第二章 材料與方法
1.2 儀器︰
1、核磁共振光譜儀 (NMR)：本系 Bruker Avancetm DPX-200 MHz NMR。
所用之溶劑為氘溶劑(如 CDCl3，DMSO-d6 等)，而化學位移之校正是以 氘溶劑( CDCl3 )內的氫δ7.24 或以四甲基矽烷( TMS )δ0.00 為內標
位移是以 CDCl3δ77.00 為內標準。其多重性 ( multiplicity ) 是使用 DEPT (distortionless enhancement by polarization transter ) 脈衝的次序技 巧測定之。此外，氫光譜中符號s 表示單重峰 ( singlet )，d 表示雙重峰 ( doublet )，t 表示三重峰 ( triplet )，q 表示四重峰( quartet )，m 表示多 重峰 ( multiplet )，br 表示寬光譜，dd 表示雙重二重峰。碳光譜中符號 s 表示四級碳 ( C )，d 表示三級碳( CH )，t 表示二級碳( CH2 )，q 表示一 級碳( CH3 )。
2、萃取後的有機層溶液皆以無水硫酸鎂 ( MgSO4 ) 乾燥，並經減壓濃縮，
所得粗產物以矽膠 ( silica gel ) 填充的管柱層析( column chromat-
ography )或以再結晶方式純化。silica gel 是使用 Merck Geduran Si 60。
3、減壓濃縮機是使用 N-1NW、A-3S 型旋轉蒸發儀。
4、抽真空是使用 GVD-050A 回轉式真空幫浦。
5、熔點測定儀︰Melting point apparatus
6、霍式轉換紅外光光度計：Perkin elmer
7、傅利葉轉換式質譜儀︰Bruker APEX II，電噴灑游離源(ESI)
1.3 化合物的鑑定與合成︰
1-(6-Hydroxy-2,3,4-trimethoxy-phenyl)-ethanone (21)
將3,4,5-三甲氧基酚 (0.499 g, 2.71 mmol)於室溫下溶於三氟化硼 (1.71 mL) 在氮氣系統下攪拌，加熱至 80℃~85℃待起始物全溶再緩慢加入 乙醯氯(0.25mL，3.52 mmol)反應一個小時。將其降回室溫後加入蒸餾 水 (10 mL)後，再以乙酸乙酯(10 mL)萃取三次。混合的有機層以飽和 食塩水洗滌乾燥，經過濾，濃縮後由管柱層析法分離(沖提系統；乙酸 乙酯：正己烷=1：4)得黃色油狀化合物 21 ( 0.437 g；71％ )
MeO
MeO
OMe
OH MeO
MeO
OMe OH
O Ac
2O/BF
3.OEt
20 21
O
H
3C Cl
光譜資料︰21
IR (CHCl3,cm-1): 1634, 3425
1H NMR [ 200 M HZ﹐CDCl3 ] :
δ13.33 ( s, 1 H ), 6.13 ( s, 1 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.79 ( s, 3 H ), 3.69 ( s, 3 H ), 2.55 ( s, 3 H )
13C NMR (50 MHZ，CDCl3) :
δ 203.30 (s), 161.90 (s), 160.10 (s), 155.23 (s), 134.73 (s), 108.41 (s), 96.09 (t),60.95 (q), 56.04 (q), 31.86 (q)
HRMS︰calcd for C11H14O5 (M+ + H)︰227.0919, found 227.0921
3-(4-Benzyloxy-phenyl)-1-(6-hydroxy-2,3,4-trimethoxy-phenyl)-propenone (22)
將化合物 21 (1.656 g, 7.33 mol )以絶對乙醇( 16 mL )溶解，再加入 四丁氧基化鉀(potassium tert-butoxide) ( 1.64 g, 0.02 mmol )攪拌 3-5 分
鐘，再加入化合物4-苄氧基苯甲醛(4-benzyloxy-benzaldehyde) ( 1.709 g, 8.06 mmol )加熱迴流 3 小時。將其置於室溫先濃縮大部份的乙醇再加
光譜資料︰22 MP︰ 95~96 ℃
IR (KBr, cm-1): 1627, 3395
1H NMR [ 200 M HZ﹐CDCl3 ]︰
δ 13.67 ( s, 1 H ), 7.76 ( s, 2 H ), 7.43 ( d, J = 8.7 HZ, 2 H ), 7.35-7.18 ( m, 6 H ), 6.90 ( d, J = 8.7 HZ , 2 H ), 6.22 ( s, 1 H), 5.04 ( s, 2 H ), 3.85 ( s, 3 H ), 3.82 ( s, 3 H ), 3.76 ( s, 3 H )
13C NMR (50 MHZ﹐CDCl3)︰
δ 193.01(s), 162.83 (s), 160.91 (s), 160.15 (s),155.18 (s),143.46 (d), 136.67 (s), 135.50 (s), 130.41(d)*2, 128.85(d)*2, 128.56 (s), 128.34 (d), 127.64 (d)*2, 124.41 (d), 115.52 (d), 108.99 (s), 96.79 (d),70.32 (t), 62.07 (q), 61.46 (q), 56.25 (q)
HRMS︰calcd for C25H24O6 (M+ + H)︰421.1651, found 421.1653
2-(4-Benzyloxy-phenyl)-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (23)
將化合物 22 (1.137g, 2.71 mmol)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulphoxide)(8 mL)加入催化量的碘(iodine)，加熱迴流 1 小時後，放至室
溫冷卻後加入硫代硫酸鈉至顔色不再變色為止，冰浴析出。過濾，收
光譜資料︰23 MP. 158~160 ℃ IR (KBr, cm-1): 1615
1H NMR [ 200 M HZ，CDCl3 ]:
δ 7.78 ( d, J =8.8 HZ, 2 H ), 7.40-7.34 ( M, 5 H ), 7.04 ( d, J =8.9 HZ, 2 H ), 6.75 ( s, 1 H ), 6.54 ( s, 1 H ), 5.11 ( s, 2 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.94 ( s, 3 H ), 3.89 ( s, 3 H )
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.27 (s), 161.39 (s), 161.18 (s), 157.75 (s), 154.58 (s), 152.66 (s), 140.45 (s), 136.38 (s), 128.80 (d)*2, 128.33 (d), 127.74 (d) *2, 127.57 (d)
*2, 124.18 (d), 115.38 (d) *2, 112.96 (s), 107.17 (s), 96.39 (d), 70.30 (t), 62.29 (q), 61.62 (q), 56.38 (q)
HRMS︰calcd for C25H22O6 (M+ + H)︰419.1495, found 419.1492
2-(4-Hydroxy-phenyl)-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (24)
將化合物 23 ( 0.986 g，2.36 mmol )加入濃塩酸與醋酸比例為 1：3 溶
液中( 36 mL )加熱至 70℃反應 1.5 小時之後放置室溫，倒入冰水中冰浴 析出。過濾，收集固體，由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正 己烷=1：1)得淡黃色固體 24 ( 0.85 g, 86％ )
MeO MeO
OMe O
OH
O HCl:AcOH
24 MeO
MeO
OMe O
OBn
O 23
光譜資料︰24 MP. 232~235 ℃
IR (KBr, cm-1): 1630, 3395
1H NMR [ 200 M HZ，DMSO]:
δ7.89 ( d, J =8.7 HZ, 2 H ),δ7.16 ( s, 1 H ),δ 6.90 ( d, J =8.7 HZ, 2 H ), δ6.60 ( s, 1 H ), δ3.93 ( s, 3 H ), δ3.79 ( s, 3 H ),δ3.75 ( s, 3 H )
13C NMR (50 MHZ，DMSO) :
δ 175.66 (s), 160.74 (s), 157.37 (s), 153.91 (s), 151.59 (s), 139.74 (s), 127.92 (d), 121.34 (s), 115.89 (d), 112.01 (s), 105.44 (d), 97.25 (d), 61.85 (q), 60.99 (q), 56.42 (q)
HRMS︰calcd for C18H16O6 (M+ + H)︰329.1025, found 329.1027
2-[4-(2-Hydroxy-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (25)
將化合物 24 ( 0.228 g，6.95 mmol) 溶於二甲基亞碸 (5 mL )再加 入碳酸鉀(potassium carbonat)( 0.192 g, 1.40 mmol )攪拌 3 至 5 分鐘之後 再加入2-溴乙醇(2-bromoethanol)( 0.173 ml, 2.43 mmol )加熱至 60℃
反應24 小時後加入蒸餾水( 5 mL ) 乙酸乙酯 ( 10 mL)萃取三次，混合
光譜資料︰25 MP.156~159 ℃
IR (KBr, cm-1): 1627, 3350, 3455
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ] :
δ 7.78 ( d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.99 ( d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.76 ( s, 1 H), 6.54 ( s, 1 H), 4.14 ( t, J = 4.2 Hz, 2 H), 3.99-3.95 ( m, 8 H), 3.89 ( s, 3 H)
13C NMR (50 MHZ，CDCl3)
δ 177.45 (s), 161.46 (s), 161.27 (s), 157.88 (s), 154.66 (s), 152.72 (s), 140.54 (s), 127.83 (d), 124.32 (s), 115.14 (d), 112.99 (s), 107.23 (d), 96.43 (d), 69.72 (t), 62.35 (q), 61.69 (q), 61.40 (t), 56.46 (q)
HRMS︰calcd for C20H20O7 (M+ + H)︰373.1287, found 373.1287
2-[4-(2-Chloro-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (26)
將化合物 25 ( 0.49 g，1.07 mmol )溶於三氯甲烷(chloroform)與二 甲基甲醯胺(n,n-dimethylformamide)比例為 10：1 溶液中( 44 mL )在冰 浴0℃下加入亞硫醯氯(thionyl chloride) ( 0.5 mL, 6.45 mmol )之後移除 冰浴，加熱至 40℃反應 3 小時後，加入碳酸氫鈉飽和水溶液，至不再
光譜資料︰26 MP. 163~164℃
IR (KBr, cm-1): 1649, 3440
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ 7.82 ( d, J = 9.2 HZ , 2 H ), 7.01 ( d, J = 8.9 HZ , 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.56 ( s, 1 H ), 4.29 ( t, J = 5.8 HZ , 2 H ), 3.97 ( s, 3 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.89 ( t, J = 5.8 HZ, 2 H )
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.25 (s), 161.03 (s), 160.84 (s), 157.83 (s), 154.62 (s), 152.72 (s), 140.53 (s), 127.84 (d), 124.76 (s), 115.18 (d), 113.04 (s), 107.40 (d), 96.43 (d), 68.31 (t), 62.32 (q), 61.65 (q), 56.43 (q), 41.82 (t)
HRMS︰calcd for C20H19ClO6 (M+ + H)︰391.0948, found 391.0946
2-[4-(2-Azido-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (27)
光譜資料︰27 MP. 140~142 ℃
IR (KBr, cm-1): 1641, 2111, 3395
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ7.88 ( d, J = 8.7 HZ , 2 H ), 7.01 ( d, J = 8.8 HZ , 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.57 ( s, 1 H ), 4.21 ( t, J = 4.9 HZ, 2 H ), 3.97 ( s, 3 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.63 ( t, J = 4.8 HZ, 2 H )
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.29 (s), 161.07 (s), 160.85 (s), 157.84 (s), 154.63 (s), 152.72 (s), 140.53 (s), 127.85 (d), 124.74 (s), 115.12 (d), 113.02 (s), 107.40 (d), 96.43 (d), 67.30 (t), 62.33 (q), 61.66 (q), 56.43 (q), 50.23 (t)
HRMS︰calcd for C20H19N3O6 (M+ + H)︰398.1352, found 398.1353
2-[4-(2-Amino-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (28)
將化合物27 ( 0.084 g，0.21 mmol )溶於四氫呋喃(tetrahydrofuran)( 2 mL)中加入三苯膦(triphenylphosphine)( 0.056 g, 0.21 mmol )攪拌 1.5 小 時，加入蒸餾水0.2 mL 後反應 16 小時後，加入蒸餾水(5 mL) 乙酸乙
光譜資料︰28 MP. 198~199℃
IR (KBr, cm-1): 1671, 3447
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ7.80 (d, J = 9.1 HZ, 2 H), 6.97 (d, J = 9.1 HZ, 2 H ), 6.77 (s, 1 H), 6.55 (s, 1 H), 4.10 (t, J = 5.0 HZ, 2 H), 3.97 (s, 3 H), 3.96 (s, 3 H), 3.80 (s, 3 H), 3.67 (t, J = 5.2 HZ, 2 H)
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.83 (s), 161.66 (s), 161.47 (s), 158.05 (s), 154.63 (s), 152.55 (s), 140.61 (s), 127.73 (d), 123.73 (s), 115.00 (d), 112.81 (s), 106.95 (d), 96.51 (d), 68.33 (t), 62.38 (q), 61.73 (q), 56.53 (q), 39.79 (t)
2-[4-(3- Hydroxy -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (29)
將化合物 24 ( 0.51 g，1.55 mmol )溶於二甲基亞碸(15 mL)再加入 碳酸鉀 ( 0.431g, 3.12 mmol )攪拌 3 至 5 分鐘之後再加入 3-氯-1-丙醇 (3-chloro-1-propanol) (0.455 mL, 5.44 mmol)加熱至 60℃反應 24 小時後 加入蒸餾水 (10 ml)乙酸乙酯 (20 mL)萃取三次，混合的有機層經飽和
光譜資料︰29 MP. 132~135 ℃
IR (KBr, cm-1): 1643, 3291
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ 7.80 ( d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.00 ( d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.77 ( s, 1 H), 6.56 ( s, 1 H), 4.18 ( t, J = 6.0 Hz, 2 H), δ3.97 ( d, 6 H),δ3.90~3.83 ( m, 5 H ), 2.07 ( t, J = 5.9 Hz, 2 H)
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.47 (s), 161.67 (s), 161.36 (s), 157.84 (s), 154.64 (s), 152.68 (s), 140.39 (s), 127.77 (d), 123.91 (s), 115.03 (d), 112.95 (s), 107.06 (d), 96.43 (d), 65.71 (t), 62.35 (q), 61.70 (q), 59.83 (t), 56.46 (q), 32.15 (t)
HRMS︰calcd for C21H22O7 (M+ + H)︰387.1444, found 387.1443
2-[4-(3- Chloro -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (30)
光譜資料︰30 MP. 152~154℃
IR (KBr, cm-1): 1645, 3432
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ7.81 ( d, J = 8.8 HZ, 2 H ), 6.99 ( d, J = 9.1 HZ, 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.56 ( s, 1 H ), 4.19 ( t, J = 5.8 HZ, 2 H ), 3.97 ( s, 6 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.75 ( t,
J = 6.1 H
Z, 2 H ), 2.32-2.23 ( m, 2 H )13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.31 (s), 161.43 (s), 161.22 (s), 157.82 (s), 154.66 (s), 152.77 (s), 140.54 (s), 127.83 (d), 124.31 (s), 115.08 (d), 113.37 (s), 107.31 (d), 96.44 (d), 64.74 (t), 62.34 (q), 61.68 (q), 56.44 (q), 41.44 (t), 32.28 (t)
HRMS︰calcd for C21H21ClO6 (M+ + H)︰405.1105, found 405.1104
2-[4-(3- Azido -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (31)
將化合物 30 ( 0.287 g，0.71 mmol )溶於二甲基甲醯胺 (5 mL )中加 入疊氮化鈉 ( 0.120 g, 1.85 mmol )攪拌，加熱至 65℃反應 24 小時之後，
冰浴析出，過濾，收集的粗產物經由管柱層析法分離(沖提系統；乙酸 乙酯：正己烷=1：2)得白色固體 31 ( 0.277 g, 95％)
MeO
MeO
OMe O
O
O N3
31 MeO
MeO
OMe O
O
O Cl
30
NaN3 DMF
光譜資料︰31 MP. 107~108 ℃
IR (KBr, cm-1): 1623, 2097, 3425
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ 7.81 (d, J = 8.9 HZ, 2 H), 6.98 (d, J = 8.8HZ, 2 H ), 6.78 (s, 1 H), 6.56 (s, 1 H), 4.12 (t, J = 5.9 HZ, 2 H), 3.97 (s, 6 H), 3.96 (s, 3 H), 3.90 (t, J = 6.5 HZ, 2 H), 2.08 (t, J= 6.3 HZ, 2 H)
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.34 (s), 161.35 (s), 161.22 (s), 157.80 (s), 154.64 (s), 152.72 (s), 140.50 (s), 127.82 (d), 124.27 (s), 115.02 (d), 113.02 (s), 107.26 (d), 96.41 (d), 64.94 (t), 62.33 (q), 61.68 (q), 56.43 (q), 48.28 (t), 28.84 (t)
HRMS︰calcd for C21H21N3O6 (M+ + H)︰412.1509, found 412.1506
2-[4-(3- Amino -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (32)
光譜資料︰32 MP. 144~148 ℃
IR (KBr, cm-1): 1630, 3388
1H NMR [ 200 M HZ；CDCl3 ]:
δ 7.78 (d, J = 8.8 HZ, 2 H), 6.97 (d, J = 9.0 HZ, 2 H ), 6.76 (s, 1 H), 6.54 (s, 1 H), 4.10 (t, J = 6.3 HZ, 2 H), 3.96 (s, 6 H), 3.95 (s, 3 H), 3.88 (s, 3 H), 2.91 (t, J = 6.6 HZ, 2 H), 1.93 (t, J = 6.5 HZ, 2 H)
13C NMR (50 MHZ，CDCl3):
δ 177.25 (s), 161.65 (s), 161.23 (s), 157.70 (s), 154.54 (s), 152.60 (s), 140.39 (s), 127.67 (d), 123.79 (s), 114.94 (d), 112.90 (s), 107.01 (d), 96.37 (d), 66.20 (t), 62.24 (q), 61.58 (q), 56.36 (q), 39.10 (t), 32.88 (t)
HRMS︰calcd for C21H23NO6 (M+ + H)︰386.1604, found 386.1402
二、生物活性測試 2-1 抗氧化試驗 2-1.1 藥品
(1) α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (TCI，Japan)
(2) 2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt ) (TCI，Japan)
(3) 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic Acid (Acros ， U.S.A)
(4) Peroxidase (景明，Taiwan)
(5) beta-Nicotinamide adenine dinucleotis, disodium salt hydrate(Acros，
U.S.A)
(6) Phenazine methosulfate (Acros，U.S.A) (7) Nitro blue tetraolium (島久，Japan) (8) Trichloroacetic acid (Merck，Germany) (9) 2-Thiobarbituric acid (Merck，Germany) (10) Iron(III) chloride (Merck，Germany) (11) L-Ascorbic Acid (Sigma)
(12) L-Tyrosine (Acros，U.S.A)
2-1.2 儀器
(1) Electron Corporation (MULTISKAN EX) 2-1.3 實驗步驟
2-1.3.1. 清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力︰(16,17) 油脂在自氧化過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見的抗氧化
物藉由提供氫(hydrogen doner)來清除脂質過氧化物自由基(peroxyl radical)，進而達到抑制氧化鏈鎖反應，在抗氧化的研究上通常使用 DPPH 來評估抗氧化的供氫能力。
(1) 藥品配製︰
a. DPPH 1mM︰取 39 mg α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl 用甲醇定量 至 100 mL
b. Trolox 10 mg/mL︰取 10 mg 的 trolox 加 1 mL 去離子水混均勻 (2) 樣品處理︰
取 2 mg 的樣品加入 1mL 的 95％乙醇，濃度為 2 mg/mL，混合均 勻使樣品呈澄清狀態的測試液。
(3) 實驗步驟︰
在 96 槽的微量平盤中加入濃度為 2 mg/mL 體積分別為 2.5μL、5 μL、10μL、20μL 和 40μL 的試驗樣品溶液，再加入 95％乙醇體積
80μL 新鮮配製的 DPPH 甲醇溶液(1 mM)，使最後總體積為 200μL，
在同一盤 96 槽的微量平盤中加入一槽 trolox 1μL(10 mg/mL)、去離子 水 119μL 和 80μL DPPH 甲醇溶液(1 mM)做為對照組，再做一槽控制 組為 95％乙醇 120μL 和 80μL DPPH 甲醇溶液(1 mM)，最後於室溫下 避光振盪 30 分鐘混合均勻後，使用 ELISA Reader 檢測 550 nm 之吸光 值。
2-1.3.2. Trolox 當 量 的 抗 氧 化 能 力 (Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)(18,19)
ABTS (2,2-azino-bis-[3-ethylben thiazoline sulfonic acid])與 peroxidase (metmyoglolin)及 H2O2反應，會產生ABTS‧+陽離子自由基。此為一相 當穩定藍綠色物質，抗氧化劑的加入會抑制此顏色的產生，因此吸光 值愈低，抗氧化效果愈佳。
(1) 藥品配製︰
a. Peroxidase 44 unit/ mL︰從母液 1000 unit/mg 取 5 mg 加入 1mL 二次水配製 5000 unit/ mL(5 unit/μL)的 peroxidase 再加入 1190 μL 的 PBS 至濃度為 44 unit/ mL
b. H2O2 500μM︰取 8.8 M H2O2 10μL 加入 870μL 的二次水配製
為 500μM。
c. ABTS 1000μM 2,2-azino-bis-[3-ethylbenthiazoline sulfonic acid]
Mw:548.7(二次水定量):取 0.66 mg ABTS 加入 1.2 mL 二次水配 製濃度 1000μM。
d. Trolox 10 mg/mL : 取 10 mg 的 trolox 加 1mL 二次水混合均勻。
(2) 實驗步驟︰
取 1.2 mL peroxidase、1.2 mL H2O2溶液，1.2 mL ABTS 以及 7.2 mL
去離子水混合均勻，暗室中反應1 小時，反應完成後產生安定藍綠色之
ABTS‧+ 陽離子自由基。
準備一個 96 槽的微量平盤，加入濃度為 2 mg/mL 體積為 2.5μL、
5μL、10μL、20μL 和 40μL 的樣品，再加入 95％乙醇體積分別為 97.5μL、95μL、90μL、80μL 和 60μL，之後迅速加入 100μL 的 ABTS‧，最後總體積為 200μL，在同一盤 96 槽的微量平盤中加入一 槽 trolox 1μL(10 mg/mL)、95％乙醇 99μL 和 100μL 的 ABTS‧做為 對照組，再做一槽控制組為 95％乙醇 100μL 和 100μL 的 ABTS‧，
將 96 槽的微量平盤放在震盪器上震 10 分鐘混合均勻後，使用 ELISA Reader 檢測 620 nm 之吸光值。
2-1.3.3. 抑制 liposome脂質過氧化試驗(20,21)
利用TBA (thiobarbituric acid)之呈色法(測定540 nm之吸光值)來測
定脂質過氧化之產物(malondialdehyde, MDA)。
實驗步驟︰
準備 1mL 的微量離心管，取濃度為 1 mg/mL 體積為 9μL、18.75 μL、37.5μL、75μL 和 150 μL 的樣品，再加入體積分別為 116 μL、106.25μL、87.5μL、50μL 磷酸緩衝液 ( pH 7.4 )，之後 加入 125μL 的 liposome 溶液，再加入 125μL 的 L-ascorbic acid 溶液及 125μL 的 FeCl3溶液，以震盪器混合均勻後，放入 37°C 烘 箱培養1小時。震盪混合均勻後，再加入250μL 之TCA-TBA-HC
混合，於60°C加熱1小時至反應液呈粉紅色。冷卻後取1 mL於試管 離心2000 rpm，10分鐘後取上清液200 µL至96微量盤以ELISA 540
nm 之吸光值。
2-1.3.4. 清除率的計算方式︰
樣品的清除率%=(1-樣品值/控制組)*100
2-2 酪胺酸酶抑制(22,23,24) 2-2.1 實驗步驟
(1) 藥品配製：
a.酪胺酸酶原液與稀釋液配置
準備一個 1.5 mL 的微量離心管，加入濃度為 1mg/mL 體積為 600µL 的樣品，取200µL、150µL、100µL、60µL、20µL 的樣品，都加入 100µL 的 DMSO 和 PBS 緩衝溶液體積分別為 785µL、735µL、785Μl、825µL、
865µL，之後迅速加入 10µL 的酪胺酸酶 (75 unit)，最後總體積為 1000µL。用 300µL 的 DMSO 加 685µL 的 PBS 緩衝溶液再加入 15µL 酪 胺酸酶及 100µL 的 DMSO 加 900µL 的 PBS 緩衝溶液當空白組，皆震
盪混合均勻，放入 37℃恆溫培養箱一小時(加速反應)，之後分別取
100µL 至 96 槽的微量平盤中，使用 ELISA Reader 檢測 450 nm 之吸光 值。
(2) 抑制率的計算方式︰
樣品的抑制率%= (1-樣品值-空白組/控制組-空白組)*100
2-3 黑色素細胞毒性試驗(25,26,27) 2-3.1 材料
(1) 黑色素細胞 B16-F0 秀琴老師實驗室
(2) 培養液 DMEM Hyclone：SH30003.01
(3) 胎牛血清(去補體) Gibico Cat. No：26140-079 Hyclone Cat. No：SH30070.03 (4) 抗生素 penicillin G、amphotericin、streptomycin
Hyclone Cat. No：SV30079.01 (5) MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) Sigma M5655-500MG
2-3.2 實驗步驟
第一天無菌操作：
細胞準備：
1. 取出已經長8 分滿的 B16-F0 燒瓶，用 10mL 滴管取出黑色培養液到 加入漂白水的廢液桶，再加入10mL PBS 沖洗細胞 1 次吸取到廢液 桶，加入1mL trypsin 到 25T 燒瓶(2mL trypsin for 75T 燒瓶)，反應 3-5 分鐘，用手輕拍燒瓶將細胞打下來，之後加入 5mL DMEM 培 養液中止反應，移到離心管，離心 (1200 rpm，5min)，倒掉上清液，
血清)，將細胞分散均勻。
2. 用微量吸管取出20 µL 細胞，加上 20 µL Trypan Blue (0.04%) 染色 放入細胞計數器。
3. 在顯微鏡下計數活與死的細胞數，細胞存活率須大於85%，以 DMEM 完整的培養液調整細胞濃度為 1 x 105cells/mL。
4. 將100 µL (5 x 105 cells/mL)的 B16-F0 細胞種在 96 槽的微量平盤(1 x 104cells/well)，在 37℃含 5％的二氧化碳培養箱隔夜培養。
第二天無菌操作
1. 24 小時培養後，加入 100 µL 樣品 (共 9 種水抽樣品，5 個濃度：0.4 mg/mL，0.2 mg/mL，0.1mg/mL，0.05 mg/mL， 0.025mg/mL) 在 96
槽的微量平盤混合均勻，在 37℃含 5％的二氧化碳培養箱隔夜培養 (24 小時)。
第三天無菌操作
1. 24 小時後，將培養液吸掉，用 PBS 沖洗 1 次，再加入含 MTT 新鮮 培養液(0.5mg/mL)，100µL，置於 37℃含 5％的二氧化碳培養箱反
應 3 小時。
2. 3 小時後，吸出培養液，加入 100µL 二甲基亞碸將藍紫色結晶溶出 均勻後，用ELISA 測吸光值。
第三章 結果與討論 3-1 有機合成結果
三甲氧基酚在實驗室之前曾嘗試用起始物在醋酸酐溶液中，先後進行
酯化反應和 Friedel-Craft acylation 再以鹼性水溶液水解酯鍵，而得到化合物 21；在本實驗中以 BF3‧OEt2 當溶劑當試劑，再以乙醯氯做親核性加成 (Nucleophilic addition)進而得到化合物 21 (71%)。
將化合物 21 和 4-苄氧基苯甲醛在鹼性的乙醇溶液中進行醛醇縮合
(Aldol condensation)反應，得到化合物 22 (93.6%)， 接著將化合物 22 溶於 二甲基亞碸為溶劑，以碘為催化劑，在加熱迴流的反應條件下，得到化合 物 23 (71%)。將化合物 23 在酸性條件下去 benzyl 保護，使得-OBn 水解成 -OH 取代基，得到化合物 24 (85%)。
再將化合物 24 為本實驗的衍生物的起始物，針對 B 環上 C4’的位置進
行兩個系列的取代反應。將化合物24 以二甲基亞碸為溶劑，在鹼性條件下
加入 2-溴乙醇進行取代反應，得到化合物 25 (62%)， 而化合物 29 (89%) 也在相同的鹼性反應中，加入 3-氯-1-丙醇在化合物 24 的 B 環 C4’位置進行。
化合物 25 在三氯甲烷與二甲基甲醯胺比例 10：1 溶液的環境下加入亞 硫醯氯來進行置換反應，將羥基置換成氯，得化合物 26 (92%)，而化合物 30 (88%) 也以相同條件反應。
MeO MeO
OMe O
OR
O
氯離子是好的離去基，故此取代反應是很好進行的。得化合物 27 (95%)， 而 化合物 31 (95%)也以相同條件反應進行之。
化合物 27 以四氫呋喃為溶劑加入三苯膦和水還原疊氮分子為胺分子，
得化合物 28 (35%)，而化合物 32 (45%)也以相同條件反應進行之。在這個 反應中，也曾用氫化反應來還原，但反應效果不佳。
表一︰各類黃酮衍生物的產率及熔點
3-2 抗氧化結果
3-2.1 清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力︰
DPPH 是一種安定的自由基，而掃除此自由基可用來鑑定供氫的能
力。此研究的樣品，我們以五個濃度 0.025mg/mL、0.050 mg/mL、0.1 mg/mL 、0.2 mg/mL 和 0.4 mg/mL 的濃度來做此測試。在這測試中我們發 現，九個樣品對於清除 DPPH 這安定自由基的效果遠不如 trolox(0.050 mg/mL)掃除自由基的能力。由此結果可推論這九個樣品在結構上羥基的數 目不多，所以能提供氫的能力就比不上 trolox。
N N O2N
O2N
NO2
DPPH
表二︰化合物24 到 32 對清除 DPPH 自由基的能力
化合物29 至 32 對 DPPH 自由基清除率