嘉南藥理科技大學 藥物科技研究所 碩士論文

嘉南藥理科技大學 藥物科技研究所

碩士論文

類黃酮的合成方法與藥理測試

Synthetic Studies and Pharmacy Testing of Flavonoids

指導老師：戴火木 博士 研 究 生：呂葳婕

嘉南藥理科技大學藥物科技研究所 Graduate Institute of Pharmaceutical Science Chia-Nan University of Pharmacy and Science

碩士論文

Thesis for the Degree of Master

類黃酮的合成方法與藥理測試

Synthetic Studies and Pharmacy Testing of Flavonoids

指導教授︰戴火木 博士( Dr. Huo-Mu Tai ) 研究生︰呂葳婕( Wei-Chieh Lu)

中華民國九十六年七月十一日

2007 月 7 月 11 日

摘要

在這份研究中，我們用以3,4,5-三甲氧基酚為起始物合成5,6,7-三甲氧基 類黃酮的衍生物。而這些合成的類黃酮以清除1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力、trolox 當量的抗氧化能力、抑制 liposome脂質過氧化 試驗來評估這些化合物的抗氧化能力和抑制酪胺酶試驗來評估美白的效 果。也以MTT毒性試驗來作類黃酮衍生物對B16-F0黑色素細胞的毒性。結 果顯示出合成的類黃酮衍生物在清除DPPH自由基和脂質過氧化試驗中，抗 氧化的能力皆很弱。在trolox 當量的抗氧化試驗中，化合物24在濃度為0.20 mg/ml時，清除率達79.9 %；化合物28在濃度為0.40 mg/ml時，清除率達76.86

%。在酪胺酸酶抑制中，化合物25、27及28在高濃度(0.20 mg/ml)下的抑制 率在35%~40%左右。在毒性試驗中B環上的C₄’位置接兩個碳的取代系列相 對上比接三個碳的取代系列對黑色素細胞還不具有毒性上的傷害。

關鍵字：類黃酮、抗氧化

Abstract

In this report, 5,6,7-trimethoxy flavonoids derivatives were synthesized starting from 3,4,5-trimethoxyphenol. The synthesized flavonoids were also experiment for their antioxidant activities, evaluated using assays of 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH), trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and inhibit liposome peroxidation methods. And they were also evaluated using assays of inhibit tyrosinase for skin-lightening. In the other, thery were experiments using the MTT assay to measure the effects of flavonoisd on cell cytotoxicity. In 1,1-diphenyl-2-picryl-Hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and inhibit liposome peroxidation methods, which free radical scavenging activity were very weak. In TEAC assay, compound 24、28 present more then 75% scavenging activity when the sample concentration were at 0.20 mg/mL and 0.40 mg/mL. In inhibit tyrosinase test, the inhibition activity of compound 25、27 and 28 were between 35% to 40% when the sample concentration were 0.20 mg/ml. In MTT assay demonstrated that the toxicity of three carbon more then two carbon substitute for B-ring of C’₄ position on the flavonoidsderivatives.

致謝

首先必須感謝指導教授戴火木老師給我進實驗室的機會及在碩士班求 學期間的照顧與指導，讓我獲益良多，僅在此獻上最誠摯的感謝。同時也 要感謝口試委員呂玉玲老師，孫佩佩老師審核論文與寶貴意見，使本論文 更加充實完備，在此獻上最深的感謝。再則要感謝黃秀琴老師、黃明星老 師、何文岳老師，林敬涵老師在活性實驗上的幫忙及合成上的見意。以及 劉常興老師和施佩禎老師在我低潮時鼓勵我。同時也要謝謝李美璇同學，

潘雅卿同學在毒性及活性實驗上的指導和幫忙。

此外還要感謝實驗室的伙伴，包括良義同學，藝文學妹，英芳學妹，

建宏學弟及一些新進的學弟妹們。謝謝你們在實驗室的幫忙和陪伴讓我在 實驗室過得很愉快。

最後要感謝我的家人，感謝父母親和弟弟無條件的支持與付出，並給 我最大的關懷與溫暖﹔也感謝我的碩士班同學和我的室友對我的照顧與鼓 勵，讓我能順利完成碩士學位。 謝謝你們大家﹗

目錄

中文摘要………...I 英文摘要………..II 誌謝……….III 表目錄………VII 圖目錄………..VIII

第一章 緒論………..……….…1

一. 研究動機……….……1

二. 文獻回顧……….2

2.1 類黃酮的結構……….……….2.

2-2 類黃酮的生物活性………..3

2-2.1 類黃酮的吸收與代謝………...3

2-2.2 類黃酮的生物活性………...5

2-3 類黃酮的成環方法及相關合成法………..6

三、研究目的……….8

第二章 材料與方法……….………...………...…11

一、合成實驗………11

1-1 藥品……….………11

1-3 化合物的鑑定與合成……….…14

二、生物活性測試……….…..38

2-1 抗氧化試驗………38

2-1.1 藥品……….……….38

2-1.2 儀器...38

2-1.3.1. 清除 DPPH 自由基能力……….39

2-1.3.2. Trolox 當量的抗氧化能力……… 40

2-1.3.3. 抑制 liposome 脂質過氧化試驗………42

2-1.3.4. 清除率的計算方式……….42

2-2 酪胺酸酶抑制……….43

2-3 黑色素細胞毒性試驗………44

第三章 結果………...46

3-2.1 清除 DPPH 自由基能力……….48

3-2.2 Trolox 當量的抗氧化能力……….51

3-2.3 抑制 liposome 脂質過氧化試驗……….54

3-3 酪胺酸酶抑制結果………57

3-4 黑色素細胞的毒性試驗結果………60

第四章 結論………63

第六章 參考文獻……….65 附錄 化合物光譜圖

表目錄

表一︰各類黃酮衍生物的產率及熔點……….47

表二︰化合物24 到 32 對清除 DPPH 自由基的能力………49

表三︰化合物24 到 32 對清除 TEAC 自由基的能力………..52

表四︰化合物24 到 32 對抑制脂質過氧化的能力………..55

表五︰化合物24 到 32 對酪胺酸酶抑制的能力………..58

表六︰化合物24 至 32 對黑色素細胞的毒性試驗結果………..61

圖目錄

圖一︰類黃酮的基本結構………..2

圖二︰類黃酮的分類與結構………..2

圖三︰多酚類的吸收與代謝過程………..4

圖四︰類黃酮成環方法(一)………...6

圖五︰類黃酮成環方法(二)………...7

圖六︰類黃酮成環方法(三)………...8

圖七︰類黃酮的逆合成(一)………...9

圖八︰類黃酮的逆合成(二)………..10

圖九︰化合物24 至 28 對 DPPH 自由基清除率...50

圖十︰化合物29 至 32 對 DPPH 自由基清除率………....50

圖十一︰化合物24 至 28 對 TEAC 自由基清除率...53

圖十二︰化合物29 至 32 對 TEAC 自由基清除率………....53

圖十三︰化合物24 至 28 抑制脂質過氧化的能力………56

圖十四︰化合物29 至 32 抑制脂質過氧化的能力………56

圖十五︰黑色素的合成………57

圖十六︰化合物24 至 28 對酪胺酸酶抑制的能力………....59

圖十七︰化合物29 至 32 對酪胺酸酶抑制的能力………59

圖十八︰化合物24 至 28 對黑色素細胞 B16-F0 之毒性試驗………..62 圖十九︰化合物29 至 32 對黑色素細胞 B16-F0 之毒性試驗………..62

第一章 緒論 一、研究動機：

類黃酮源自植物和日常生活中的飲食當中。近年來許多學者專家研究

類黃酮(flavonoids

)

(1)但因類黃酮是植物的二次代謝產物，故人體內無法自行合成；一般都是由

植物萃取而得來的，但因萃取的產量低。也因此其商業上的價格亦不便宜，

所以希望能以合成的方式來有效率的製得與植物不同且具有生理活性的類 黃酮化合物，並研究其抗氧化的活性。

O

O A

B C

1 2

3 4 5

6 7

8 9

10

1' 2'

6' 5' 4' 3'

1

2-1 類黃酮的結構︰

類黃酮為存在於植物當中的生物鹼。其結構由二個苯環(A 和 B 環) 中 間 以 一 個 三 碳 含 氧 六 員 雜 環(C 環 ) 相 銜 接 而 構 成 了 2- 苯 基 色 原 酮 (2-phenyl-chromone；2-phenylbenzopyrone)骨架的化合物，⁽²⁾如圖一所示。

圖一︰類黃酮的基本結構

類黃酮可依 C 環的結構變化及 B 環在 C 環上取代位置之不同分類 為︰黃酮類(flavones)，黃酮醇( flavonols)，黃烷酮類(flavanones)，黃烷酮醇 類(flavanols)，異黃酮類(isoflavones)等這五大類，⁽³⁾如圖二所示。

O

O

A C

B

R₆ R₅ R₇

R₄' R₃'

Flavones

O

O

A C

B

R₅ R₇

R₄' R₃'

R₅' OH

Flavonols

O

O

A C

B

R₅ R₇

R₄' R₃'

R₃

Flavanones

( 2 ) ( 3 ) ( 4 )

圖二︰類黃酮的分類與結構

因類黃酮生物活性和藥理活性的影響取決於當此化合物是抗氧化物或 是過氧化物的狀態，因此了解它的抗氧化和過氧化行為及它活性結構關係 是非常必要的⁽¹⁾。

針對結構與其抗氧化作探討，Crawford 等人⁽⁴⁾發現類黃酮的結構上的羥 基若有一個或多個甲基所取代，或是在 C₂、C₃雙鍵位置上進行氫化作用則 其抗氧化能力的下降。同樣 Siess 與 Vernevaut⁽⁵⁾認為在 C₅、C₇、C₄^’位置上 有羥基的類黃酮，或其在C 環位置 C₃上有羥基，則加強其抗氧化力。另外 Das 與 Pereira⁽⁶⁾比較過不同結構的類黃酮，指出黃酮醇是具有最好的抗氧化 能力，而抗氧化能力來自B 環上的羥基。

2-2 類黃酮的生物活性︰

2-2.1 類黃酮的吸收與代謝

O

A C

B

R₅ R₇

R₄' R₃'

OH

Flavanols

O

R₅ R₇

O R₄'

A C

B

Isoflavones ( 6 ) ( 5 )

類黃酮是天然的多酚化合物，在人類的飲食比例中是一天平均 23 毫克 的量。⁽³⁾由植物中萃取出來的類黃酮，一般在結構上主要在 C₃的位置，或 其 次 在 C₇ 的 位 置 上 有 糖 取 代 基 ， 也 因 此 此 類 化 合 物 較 具 親 水 性 (hydrophilic)，⁽²⁾在人體中就不易通過細胞膜而被吸收。在小腸的細胞膜上 會有 SGLT-1(sodium-dependent sugar transporter-1)蛋白，以主動運輸的方式 將含糖的多酚類物質送入上皮細胞內，再被 CBG( cytosolic ß-glucosidase) 酵素水解﹔另一種方式是與膜上的 LPH(lactase phlorizin hydrolase)蛋白作 用，而多酚類物質與糖分開後其親酯性(hydrophobic)增加，再以被動運輸的 方式進入上皮細胞內。再由血液運輸至肝臟與葡萄糖醛酸(glucuronic acid)

或硫酸鹽(sulphate)複合排除體外， ⁽⁷⁾如圖三所示。

(Biochem. Soc. Trans. 2000 Feb; 28(2):16-22. Review)

2-2.2 類黃酮的生物活性

在抗氧化及自由基清除能力方面︰

自由基(free radical)是指分子具有未成對電子。在生物體內氧化還原 代謝過程中會伴隨著自由基的產生。如 HO‧(hydroxyl radical )﹔O₂‧^- (superoxide)﹔ROO‧(peroxyl radical)﹔NO‧(nitric oxide)﹔RS‧(thioyl)﹔

LOO‧ (lipid peroxyl) 等而這些自由基因擁有極不穩定的特質，易從周圍環 境中去擷取己穩定結構的電子，因此有很多的疾病都與自由基相關。⁽⁸⁾而類 黃酮屬於多酚的結構，此結構具清除自由基及抑制脂質氧化的作用﹔同時 也能藉由抑制銅離子所誘導之LDL 氧化反應而達到抗氧化的作用。

在訊息傳導方面︰

類黃酮會阻斷 EGFR(epidermal growth factor receptor) 傳遞酪胺酸磷酸 化之訊息，進而抑制皮膚癌細胞之增生，另外，還有會抑制體內重要訊息 傳導物質一氧化氮(NO)的生成。⁽⁹⁾

在抗菌方面︰

其抗菌機轉可能是藉由與細菌細胞的水溶性蛋白質或與其細胞壁結合﹔同 時類黃酮具有抑制細菌之葡萄糖基轉移酶(glucosyltransterase)的作用。⁽¹⁰⁾

OH HO

O

Cl

O PhOCO OCOPh

O

acetone

OH PhOCO

O

Ph O

AcONa/AcOH

7 8

9

O HO

O R

10 R=H

K₂CO₃

2-3 類黃酮的成環方法及相關合成法︰

(1)根據 1989 年 We, E. S. C.等人的報導，⁽¹¹⁾由化合物 7 與苯甲醯氯 (benzoyl chloride) 進 行 酯 化 反 應 而 得 化 合 物 8 ， 再 由 化 合 物 8 依 Baker-Venkataraman transformationz 方法於鹼性條件下得化合物 9。化合物 9 依 Allan-Robinson reaction 之方法於酸性條件下環化而得化合物 10。如圖 四所示。

圖四︰類黃酮成環方法(一)

(2)根據 2003 年 Bailly C. 等人報導，⁽¹²⁾合成化合物15 (取自於 Millettia griffoniana 植 物 中 的 一 種 異 黃 酮 ) 的 兩 個 關 鍵 過 程 為 環 化 及 芳 基 化 (arylation)。而就環化物而言，由化合物 11 經加入醋酸酐及醋酸鈉進行酯化

步驟而得化合物13。化合物 13 再加入 diethyl carbonate 及 NaOH 進行縮合 反應得化合物14。如圖五所示:

圖五︰類黃酮成環方法(二)

(3)根據 2003 年 Huang, W. H 等人提出，合成高產率之方法。⁽¹³⁾此合成 法除了起始物的選擇外，另一個關鍵因素則是成環的條件及產率。化合物 16 先對芳香環引入一個乙醯基後，再加入另一來源之芳香環試劑，經縮合

反應而得，或直接於起始物的環引入另一來源之芳香環直接製得化合物 17。再由化合物 17 在二甲基亞碸迴流溶液中加入催化量的碘環化而得化合

物 18。由化合物 18 經水解去甲醛保護官能基修飾而得化合物 19。如圖六 所示。

O O

O OH

Ac₂O, AcONa

O O

O O

11 12

O

1)BF₃-OEt₂/EtOH 2)NaOH

3)H

O O

O OH

O

NaOH/diethyl carbonate O O

O

13

14 O

OH

O O

O O

O

OH O

O O

15 3,4-methylenedioxyphenylead

triacetate CHCl₃/pyridine

O

O O

OH

1)cinnamoly chloride BF₃-Et₂O

2)AcOH/BF₃-Et₂O benzaldehyde/KOH/EtOH

O

O O

OH

11 17

I₂/DMSO

O

O O

O

O

O

18

HBr/AcOH HO

HO OH

O

O 19

圖六︰類黃酮成環方法(三)

三、研究目的：

根據Gao H.和Kawabata J.發現在B環C₄’的位置上以其他官能基取代氫 原子，有助於加強抑制α-Glucosidase的能力⁽¹⁴⁾﹔或是能增強抗菌的能力⁽¹⁵⁾。 若 取 代 的 基 團 為-NO₂ (nitroxyl) 、 -OMe (methoxyl) 或 一 些 拉 電 子 基 團 (electro-negative group )時，在類黃酮的生物活性上有明顯的影響力。因此，

本實驗將以起始物3,4,5-三甲氧基酚(3,4,5-trimethoxyphenol)為起始物，合成 具類黃酮結構的化合物，再以一些方式修飾其B環上C₄’位置的官能基。如 圖七、圖八所示︰

圖七︰類黃酮的逆合成(一)

MeO

MeO OMe

O

O

O

Cl MeO

MeO OMe

O

O

O

N3 n

n n=1,or 2 n=1,or 2

MeO

MeO OMe

O

O

O

NH₂ n n=1,or 2

8; n=1 12; n=2

7; n=1 11; n=2

6; n=1 10; n=2 MeO

MeO OMe

O

O

O

N3 n n=1,or 2

7; n=1 11; n=2

MeO

MeO OMe

O

O

O

OH n n=1,or 2

MeO

MeO OMe

O

O

O

Cl n n=1,or 2

6; n=1 10; n=2

5; n=1 9; n=2

MeO

MeO OMe

O

O

O

OH n n=1,or 2

5; n=1 9; n=2

MeO

MeO

OMe O

OH

O

圖八︰類黃酮的逆合成(二)

(2)以抗氧化和酪胺酸酶抑制的體外測試，挑選其活性較佳的化合物；

(3)再進一步試養黑色素細胞，並探討其結果。

MeO

MeO OMe

O

OBn

O MeO

MeO OMe

O

OH

O

MeO

MeO OMe

OH

O

OBn

MeO

MeO OMe

OH

O

OBn

MeO

MeO OMe

OH

O

MeO

MeO OMe

OH

3,4,5-trimethoxyphenol

第二章 材料與方法

一、合成實驗 1.1 藥品︰

(1) benzyl bromide ( Lancaster，England) (2) chloroform-D1 (Merck，USA)

(3) 4-Hydroxybenzaldehyde (Acros，USA) (4) Potassuum carbonate (Showa，Japan) (5) Methyl alcohol (Tedia，USA)

(6) 3,4,5-Trimethoxyphenol 97％ (Alfa Aesar)

(7) Boron trifluoride diethyl ether complex 98％ (Lancaster，England) (8) Acetylchloride (Fluka)

(9) Potassium tert-butoxide (Lancaster，England) (10) Iodine (Showa)

(11) 2-Bromoethanol (Acros，U.S.A) (12) Potassium carbonat (Merck) (13) Thionyl Chloride (Merck) (14) Sodium azide (Merck) (15) Triphenylphosphine (Merck)

(17) 3-Chloro-1-propanol 98％ ((Lancaster，England) (18) Tetrahydrofuran (Fisher，U.S.A)

(19) Hydrobromic acid 48％ ( Acros ，U.S.A) (20) Acetic Acid (99~100％) (島久，Japan) (21) Dimethyl Sulphoxide (Panreac)

(22) Hydrochloric acid 37％ (Scharlau，E.U.) (23) Dichloromethane (Mallinckrodt，U.S.A)

(24) n,n-Dimethylformamide (Mallinckrodt，U.S.A) (25) Bortribromid 1M ( Aldeich，Germany)

(26) Ethanol anhydrous ( ECHO，Taiwan) (27) Ethyl Acetate ( ECHO，Taiwan) (28) Hexanes ( ECHO，Taiwan)

(29) Acetone ( ECHO，Taiwan)

1.2 儀器︰

1、核磁共振光譜儀 (NMR)：本系 Bruker Avancetm DPX-200 MHz NMR。

所用之溶劑為氘溶劑(如 CDCl3，DMSO-d6 等)，而化學位移之校正是以 氘溶劑( CDCl3 )內的氫δ7.24 或以四甲基矽烷( TMS )δ0.00 為內標

位移是以 CDCl₃δ77.00 為內標準。其多重性 ( multiplicity ) 是使用 DEPT (distortionless enhancement by polarization transter ) 脈衝的次序技 巧測定之。此外，氫光譜中符號s 表示單重峰 ( singlet )，d 表示雙重峰 ( doublet )，t 表示三重峰 ( triplet )，q 表示四重峰( quartet )，m 表示多 重峰 ( multiplet )，br 表示寬光譜，dd 表示雙重二重峰。碳光譜中符號 s 表示四級碳 ( C )，d 表示三級碳( CH )，t 表示二級碳( CH₂ )，q 表示一 級碳( CH₃ )。

2、萃取後的有機層溶液皆以無水硫酸鎂 ( MgSO₄ ) 乾燥，並經減壓濃縮，

所得粗產物以矽膠 ( silica gel ) 填充的管柱層析( column chromat-

ography )或以再結晶方式純化。silica gel 是使用 Merck Geduran Si 60。

3、減壓濃縮機是使用 N-1NW、A-3S 型旋轉蒸發儀。

4、抽真空是使用 GVD-050A 回轉式真空幫浦。

5、熔點測定儀︰Melting point apparatus

6、霍式轉換紅外光光度計：Perkin elmer

7、傅利葉轉換式質譜儀︰Bruker APEX II，電噴灑游離源(ESI)

1.3 化合物的鑑定與合成︰

1-(6-Hydroxy-2,3,4-trimethoxy-phenyl)-ethanone (21)

將3,4,5-三甲氧基酚 (0.499 g, 2.71 mmol)於室溫下溶於三氟化硼 (1.71 mL) 在氮氣系統下攪拌，加熱至 80℃~85℃待起始物全溶再緩慢加入 乙醯氯(0.25mL，3.52 mmol)反應一個小時。將其降回室溫後加入蒸餾 水 (10 mL)後，再以乙酸乙酯(10 mL)萃取三次。混合的有機層以飽和 食塩水洗滌乾燥，經過濾，濃縮後由管柱層析法分離(沖提系統；乙酸 乙酯：正己烷=1：4)得黃色油狀化合物 21 ( 0.437 g；71％ )

MeO

MeO

OMe

OH MeO

MeO

OMe OH

O Ac

O/BF

OEt

20 21

O

H

C Cl

光譜資料︰21

IR (CHCl3,cm^-1): 1634, 3425

1H NMR [ 200 M HZ﹐CDCl3 ] :

δ13.33 ( s, 1 H ), 6.13 ( s, 1 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.79 ( s, 3 H ), 3.69 ( s, 3 H ), 2.55 ( s, 3 H )

13C NMR (50 MHZ，CDCl3) :

δ 203.30 (s), 161.90 (s), 160.10 (s), 155.23 (s), 134.73 (s), 108.41 (s), 96.09 (t),60.95 (q), 56.04 (q), 31.86 (q)

HRMS︰calcd for C₁₁H₁₄O₅ (M⁺ + H)︰227.0919, found 227.0921

3-(4-Benzyloxy-phenyl)-1-(6-hydroxy-2,3,4-trimethoxy-phenyl)-propenone (22)

將化合物 21 (1.656 g, 7.33 mol )以絶對乙醇( 16 mL )溶解，再加入 四丁氧基化鉀(potassium tert-butoxide) ( 1.64 g, 0.02 mmol )攪拌 3-5 分

鐘，再加入化合物4-苄氧基苯甲醛(4-benzyloxy-benzaldehyde) ( 1.709 g, 8.06 mmol )加熱迴流 3 小時。將其置於室溫先濃縮大部份的乙醇再加 10mL 蒸餾水，乙酸乙酯 ( 20 mL )萃取三次。混合的有機層以飽和食 塩水洗滌乾燥，經過濾，濃縮後由管柱層析法分離(沖提系統；乙酸乙 酯：正己烷=1：4)得橘色固體 22 ( 2.960 g, 93.56％ )

MeO

MeO

OMe OH

O 21

t-BuOK/EtOH

MeO MeO

OMe OH

O

OBn

22 H

O

O

光譜資料︰22 MP︰ 95~96 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1627, 3395

1H NMR [ 200 M H_Z﹐CDCl₃ ]︰

δ 13.67 ( s, 1 H ), 7.76 ( s, 2 H ), 7.43 ( d, J = 8.7 H_Z, 2 H ), 7.35-7.18 ( m, 6 H ), 6.90 ( d, J = 8.7 HZ , 2 H ), 6.22 ( s, 1 H), 5.04 ( s, 2 H ), 3.85 ( s, 3 H ), 3.82 ( s, 3 H ), 3.76 ( s, 3 H )

13C NMR (50 MHZ﹐CDCl3)︰

δ 193.01(s), 162.83 (s), 160.91 (s), 160.15 (s),155.18 (s),143.46 (d), 136.67 (s), 135.50 (s), 130.41(d)*2, 128.85(d)*2, 128.56 (s), 128.34 (d), 127.64 (d)*2, 124.41 (d), 115.52 (d), 108.99 (s), 96.79 (d),70.32 (t), 62.07 (q), 61.46 (q), 56.25 (q)

HRMS︰calcd for C25H24O6 (M⁺ + H)︰421.1651, found 421.1653

2-(4-Benzyloxy-phenyl)-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (23)

將化合物 22 (1.137g, 2.71 mmol)溶於二甲基亞碸(dimethyl sulphoxide)(8 mL)加入催化量的碘(iodine)，加熱迴流 1 小時後，放至室

溫冷卻後加入硫代硫酸鈉至顔色不再變色為止，冰浴析出。過濾，收 集固體，粗產物經由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正己烷=1：

2)得淡黃色固體 23 ( 0.81 g, 71％)

MeO

MeO

OMe OH

O

OBn

22

MeO

MeO

OMe O

OBn

O I₂

DMSO

23

光譜資料︰23 MP. 158~160 ℃ IR (KBr, cm^-1): 1615

1H NMR [ 200 M H^Z，CDCl₃ ]:

δ 7.78 ( d, J =8.8 HZ, 2 H ), 7.40-7.34 ( M, 5 H ), 7.04 ( d, J =8.9 HZ, 2 H ), 6.75 ( s, 1 H ), 6.54 ( s, 1 H ), 5.11 ( s, 2 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.94 ( s, 3 H ), 3.89 ( s, 3 H )

¹³C NMR (50 MH_Z，CDCl₃):

δ 177.27 (s), 161.39 (s), 161.18 (s), 157.75 (s), 154.58 (s), 152.66 (s), 140.45 (s), 136.38 (s), 128.80 (d)*2, 128.33 (d), 127.74 (d) *2, 127.57 (d)

*2, 124.18 (d), 115.38 (d) *2, 112.96 (s), 107.17 (s), 96.39 (d), 70.30 (t), 62.29 (q), 61.62 (q), 56.38 (q)

HRMS︰calcd for C25H22O6 (M⁺ + H)︰419.1495, found 419.1492

2-(4-Hydroxy-phenyl)-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (24)

將化合物 23 ( 0.986 g，2.36 mmol )加入濃塩酸與醋酸比例為 1：3 溶

液中( 36 mL )加熱至 70℃反應 1.5 小時之後放置室溫，倒入冰水中冰浴 析出。過濾，收集固體，由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正 己烷=1：1)得淡黃色固體 24 ( 0.85 g, 86％ )

MeO MeO

OMe O

OH

O HCl:AcOH

24 MeO

MeO

OMe O

OBn

O 23

光譜資料︰24 MP. 232~235 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1630, 3395

1H NMR [ 200 M H^Z，DMSO]:

δ7.89 ( d, J =8.7 HZ, 2 H ),δ7.16 ( s, 1 H ),δ 6.90 ( d, J =8.7 HZ, 2 H ), δ6.60 ( s, 1 H ), δ3.93 ( s, 3 H ), δ3.79 ( s, 3 H ),δ3.75 ( s, 3 H )

13C NMR (50 MH_Z，DMSO) :

δ 175.66 (s), 160.74 (s), 157.37 (s), 153.91 (s), 151.59 (s), 139.74 (s), 127.92 (d), 121.34 (s), 115.89 (d), 112.01 (s), 105.44 (d), 97.25 (d), 61.85 (q), 60.99 (q), 56.42 (q)

HRMS︰calcd for C18H16O6 (M⁺ + H)︰329.1025, found 329.1027

2-[4-(2-Hydroxy-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (25)

將化合物 24 ( 0.228 g，6.95 mmol) 溶於二甲基亞碸 (5 mL )再加 入碳酸鉀(potassium carbonat)( 0.192 g, 1.40 mmol )攪拌 3 至 5 分鐘之後 再加入2-溴乙醇(2-bromoethanol)( 0.173 ml, 2.43 mmol )加熱至 60℃

反應24 小時後加入蒸餾水( 5 mL ) 乙酸乙酯 ( 10 mL)萃取三次，混合 的有機層經飽和食塩水洗滌，乾燥，過濾，濃縮，所得的粗產物經由 管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正己烷=1：1.5)得白色固體 25 ( 0.159 g, 62％ )

MeO

MeO

OMe O

O

O

OH

Br OH

K₂CO₃/DMSO

25 MeO

MeO

OMe O

OH

O 24

光譜資料︰25 MP.156~159 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1627, 3350, 3455

1H NMR [ 200 M H_Z；CDCl₃ ] :

δ 7.78 ( d, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.99 ( d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.76 ( s, 1 H), 6.54 ( s, 1 H), 4.14 ( t, J = 4.2 Hz, 2 H), 3.99-3.95 ( m, 8 H), 3.89 ( s, 3 H)

13C NMR (50 MH_Z，CDCl₃)

δ 177.45 (s), 161.46 (s), 161.27 (s), 157.88 (s), 154.66 (s), 152.72 (s), 140.54 (s), 127.83 (d), 124.32 (s), 115.14 (d), 112.99 (s), 107.23 (d), 96.43 (d), 69.72 (t), 62.35 (q), 61.69 (q), 61.40 (t), 56.46 (q)

HRMS︰calcd for C₂₀H₂₀O₇ (M⁺ + H)︰373.1287, found 373.1287

2-[4-(2-Chloro-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (26)

將化合物 25 ( 0.49 g，1.07 mmol )溶於三氯甲烷(chloroform)與二 甲基甲醯胺(n,n-dimethylformamide)比例為 10：1 溶液中( 44 mL )在冰 浴0℃下加入亞硫醯氯(thionyl chloride) ( 0.5 mL, 6.45 mmol )之後移除 冰浴，加熱至 40℃反應 3 小時後，加入碳酸氫鈉飽和水溶液，至不再 有氣體產生為止。分離出有機層溶液經飽和食塩水洗滌，乾燥，過濾，

濃縮，所得的粗產物經由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正己 烷=1：2 )得白色固體 26 ( 0.378 g, 90％)

MeO

MeO

OMe O

O

O

OH

25

MeO

MeO

OMe O

O

O

Cl

SOCl₂ CHCl₃:DMF

26

光譜資料︰26 MP. 163~164℃

IR (KBr, cm^-1): 1649, 3440

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ 7.82 ( d, J = 9.2 H_Z , 2 H ), 7.01 ( d, J = 8.9 H_Z , 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.56 ( s, 1 H ), 4.29 ( t, J = 5.8 HZ , 2 H ), 3.97 ( s, 3 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.89 ( t, J = 5.8 HZ, 2 H )

13C NMR (50 MHZ，CDCl3):

δ 177.25 (s), 161.03 (s), 160.84 (s), 157.83 (s), 154.62 (s), 152.72 (s), 140.53 (s), 127.84 (d), 124.76 (s), 115.18 (d), 113.04 (s), 107.40 (d), 96.43 (d), 68.31 (t), 62.32 (q), 61.65 (q), 56.43 (q), 41.82 (t)

HRMS︰calcd for C₂₀H₁₉ClO₆ (M⁺ + H)︰391.0948, found 391.0946

2-[4-(2-Azido-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (27)

將化合物26 ( 0.20 g，0.51 mmol )溶於二甲基甲醯胺( 2.5mL )中加 入疊氮化鈉(sodium azide) ( 0.083 g, 1.28 mol )攪拌，加熱至 65℃反應 24 小時之後，冰浴析出，過濾，收集的粗產物經管柱層析法分離(沖提 系統；乙酸乙酯：正己烷=1：2)得白色固體 27 ( 0.19 g, 95％ )

MeO

MeO

OMe O

O

O

Cl

MeO

MeO

OMe O

O

O

N₃ NaN₃

DMF

26 27

光譜資料︰27 MP. 140~142 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1641, 2111, 3395

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ7.88 ( d, J = 8.7 HZ , 2 H ), 7.01 ( d, J = 8.8 HZ , 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.57 ( s, 1 H ), 4.21 ( t, J = 4.9 HZ, 2 H ), 3.97 ( s, 3 H ), 3.96 ( s, 3 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.63 ( t, J = 4.8 H_Z, 2 H )

13C NMR (50 MH_Z，CDCl₃):

δ 177.29 (s), 161.07 (s), 160.85 (s), 157.84 (s), 154.63 (s), 152.72 (s), 140.53 (s), 127.85 (d), 124.74 (s), 115.12 (d), 113.02 (s), 107.40 (d), 96.43 (d), 67.30 (t), 62.33 (q), 61.66 (q), 56.43 (q), 50.23 (t)

HRMS︰calcd for C20H19N3O6 (M⁺ + H)︰398.1352, found 398.1353

2-[4-(2-Amino-ethoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (28)

將化合物27 ( 0.084 g，0.21 mmol )溶於四氫呋喃(tetrahydrofuran)( 2 mL)中加入三苯膦(triphenylphosphine)( 0.056 g, 0.21 mmol )攪拌 1.5 小 時，加入蒸餾水0.2 mL 後反應 16 小時後，加入蒸餾水(5 mL) 乙酸乙 酯 (10 mL)萃取三次，混合的有機層經飽和食塩水洗滌，乾燥，過濾，

濃縮，所得的粗產物經由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正己 烷=1：20)得白色固體 28 (0.0279 g, 35％)

MeO MeO

OMe O

O

O

N₃

27

MeO MeO

OMe O

O

O

NH₂

28 H₂O / THF

P

光譜資料︰28 MP. 198~199℃

IR (KBr, cm^-1): 1671, 3447

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ7.80 (d, J = 9.1 HZ, 2 H), 6.97 (d, J = 9.1 HZ, 2 H ), 6.77 (s, 1 H), 6.55 (s, 1 H), 4.10 (t, J = 5.0 HZ, 2 H), 3.97 (s, 3 H), 3.96 (s, 3 H), 3.80 (s, 3 H), 3.67 (t, J = 5.2 H_Z, 2 H)

13C NMR (50 MH_Z，CDCl₃):

δ 177.83 (s), 161.66 (s), 161.47 (s), 158.05 (s), 154.63 (s), 152.55 (s), 140.61 (s), 127.73 (d), 123.73 (s), 115.00 (d), 112.81 (s), 106.95 (d), 96.51 (d), 68.33 (t), 62.38 (q), 61.73 (q), 56.53 (q), 39.79 (t)

2-[4-(3- Hydroxy -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (29)

將化合物 24 ( 0.51 g，1.55 mmol )溶於二甲基亞碸(15 mL)再加入 碳酸鉀 ( 0.431g, 3.12 mmol )攪拌 3 至 5 分鐘之後再加入 3-氯-1-丙醇 (3-chloro-1-propanol) (0.455 mL, 5.44 mmol)加熱至 60℃反應 24 小時後 加入蒸餾水 (10 ml)乙酸乙酯 (20 mL)萃取三次，混合的有機層經飽和 食塩水洗滌，乾燥，過濾，濃縮，所得的粗產物經由管柱層析法純化(沖 提系統；乙酸乙酯：正己烷=1：1.5)得白色固體 29 (0.159 g, 62％)

MeO MeO

OMe O

O

O OH

K₂CO₃/DMSO MeO

MeO

OMe O

OH

O 24

OH

29 Cl

光譜資料︰29 MP. 132~135 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1643, 3291

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ 7.80 ( d, J = 8.8 Hz, 2 H), 7.00 ( d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.77 ( s, 1 H), 6.56 ( s, 1 H), 4.18 ( t, J = 6.0 Hz, 2 H), δ3.97 ( d, 6 H),δ3.90~3.83 ( m, 5 H ), 2.07 ( t, J = 5.9 Hz, 2 H)

13C NMR (50 MHZ，CDCl3):

δ 177.47 (s), 161.67 (s), 161.36 (s), 157.84 (s), 154.64 (s), 152.68 (s), 140.39 (s), 127.77 (d), 123.91 (s), 115.03 (d), 112.95 (s), 107.06 (d), 96.43 (d), 65.71 (t), 62.35 (q), 61.70 (q), 59.83 (t), 56.46 (q), 32.15 (t)

HRMS︰calcd for C₂₁H₂₂O₇ (M⁺ + H)︰387.1444, found 387.1443

2-[4-(3- Chloro -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (30)

將化合物 29 (1.478g，3.82 mmol)溶於三氯甲烷與二甲基甲醯胺比 例為10：1 溶液中(154 mL)在冰浴 0℃下加入亞硫醯氯 (1.67 mL, 22.391 mol)之後移除冰浴，加熱在 40℃反應 3 小時後，加入碳酸氫鈉飽和水 溶液，至不再有氣體產生為止。分離出有機層溶液經飽和食塩水洗滌，

乾燥，過濾，濃縮，所得的粗產物經由管柱層析法純化(沖提系統；乙 酸乙酯：正己烷=1：2)得白色固體 30 (1.355 g, 88％)

MeO

MeO

OMe O

O

O Cl

30 MeO

MeO

OMe O

O

O

OH

29

SOCl₂ CHCl₃:DMF

光譜資料︰30 MP. 152~154℃

IR (KBr, cm^-1): 1645, 3432

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ7.81 ( d, J = 8.8 HZ, 2 H ), 6.99 ( d, J = 9.1 HZ, 2 H ), 6.78 ( s, 1 H ), 6.56 ( s, 1 H ), 4.19 ( t, J = 5.8 HZ, 2 H ), 3.97 ( s, 6 H ), 3.90 ( s, 3 H ), 3.75 ( t,

J = 6.1 H

13C NMR (50 MH_Z，CDCl₃):

δ 177.31 (s), 161.43 (s), 161.22 (s), 157.82 (s), 154.66 (s), 152.77 (s), 140.54 (s), 127.83 (d), 124.31 (s), 115.08 (d), 113.37 (s), 107.31 (d), 96.44 (d), 64.74 (t), 62.34 (q), 61.68 (q), 56.44 (q), 41.44 (t), 32.28 (t)

HRMS︰calcd for C21H21ClO6 (M⁺ + H)︰405.1105, found 405.1104

2-[4-(3- Azido -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (31)

將化合物 30 ( 0.287 g，0.71 mmol )溶於二甲基甲醯胺 (5 mL )中加 入疊氮化鈉 ( 0.120 g, 1.85 mmol )攪拌，加熱至 65℃反應 24 小時之後，

冰浴析出，過濾，收集的粗產物經由管柱層析法分離(沖提系統；乙酸 乙酯：正己烷=1：2)得白色固體 31 ( 0.277 g, 95％)

MeO

MeO

OMe O

O

O N₃

31 MeO

MeO

OMe O

O

O Cl

30

NaN₃ DMF

光譜資料︰31 MP. 107~108 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1623, 2097, 3425

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ 7.81 (d, J = 8.9 H_Z, 2 H), 6.98 (d, J = 8.8H_Z, 2 H ), 6.78 (s, 1 H), 6.56 (s, 1 H), 4.12 (t, J = 5.9 HZ, 2 H), 3.97 (s, 6 H), 3.96 (s, 3 H), 3.90 (t, J = 6.5 HZ, 2 H), 2.08 (t, J= 6.3 HZ, 2 H)

13C NMR (50 MHZ，CDCl3):

δ 177.34 (s), 161.35 (s), 161.22 (s), 157.80 (s), 154.64 (s), 152.72 (s), 140.50 (s), 127.82 (d), 124.27 (s), 115.02 (d), 113.02 (s), 107.26 (d), 96.41 (d), 64.94 (t), 62.33 (q), 61.68 (q), 56.43 (q), 48.28 (t), 28.84 (t)

HRMS︰calcd for C₂₁H₂₁N₃O₆ (M⁺ + H)︰412.1509, found 412.1506

2-[4-(3- Amino -propoxy)-phenyl]-5,6,7-trimethoxy-chromen-4-one (32)

將化合物31 (0.542 g，1.32 mmol )溶於四氫呋喃 ( 5 mL )中加入三 苯膦 (0.351 g, 1.34 mmol )攪拌 1.5 小時，加入蒸餾水( 0.2 mL)後反應 16 小時後，加入蒸餾水(5 mL )乙酸乙酯 (10 mL)萃取三次，混合的有 機層經飽和食塩水洗滌，乾燥，過濾，濃縮，所得的粗產物經由管柱 層析法純化由管柱層析法純化(沖提系統；乙酸乙酯：正己烷=1：20) 得白色固體32 (0.231 g, 45％)

MeO

MeO

OMe O

O

O NH₂

MeO MeO

OMe O

O

O N₃

31 32

H₂O / THF P

光譜資料︰32 MP. 144~148 ℃

IR (KBr, cm^-1): 1630, 3388

1H NMR [ 200 M H^Z；CDCl₃ ]:

δ 7.78 (d, J = 8.8 H_Z, 2 H), 6.97 (d, J = 9.0 H_Z, 2 H ), 6.76 (s, 1 H), 6.54 (s, 1 H), 4.10 (t, J = 6.3 HZ, 2 H), 3.96 (s, 6 H), 3.95 (s, 3 H), 3.88 (s, 3 H), 2.91 (t, J = 6.6 HZ, 2 H), 1.93 (t, J = 6.5 HZ, 2 H)

13C NMR (50 MHZ，CDCl3):

δ 177.25 (s), 161.65 (s), 161.23 (s), 157.70 (s), 154.54 (s), 152.60 (s), 140.39 (s), 127.67 (d), 123.79 (s), 114.94 (d), 112.90 (s), 107.01 (d), 96.37 (d), 66.20 (t), 62.24 (q), 61.58 (q), 56.36 (q), 39.10 (t), 32.88 (t)

HRMS︰calcd for C₂₁H₂₃NO₆ (M⁺ + H)︰386.1604, found 386.1402

二、生物活性測試 2-1 抗氧化試驗 2-1.1 藥品

(1) α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (TCI，Japan)

(2) 2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt ) (TCI，Japan)

(3) 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic Acid (Acros ， U.S.A)

(4) Peroxidase (景明，Taiwan)

(5) beta-Nicotinamide adenine dinucleotis, disodium salt hydrate(Acros，

U.S.A)

(6) Phenazine methosulfate (Acros，U.S.A) (7) Nitro blue tetraolium (島久，Japan) (8) Trichloroacetic acid (Merck，Germany) (9) 2-Thiobarbituric acid (Merck，Germany) (10) Iron(III) chloride (Merck，Germany) (11) L-Ascorbic Acid (Sigma)

(12) L-Tyrosine (Acros，U.S.A)

2-1.2 儀器

(1) Electron Corporation (MULTISKAN EX) 2-1.3 實驗步驟

2-1.3.1. 清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力︰^(16,17) 油脂在自氧化過程中會產生自由基而造成油脂酸敗，常見的抗氧化

物藉由提供氫(hydrogen doner)來清除脂質過氧化物自由基(peroxyl radical)，進而達到抑制氧化鏈鎖反應，在抗氧化的研究上通常使用 DPPH 來評估抗氧化的供氫能力。

(1) 藥品配製︰

a. DPPH 1mM︰取 39 mg α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl 用甲醇定量 至 100 mL

b. Trolox 10 mg/mL︰取 10 mg 的 trolox 加 1 mL 去離子水混均勻 (2) 樣品處理︰

取 2 mg 的樣品加入 1mL 的 95％乙醇，濃度為 2 mg/mL，混合均 勻使樣品呈澄清狀態的測試液。

(3) 實驗步驟︰

在 96 槽的微量平盤中加入濃度為 2 mg/mL 體積分別為 2.5μL、5 μL、10μL、20μL 和 40μL 的試驗樣品溶液，再加入 95％乙醇體積

80μL 新鮮配製的 DPPH 甲醇溶液(1 mM)，使最後總體積為 200μL，

在同一盤 96 槽的微量平盤中加入一槽 trolox 1μL(10 mg/mL)、去離子 水 119μL 和 80μL DPPH 甲醇溶液(1 mM)做為對照組，再做一槽控制 組為 95％乙醇 120μL 和 80μL DPPH 甲醇溶液(1 mM)，最後於室溫下 避光振盪 30 分鐘混合均勻後，使用 ELISA Reader 檢測 550 nm 之吸光 值。

2-1.3.2. Trolox 當 量 的 抗 氧 化 能 力 (Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)^(18,19)

ABTS (2,2-azino-bis-[3-ethylben thiazoline sulfonic acid])與 peroxidase (metmyoglolin)及 H2O2反應，會產生ABTS‧⁺陽離子自由基。此為一相 當穩定藍綠色物質，抗氧化劑的加入會抑制此顏色的產生，因此吸光 值愈低，抗氧化效果愈佳。

(1) 藥品配製︰

a. Peroxidase 44 unit/ mL︰從母液 1000 unit/mg 取 5 mg 加入 1mL 二次水配製 5000 unit/ mL(5 unit/μL)的 peroxidase 再加入 1190 μL 的 PBS 至濃度為 44 unit/ mL

b. H₂O₂ 500μM︰取 8.8 M H₂O₂ 10μL 加入 870μL 的二次水配製

為 500μM。

c. ABTS 1000μM 2,2-azino-bis-[3-ethylbenthiazoline sulfonic acid]

Mw:548.7(二次水定量):取 0.66 mg ABTS 加入 1.2 mL 二次水配 製濃度 1000μM。

d. Trolox 10 mg/mL : 取 10 mg 的 trolox 加 1mL 二次水混合均勻。

(2) 實驗步驟︰

取 1.2 mL peroxidase、1.2 mL H₂O₂溶液，1.2 mL ABTS 以及 7.2 mL

去離子水混合均勻，暗室中反應1 小時，反應完成後產生安定藍綠色之

ABTS‧⁺ 陽離子自由基。

準備一個 96 槽的微量平盤，加入濃度為 2 mg/mL 體積為 2.5μL、

5μL、10μL、20μL 和 40μL 的樣品，再加入 95％乙醇體積分別為 97.5μL、95μL、90μL、80μL 和 60μL，之後迅速加入 100μL 的 ABTS‧，最後總體積為 200μL，在同一盤 96 槽的微量平盤中加入一 槽 trolox 1μL(10 mg/mL)、95％乙醇 99μL 和 100μL 的 ABTS‧做為 對照組，再做一槽控制組為 95％乙醇 100μL 和 100μL 的 ABTS‧，

將 96 槽的微量平盤放在震盪器上震 10 分鐘混合均勻後，使用 ELISA Reader 檢測 620 nm 之吸光值。

2-1.3.3. 抑制 liposome脂質過氧化試驗^(20,21)

定脂質過氧化之產物(malondialdehyde, MDA)。

實驗步驟︰

準備 1mL 的微量離心管，取濃度為 1 mg/mL 體積為 9μL、18.75 μL、37.5μL、75μL 和 150 μL 的樣品，再加入體積分別為 116 μL、106.25μL、87.5μL、50μL 磷酸緩衝液 ( pH 7.4 )，之後 加入 125μL 的 liposome 溶液，再加入 125μL 的 L-ascorbic acid 溶液及 125μL 的 FeCl₃溶液，以震盪器混合均勻後，放入 37°C 烘 箱培養1小時。震盪混合均勻後，再加入250μL 之TCA-TBA-HC

混合，於60°C加熱1小時至反應液呈粉紅色。冷卻後取1 mL於試管 離心2000 rpm，10分鐘後取上清液200 µL至96微量盤以ELISA 540

nm 之吸光值。

2-1.3.4. 清除率的計算方式︰

樣品的清除率%=(1-樣品值/控制組)*100

2-2 酪胺酸酶抑制^(22,23,24) 2-2.1 實驗步驟

(1) 藥品配製：

a.酪胺酸酶原液與稀釋液配置

準備一個 1.5 mL 的微量離心管，加入濃度為 1mg/mL 體積為 600µL 的樣品，取200µL、150µL、100µL、60µL、20µL 的樣品，都加入 100µL 的 DMSO 和 PBS 緩衝溶液體積分別為 785µL、735µL、785Μl、825µL、

865µL，之後迅速加入 10µL 的酪胺酸酶 (75 unit)，最後總體積為 1000µL。用 300µL 的 DMSO 加 685µL 的 PBS 緩衝溶液再加入 15µL 酪 胺酸酶及 100µL 的 DMSO 加 900µL 的 PBS 緩衝溶液當空白組，皆震

盪混合均勻，放入 37℃恆溫培養箱一小時(加速反應)，之後分別取

100µL 至 96 槽的微量平盤中，使用 ELISA Reader 檢測 450 nm 之吸光 值。

(2) 抑制率的計算方式︰

樣品的抑制率%= (1-樣品值-空白組/控制組-空白組)*100

2-3 黑色素細胞毒性試驗^(25,26,27) 2-3.1 材料

(1) 黑色素細胞 B16-F0 秀琴老師實驗室

(2) 培養液 DMEM Hyclone：SH30003.01

(3) 胎牛血清(去補體) Gibico Cat. No：26140-079 Hyclone Cat. No：SH30070.03 (4) 抗生素 penicillin G、amphotericin、streptomycin

Hyclone Cat. No：SV30079.01 (5) MTT (Thiazolyl blue tetrazolium bromide) Sigma M5655-500MG

2-3.2 實驗步驟

第一天無菌操作：

細胞準備：

1. 取出已經長8 分滿的 B16-F0 燒瓶，用 10mL 滴管取出黑色培養液到 加入漂白水的廢液桶，再加入10mL PBS 沖洗細胞 1 次吸取到廢液 桶，加入1mL trypsin 到 25T 燒瓶(2mL trypsin for 75T 燒瓶)，反應 3-5 分鐘，用手輕拍燒瓶將細胞打下來，之後加入 5mL DMEM 培 養液中止反應，移到離心管，離心 (1200 rpm，5min)，倒掉上清液，

血清)，將細胞分散均勻。

2. 用微量吸管取出20 µL 細胞，加上 20 µL Trypan Blue (0.04%) 染色 放入細胞計數器。

3. 在顯微鏡下計數活與死的細胞數，細胞存活率須大於85%，以 DMEM 完整的培養液調整細胞濃度為 1 x 10⁵cells/mL。

4. 將100 µL (5 x 10⁵ cells/mL)的 B16-F0 細胞種在 96 槽的微量平盤(1 x 10⁴cells/well)，在 37℃含 5％的二氧化碳培養箱隔夜培養。

第二天無菌操作

1. 24 小時培養後，加入 100 µL 樣品 (共 9 種水抽樣品，5 個濃度：0.4 mg/mL，0.2 mg/mL，0.1mg/mL，0.05 mg/mL， 0.025mg/mL) 在 96

槽的微量平盤混合均勻，在 37℃含 5％的二氧化碳培養箱隔夜培養 (24 小時)。

第三天無菌操作

1. 24 小時後，將培養液吸掉，用 PBS 沖洗 1 次，再加入含 MTT 新鮮 培養液(0.5mg/mL)，100µL，置於 37℃含 5％的二氧化碳培養箱反

應 3 小時。

2. 3 小時後，吸出培養液，加入 100µL 二甲基亞碸將藍紫色結晶溶出 均勻後，用ELISA 測吸光值。

第三章 結果與討論 3-1 有機合成結果

三甲氧基酚在實驗室之前曾嘗試用起始物在醋酸酐溶液中，先後進行

酯化反應和 Friedel-Craft acylation 再以鹼性水溶液水解酯鍵，而得到化合物 21；在本實驗中以 BF³‧OEt₂ 當溶劑當試劑，再以乙醯氯做親核性加成 (Nucleophilic addition)進而得到化合物 21 (71%)。

將化合物 21 和 4-苄氧基苯甲醛在鹼性的乙醇溶液中進行醛醇縮合

(Aldol condensation)反應，得到化合物 22 (93.6%)， 接著將化合物 22 溶於 二甲基亞碸為溶劑，以碘為催化劑，在加熱迴流的反應條件下，得到化合 物 23 (71%)。將化合物 23 在酸性條件下去 benzyl 保護，使得-OBn 水解成 -OH 取代基，得到化合物 24 (85%)。

再將化合物 24 為本實驗的衍生物的起始物，針對 B 環上 C4’的位置進

行兩個系列的取代反應。將化合物24 以二甲基亞碸為溶劑，在鹼性條件下

加入 2-溴乙醇進行取代反應，得到化合物 25 (62%)， 而化合物 29 (89%) 也在相同的鹼性反應中，加入 3-氯-1-丙醇在化合物 24 的 B 環 C₄’位置進行。

化合物 25 在三氯甲烷與二甲基甲醯胺比例 10：1 溶液的環境下加入亞 硫醯氯來進行置換反應，將羥基置換成氯，得化合物 26 (92%)，而化合物 30 (88%) 也以相同條件反應。

MeO MeO

OMe O

OR

O

氯離子是好的離去基，故此取代反應是很好進行的。得化合物 27 (95%)， 而 化合物 31 (95%)也以相同條件反應進行之。

化合物 27 以四氫呋喃為溶劑加入三苯膦和水還原疊氮分子為胺分子，

得化合物 28 (35%)，而化合物 32 (45%)也以相同條件反應進行之。在這個 反應中，也曾用氫化反應來還原，但反應效果不佳。

表一︰各類黃酮衍生物的產率及熔點

3-2 抗氧化結果

3-2.1 清除 α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力︰

DPPH 是一種安定的自由基，而掃除此自由基可用來鑑定供氫的能

力。此研究的樣品，我們以五個濃度 0.025mg/mL、0.050 mg/mL、0.1 mg/mL 、0.2 mg/mL 和 0.4 mg/mL 的濃度來做此測試。在這測試中我們發 現，九個樣品對於清除 DPPH 這安定自由基的效果遠不如 trolox(0.050 mg/mL)掃除自由基的能力。由此結果可推論這九個樣品在結構上羥基的數 目不多，所以能提供氫的能力就比不上 trolox。

N N O₂N

O₂N

NO₂

DPPH

表二︰化合物24 到 32 對清除 DPPH 自由基的能力 R

濃度 ( mg/mL ) 樣品 清除率(%)

0.025 0.05 0.1 0.2 0.4

-H 化合物24

10.4 11.6 8.6 12.1 7.0 -CH₂CH₂OH 化合物25

8.6 6.5 9.3 9.6 4.6 -CH₂CH₂Cl 化合物26

5.9 2.7 1.8 7.0 5.8 -CH2CH2N3 化合物27

2.5 1.2 0.7 1.2 0.0 -CH₂CH₂NH₂ 化合物28

-1.3 -3.0 0.0 0.4 1.5 -CH₂CH₂ CH₂OH 化合物29 11.4 5.5 6.1 6.1

5.8

-CH2CH2 CH2Cl 化合物30 5.9 7.3 7.6 5.5 5.2 -CH2CH2 CH2N3 化合物31 8.0 11.4 8.4 5.5 6.8 -CH₂CH₂ CH₂NH₂ 化合物32 8.0 7.9 9.5 7.9 6.8

trolox 79.7

MeO MeO

OMe O

OR

O

O H₃C

CH₃ CH₃ HO

CH₃ OH O Trolox

化合物29 至 32 對 DPPH 自由基清除率

0.0 4.0 8.0 12.0

0.025 0.050 0.100 0.200 0.400

濃度 (mg/ml) 清

除 率 (%)

化合物 29 R=C3H7O

化合物 30 R=C3H6Cl

化合物 31 R=C3H6N3

化合物 32 R=C3H8N

圖九︰化合物24 至 28 對 DPPH 自由基清除率

化合物

-4.0 0.0 4.0 8.0 12.0 16.0

0.025 0.050 0.100 0.200 0.400

濃度 (mg/ml) 清

除 率 (%)

化合物 24 R=H

化合物 25 R=C

H

O

化合物 26 R=C

H

Cl

化合物 28 R=C

H

N 化合物 27

R=C

H

N

3-2.2 Trolox 當量的抗氧化能力 (TEAC)

TEAC 是測總酚抗氧化能力的一種自由基的測定。而清除此自由基可以 用來鑑定待測物本身電子轉移的能力。ABTS‧⁺它本身會有深藍綠的顏色產 生。當樣品若有掃除ABTS‧⁺ 陽離子自由基的能力時，其就會抑其顏色的 吸收。在這試驗中同樣也是以0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL 和 0.4 mg/mL 這五個濃度來做測試。大部份樣品的清除率會隨濃度

的增加而有增加的趨式。在這九個樣品中以化合物 24 及 32 的清除率在高 濃度(0.4 mg/mL)時與 trolox(0.05 mg/mL)有相當的清除能力。這也說明了此 兩種化合物的電子轉移能力比其他樣品好；而含有氯原子的化合物會在高 濃度(0.4 mg/mL)時有沉澱物的析出而使得穿透度不夠，其抑制率是呈現負 值的。

N S

N N N

S O₃S

SO₃ C₂H₅ C₂H₅

+ antioxidant - K₂SO₅

N S

N N N

S O₃S

SO₃ C₂H₅ C₂H₅

ABTS ABTS^2-

表三︰化合物24 到 32 對清除 TEAC 自由基的能力 R

濃度(mg/mL) 樣品 清除率(%)

0.025 0.05 0.1 0.2 0.4

-H 化合物24 59.513 70.624 78.387 79.909 79.604 -CH₂CH₂OH 化合物25 -6.393 -2.283 1.370 10.654 29.376 -CH₂CH₂Cl 化合物26 -2.740 0.761 -0.152 10.502 -64.384 -CH2CH2N3 化合物27 4.414 4.871 14.155 27.245 52.055 -CH₂CH₂NH₂ 化合物28 2.283 3.957 5.632 9.132 18.721 -CH₂CH₂CH₂OH 化合物29 -18.721 -12.938 -4.414 2.892 18.113

-CH2CH2CH2Cl 化合物30 -4.414 -5.479 11.416 16.591 -120.852 -CH2CH2CH2N3 化合物31 -9.893 -9.132 0.609 11.872 22.831 -CH₂CH₂CH₂NH₂ 化合物32 6.393 17.656 44.597 70.167 76.865

trolox 80.974

MeO MeO

OMe O

OR

O

O H₃C

CH₃ CH₃ HO

CH₃ OH O Trolox

化合物24 至 28 對 TEAC 的清除率

-100.0 -50.0 0.0 50.0 100.0

0.025 0.050 0.100 0.200 0.400

濃度(mg/ml) 清

除 率 (%)

化合物25 R=C2H5O

化合物26 R=C2H4Cl

化合物28 R=C2H6N 化合物24

R=H

化合物27 R=C2H4N3

圖十一︰化合物24 至 28 對 TEAC 自由基清除率

化合物29 至 32 對 TEAC 的清除率

-150.0 -100.0 -50.0 0.0 50.0 100.0

0.025 0.050 0.100 0.200 0.400

濃度(mg/ml) 清

除 率 (%)

Trolox 化合物29

R=C3H7O

化合物30 R=C3H6Cl

化合物31 R=C3H6N3

化合物32 R=C3H8N

3-2.3 抑制 liposome 脂質過氧化試驗

脂質在體內受到自由基的攻擊後會產生丙二醛 (malondialdehyde)，而 這最終產物是一具有兩個醛基的高活性化合物。可與蛋白質酵素或核酸分 子中的胺基反應形成附加物，導致身體機能變異，其長期累積在體內易造 成身體的傷害。⁽⁸⁾在此脂質氧化試驗中，我們以五個濃度0.012mg/mL、0.025 mg/mL、0.05mg/mL 、0.1 mg/mL 和 0.166 mg/mL 的濃度來做測試。在這 測試中我們發現，九個樣品對於抑制 liposome 脂質過氧化試驗的效果皆很

弱。根據文獻指出，類黃酮結構在 A 環上具有鄰位的二個甲氧基或三個甲

氧基存在時，對抑制脂質過氧化是沒有效果的。⁽²⁸⁾

表四︰化合物24 到 32 對抑制脂質過氧化的能力 R

濃度(mg/mL) 樣品 清除率(%)

0.012 0.025 0.05 0.1 0.166

-H 化合物24 -56.176 20.392 -6.667 -36.176 39.118 -CH₂CH₂OH 化合物25 -32.745 3.431 40.686 -40.490 55.392

-CH₂CH₂Cl 化合物26 -36.176 -48.333 -59.608 -3.333 5.588 -CH2CH2N3 化合物27 -27.843 -26.176 -32.451 -41.667 -19.314 -CH₂CH₂NH₂ 化合物28 -41.569 -21.373 -0.784 -30.882 -4.804 -CH₂CH₂CH₂OH 化合物29 -17.745 -26.373 -34.706 -23.922 -19.412

-CH2CH2CH2Cl 化合物30 -31.471 19.314 -9.706 -24.216 -40.098 -CH2CH2CH2N3 化合物31 -37.353 -8.922 -26.275 -17.157 17.451 -CH₂CH₂CH₂NH₂ 化合物32 -23.824 -0.098 -10.686 -26.765 51.765

trolox 86.176

MeO MeO

OMe O

OR

O

O H₃C

CH₃ CH₃ HO

CH₃ OH O Trolox

化合物29 至 32 對抑制脂質過氧化能力

-50.000 0.000 50.000 100.000

0.012 0.025 0.0

5

0.1 0.166

濃度(mg/ml) 抑

制 率 (%)

化合物 29 R=C3H7O

化合物 30 R=C3H6Cl

化合物 31 R=C3H6N3

化合物 32

R=C3H8N Trolox

圖十三︰化合物24 至 28 抑制脂質過氧化的能力

圖十四︰化合物29 至 32 抑制脂質過氧化的能力

化合物24 至 28 對抑制脂質過氧化能力

-100.000 -50.000 0.000 50.000 100.000

0.012 0.025 0.05 0.1 0.166

濃度(mg/ml) 抑

制 率 (%)

化合物25 R=C2H5O

化合物26 R=C2H4Cl

化合物28 R=C2H6N 化合物27

R=C2H4N3

Trolox 化合物24

R=H

3-3 酪胺酸酶抑制結果

皮膚變暗、變黑主要原因是皮膚內層的黑色素(melanin)發生聚合所引 起的。其黑色素的形成是在酪胺酸的存在下，先經酪胺酸酶的催化形成dopa 再經一系列酵素催化而形成。而酪胺酸酶是一種含銅的酵素；是此過程的 速率決定因子。如圖十三所示。若能抑制酪胺酸酶的氧化作用即能防止黑 色素形成。⁽²⁹⁾在此實驗中我們以濃 度0.02 mg/mL、0.06 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL 和0.20 mg/mL 這五種濃度來測定樣品的抑制率。其中 有三個化合物25、27和28的抑制率約在30%以上，分別是在R基上接兩個碳 的衍生物。

圖十五︰黑色素的形成

MeO MeO

OMe O

OR

O

表五︰化合物24 到 32 對酪胺酸酶抑制的能力

維他命C 是市面普遍用來美白的化合物之一﹔此實驗中只含有 DMSO 的控 R

濃度 ( mg/mL ) 樣品 清除率(%)

0.020 0.060 0.100 0.150 0.200

-H 化合物 24 -19.8 3.6 13.6 18.3 29.6

-CH2CH2OH 化合物 25 -4.5 2.0 12.3 25.8 34.9 -CH₂CH₂Cl 化合物 26 -17.9 -36.0 -47.1 -62.2 -100.5 -CH₂CH₂N₃ 化合物 27 -48.3 -23.8 -5.7 23.4 34.9 -CH2CH2NH2 化合物 28 -5.7 3.2 17.2 28.3 39.7 -CH2CH2CH2OH 化合物 29 -40.2 -26.0 -14.3 0.9 29.9

-CH₂CH₂CH₂Cl 化合物 30 -42.17 -43.83 -52.49 -41.99 -57.04 -CH₂CH₂CH₂N₃ 化合物 31 -35.78 -24.15 -24.67 -13.56 9.97 -CH₂CH₂CH₂NH₂ 化合物 32 -37.71 -33.86 -11.64 4.99 12.07

維他命C 9.62 20.21 60.63 87.49 88.10

O HO OH

O

OH OH

vitamin C