatic myofibroblast cells）大部分 從肝臟星狀細胞衍生出來、增生，從莪朮的水層萃取物中評估 hMF 生長抑制的情 形，另外可以明顯的降低 serum-driven cell proliferation，可以藉由細胞核的自動攝 影照相技術實驗、實際細胞生長來評估。另外在藥理機轉方面，莪朮可以快速增 加prostaglandin E2 產生，然後才是 cAMP，莪朮雖可以抑制 hMF，但卻不影響 cAMP 表現量。⁴⁹

1.11.10 抗發炎活性作用

在抗發炎活性上從甲純萃取層上分離到的2 個純化物質(curzenone、

dehydrocurdione)其抑制 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)分別有 75%及 53%的抑制抗發炎作用的能力。⁵³

1.11.11 紅血球凝集活性

莪朮萃取物已經被報導過具有紅血球凝集活性，從不同莪朮的種中由 Mg/np-40 萃取法取得粗蛋白質，莪朮的顯示有抗兔紅血球凝集的作用。⁵⁴

1.11.12 抗突變作用

從中藥材中分離出36 個抗癌粗萃取藥物來研究其抗突變作用的活性。一般使 用Salmonella/microsomal 系統來研究抗突變作用，在 picrolonic、benzoapyrene 來 偵 測 直 接 突 變 或 者 是 間 接 性 突 變 。 實 驗 結 果 發 現 莪 朮 萃 取 物 可 以 調 整 抗 benzoapyrene 作用。⁵⁵

1.11.13 細胞毒殺作用

莪朮水萃取層及甲醇萃取層使用2 種抗癌細胞株（large cell lung carcinoma

(CORL-23)、prostate cancer(PC3)及 1 株人類正常細胞株(fibroblast cells(10FS)來 測試抗毒殺作用活性，細胞毒殺的方法則是根據Skehan 等人(1990)的 SRB 分析方 法(Sulforhodamine B assay, SRB)，其原理是由 sulforhodamine B 中之磺酸基的陰

性蛋白質，於弱酸性環境下與細胞內蛋白質的鹼性氨基酸結合，接著使用弱鹼溶 液萃取細胞內的SRB 並測量其吸光值，藉由 SRB 的含量即可得知細胞內的蛋白質 含量，並以此代表細胞存活率。其中莪朮乙醇萃取物有 corl-23 和 PC-3 有很好的 細胞毒殺作用，而且對lung cancer cell lines 有很好的細胞毒殺作用，但是對正常 細胞沒有太大的毒性。⁵⁵Myoungae 等人的研究報告指出 hexane 層中所有的劃分層 中，α-curcumene 及 β-tumerone 對 SiHa 和 HepG₂細胞株有很好的毒殺作用。⁵⁶另外 在Matthes 等人的報告中，zerumbone、zerumbone epoxide、diferuloyl- methane、

di-p-coumaroylmethane 對細胞毒殺也有很好的效果。⁵⁸

相關文獻在西元1998年從Bioorganic Medicinal Chemistry Letter發表的文章指 出，從莪朮內萃取出來的倍半萜烯類化合物具有抑制急性肝損傷的抑制作用。從 莪 朮 內 丙 酮 粗 萃 層 萃 取 出 來 的 倍 半 萜 烯 骨 架 化 合 物 ， 例 如 : curcumenone 、 curcumin 、 furanodiene 、 germacrane 、 curdione 、 neocurdione 、 curcumenol、isocurcumenol、aerugidiol，這些倍半萜烯骨架化合物在老鼠實驗中，

D-galactosaine(D-GalN)/ lipopolysaccharide(LPS)具有抑制急性肝損傷有很好的抑

制作用。在D-galactosaine(D-GalN)和lipopolysaccharide (LPS)誘導肝損傷實驗中， guaidiol有毒殺卵巢癌細胞的效果，3,7-dimethylindan-5-carboxylic acid 的延伸研究 中也證實可以殺死不同模式的癌細胞（human HCT-15及 HT-29、大腸直腸癌、erb B2 oncogene-transformation NIH 3T3、mouse sarcoma cells、human 293 kidney cancer cells、human heptacellular carcinoma Hep G2 cells）。³⁵

西元2001年發表於Biosci. Biotechnol Biochem的一篇文獻指出，莪朮根部含有

途逕，在處理過CZ-1及CZ-3的細胞中，在溶小體酵素活化作用中，從NO及TNF-α 的產生來評估多醣體增加免疫系統的活化作用。在病源菌中，巨噬細胞的角色就 是分泌很多的細胞激素，例如：介白素-1、介白素-6、介白素-8、介白素-12和TNF-α 等等..。和發炎調節者NO及H₂O₂，不過ROS的產生包含了O₂^-、H₂O₂是介由噬菌細 胞像是巨噬細胞在宿主內執行對抗微生物感染一個很重要的角色。³⁶

同年Hisaahi Matsuda等人也在Bioorganic

＆

Medicinal Chemistry上發表一篇文 章，從莪朮中找到3個具有保護肝臟且抗潰瘍的倍半萜烯類Carabrane type骨架的新 zederone、germacrone、curdione、β-elemene、curzeone(Yoshinori et al.,1985；Yoshinori

germacrone、curdine被用於處理肝發炎的作用(Hisashi et al.1998)，β-elemene在 6-keto-prostaglandin F₁α和thromboxane B₂的產生有抗血栓作用和抑制血栓作用 (Xie et al,1998)，而dehydrocurdione則具有抗發炎的活性(Yoshioka et al.,1998)。³⁸

同年發表於Planta Medica的一篇報告中指出，TNF-α可以活化巨噬細胞產生的 中間者之ㄧ，也是一種胜肽，在發炎反應及宿主防禦上佔有中樞的角色，TNF-α 刺激作用細胞抗菌及殺死腫瘤的活性，加強被感染細胞的存活率，引起一些腫瘤 細胞的退化。換句話說，大量TNF-α持續表現，會促成慢性和急性發炎狀態病理和 生理的改變，包含敗血性休克、類風濕、關節炎、多部位硬化症、AIDS。篩選TNF-α 作用的抑制劑，可能已經被證實對處理很多被提到過的病理狀態是有幫助的，這 些研究導致近年來的研究都在尋找到底哪些化合物可以抑制TNF-α的作用。而化合 物中像是bisphenylisoquinoline alkaloid,倍半萜烯內酯,新木脂素,薑黃素等等都能 抑制TNF-α的產生。³⁹

1.12 研究動機

在 18 世紀歐洲掀起第一波的工業革命後，大量的機器代替人力，造就人類 文明的快速進步與發展。但是這些發展也衍生許多環境上的問題，例如污染的產 生、能量與資源的浪費、對生態的衝擊、以及環境和氣候上的劇烈變化等等。因 此隨著綠色觀念的推廣、環保意識與永續生存發展概念的興起，「綠色化學」也成 了這波工業革命中的一個重要議題。何謂綠色化學？本論文中所設計的綠色化學 製程，其精神第一個是減少有機溶媒的使用及以替代有機溶媒的二氧化碳超臨界 流體的方式來萃取中草藥，以快速、簡易的萃取、方離方式進行中草藥內活性指 標成分的確定，而有別於一般的傳統分離。本實驗以薑科植物莪朮的根莖做為研 究的材料，以綠色化學的精神探求中草藥內的活性指標成分，實驗的設計是結合 二氧化碳超臨界萃取與薄板層析，盡量以最少的有機溶媒來萃取莪朮，並分離純 化出莪朮內活性指標成分，我們冀望以二氧化碳超臨界萃取的方式進行莪朮中低 極性的精油成分物質結構的研究，結合天然物化學設計出一套環保的綠色化學製 程。

1.13 過去文獻發表過之結構 1. Carabrane type

化合物名稱 基源/部位

H

O O

curcarabranol A

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

化合物名稱 基源/部位

H

O O

curcarabranol B

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

化合物名稱 基源/部位

O

H

curcumenone

Curcuma zedoaria / 地下莖^11,32

化合物名稱 基源/部位

O

O H

H O

Curcumenolactone A

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

化合物名稱 基源/部位

O

O H

O H

curcumenolactone B

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

化合物名稱 基源/部位

O

O OH

H O

curcumenolactone C

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

化合物名稱 基源/部位

OH O

4S-di hydrocurcumenone

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,32

2. Germacrane type

化合物名稱 基源/部位

O

OH

13-hydroxygermacrone (3)

Curcuma zedoaria / 地下莖^10,19,32

化合物名稱 基源/部位

O

O

curdione(15)

Curcuma zedoaria / 地下莖^12,19

化合物名稱 基源/部位

O

(+) 4,5-epoxyl-germarone

Curcuma zedoaria / 地下莖^13,32

化合物名稱 基源/部位

O

O O

zedorone

Curcuma zedoaria / 地下莖^14,19,32

化合物名稱 基源/部位

O

O

neocurdione

Curcuma zedoaria / 地下莖^15,19,32

化合物名稱 基源/部位

O

O

Glechomanolide

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁶

化合物名稱 基源/部位

O O

isofuranodienone

Curcuma zedoaria / 地下莖^16,32

化合物名稱 基源/部位

O

dehydrocurdione

Curcuma zedoaria / 地下莖^17,19,32

化合物名稱 基源/部位

R

germacrone

Curcuma zedoaria / 地下莖^18,19,32

化合物名稱 基源/部位

O

furanodiene

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,32

3. Guaiane type

化合物名稱 基源/部位

OH O

4-epicurcumenol

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁹

化合物名稱 基源/部位

OH O

neocurcumenol

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁹

化合物名稱 基源/部位

O O

gajustsulactone A

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁹

化合物名稱 基源/部位

O O

gajutsul actone B

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁹

化合物名稱 基源/部位

O OH

O OH

O

zedoar olide A

Curcuma zedoaria / 地下莖¹⁹

化合物名稱 基源/部位

O OH

OH

OH O

zedoarolide B

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,32

化合物名稱 基源/部位

O O

H

H

Curcumenol

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,20,32

化合物名稱 基源/部位

OH H

O

isocurcumenol(19)

Curcuma zedoaria / 地下莖^21,32

化合物名稱 基源/部位

O H

H

Procurcumenol

Curcuma zedoaria / 地下莖^22,32

化合物名稱 基源/部位

isoprocurcumenol

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,23,32

化合物名稱 基源/部位

OH

H OH

alismoxide(22)

Curcuma zedoaria / 地下莖^24,32

化合物名稱 基源/部位

H

O

H

O

7α,11-epoxyl-5-hydroxy-9-guaiaen-8-one

Curcuma zedoaria / 地下莖³²

化合物名稱 基源/部位

OH

OH H

aerugidiol

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,32

化合物名稱 基源/部位

OH

COOH

isozedoarondiol

Curcuma zedoaria / 地下莖^16,32

化合物名稱 基源/部位

O

O OH

OH

OH

zedoalactone B

Curcuma zedoaria / 地下莖^25,32

4. Bisaborane type

化合物名稱 基源/部位

O

(+)-ar-turmerone

Curcuma zedoaria / 地下莖^26,32

化合物名稱 基源/部位

OH

bisacumol

Curcuma zedoaria / 地下莖^27,32

化合物名稱 基源/部位

OH OH O

bisacurone

Curcuma zedoaria / 地下莖^28,32

5. Eudesmane type

化合物名稱 基源/部位

H OH

β-eudesmol

Curcuma zedoaria / 地下莖^29,32

化合物名稱 基源/部位

OH

H

β-diectyopterol

Curcuma zedoaria / 地下莖^29,32

6. Elemane type

化合物名稱 基源/部位

O

H O

curze renone

Curcuma zedoaria / 地下莖^30,32

7. Xanthane type

化合物名稱 基源/部位

O O

curcumadione

Curcuma zedoaria / 地下莖^30,31

8. Diarylheptanoids

化合物名稱 基源/部位

O O

H

HO

OCH₃

OH OCH₃

curcumin

Curcuma zedoaria / 地下莖^19,32

化合物名稱 基源/部位

Curcuma zedoaria / 地下莖^32,33

1.14 相關實驗部份

1.紅外線光譜儀(Infrared spectra，IR)：

以 Mattson Genesis II FT-IR spectrophotometer測定。

2.紫外線光譜儀（Ultraviolet spectra，UV）：

以JASCO V-530 UV/VIS spectrophotometer測定。

3.核磁共振儀（Nuclear Magnetic Resonance spectra，NMR）：

(a)高雄醫學大學：

Varian GEMINI 2000 200MHz FT-NMR Spectrometer Varian UNITY plus 400MHz FT-NMR Spectrometer Varian NMRs Brucker

(b)化學為移(Chemical shift)：

以δ值(part per million, ppm)表示。

(c)內部標準(Interal standard)：

CD₃OD、C₅D₅N、CDCl₃、D₂O、CD₃COCD₃。

(d)訊號表示：分別以s、d、t、q、m、dd、td、dt等縮寫，分別代表singlet、doublet、

triplet、quartet、multiplet、double doublet、triple doublet、double triplet。

4. 質譜儀(Mass spectrometer,MS)：

(a) Finnigan POLARISQ Mass spectrometer (ESI-MS,高雄醫學大學)。

(b) The Micromass Q-TOF^TM Ultima Mass spectrometer (MADLI-TOF-MS, 高雄醫學大學)。

5. 層析材料 (Chromatographic materials)：

(a) Silica gel：

(1) Silica gel Si 60 (40-63μm,Merck)。

(2) Geduran^R Si 60 (63-200μm ,Merck)。

(b) Sephadex LH-20 gel(25-100μm ,Pharmacia)。

(c) Celite^R 545 (20-100μm ,Merck)。

(d) Solid Phase Extraction(SPE)：

1.Normal phase：Bond Elut^R SI (40μm,Varian)。

R

(e)薄層層析片(TLC plate)：

(1)分析用TLC (Analytic TLC,Aluminium sheets)：

1.TLC Silica gel 60 F₂₅₄ (20 × 20cm,Merck)。

2.TLC Silica gel 60 RP-18 F₂₅₄ (20 × 20cm,Merck)。

(2)製備用TLC(Preparative TLC,Glass plate)。

1.TLC Silica gel 60 F₂₅₄ (20 × 20cm,Merck)。

6.TLC spots 之檢出：

(1) UV：短波 254 nm，長波 365 nm。

(2) 50% 硫酸噴霧後加熱呈色。

7.冷凍乾燥機(Freeze-Dryer)：

(1) Flexi-Dry^TM (FTS)。

第二章 材料與方法

開啟入口閥

(二)二氧化碳超臨界流體加入無水乙醇共同萃取： 300 bar extract

with ethanol (ZR6) 100 bar extract

with ethanol (ZR5)

圖 2-1 粉 碎 機 圖 2-2 莪朮根莖部

圖 2-4 莪朮粉末 圖 2-3 園藝小剪刀剪

2.2 二氧化碳超臨界流體萃取詳細步驟

實驗所使用的莪朮是從高雄縣燕巢鄉莊松榮藥廠經cGMP嚴格篩選之中藥 材，拿到材料時為黃色的根莖部塊狀物，之後將1公斤的莪朮取出並平舖於實 驗桌上，慢慢將大塊狀莪朮剪成5mm -10mm大小，然後慢慢放入高速旋轉的 磨碎機中，在磨碎同時慢慢加入液態氮以冷卻機器及莪朮，避免高溫破壞莪朮 內之有效成分，磨碎之黃色的莪朮粉末先經過充分均勻攪拌，然後慢慢裝入小 袋子中，每一袋之重量約為20公克，置於冷藏4℃冰箱備用。以上為二氧化碳 超臨界萃取之前置作業。

將置於4℃冰箱的莪朮取出慢慢回到室溫，此時將低溫循環機開啟達到3℃左 右，壓力調節機調至第一個萃取壓力(100bar)，同時也將萃取的溫度調至萃取溫度 之條件(40℃)，等待達到萃取溫度及壓力的同時，並檢查超臨界萃取儀的設備、

開關，看是否都有緊閉機器內外所有開關，只有將所有管路都關閉，才會達到萃

取的溫度及壓力，有時候無法達到超臨界萃取的條件原因如下：一、空氣或二氧

起，表示此時瓶子已達到飽和，隨時會撐破，非常危險，另一方面此超臨界萃取

份，溫度條件為40℃，此一條件也是萃取三次後，緩慢增加萃取壓力至ZR-6 (300bar

與抗凝血劑ACD(citric acid 71mM，sodium citric 85mM，dextrose 111mM)以8：6：

1.4(v/v)的比例混合，在室溫下離心(290 × g)15分鐘，取出上層富含血小板血漿 (Platelet-rich plasma，PRP)分注於離心管中(每管4-5ml)，加入PGE₁(0.5μM)後，

再離心(1181 ×g)15分鐘，去除血漿部分(PRP)，以含有BSA (3.5mg/ml)及glucose(5.56 mM)的Tyrode^，s sodium 將沉降的血小板沖散，加入ACD(200μl)及PGE₁(0.5μM)

再離心(1181 ×g)15分鐘，去除血漿部分(PRP)，以含有BSA (3.5mg/ml)及glucose(5.56 mM)的Tyrode^，s sodium 將沉降的血小板沖散，加入ACD(200μl)及PGE₁(0.5μM)

在文檔中 National University of Kaohsiung Repository System:Item 310360000Q/10474 (頁 25-0)