儀器設備

電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技) 超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE)

震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 (SCIENTIFIC INDUSTRICS) 水平式電泳槽 MJ-105 (MEDCLUB)

- 16 -

往復式恆溫水槽 B206-T1 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

恆溫式震盪培養箱 B206 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY)

核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)

電磁式奈米級偵測儀 ND-1000 (博克科技有限公司)

分光光度計 20GENESYS (SPECTRONIC INSTRUMENTS) PCR溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD)

梯度核酸增值儀 labcycler (SENSOQUEST)

微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.) 微量冷凍高速離心機 centrifuge 5415R (eppendorf)

桌上型低溫高速離心機 centrifuge 5804R (eppendorf)

桌上型高速離心機 KUBOTA 5100 (KUBOTA CORPORATION) 4 °C三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON)

-20 °C直立冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE)

-80 °C超低溫冷凍櫃 925/926 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 無菌操作台 VCM-420 (造鑫)

倒立相位差螢光顯微鏡 TE2000-U (Nikon) 數位相機 C-5050ZOOM (OLYMPUS)

脈衝器 Micro pulser^TM 411BR 0897 (BIO-RAD) 雜交連結器 (UVITEC)

- 17 -

- 18 -

3.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 3.4.1 Fermentas Taq DNA polymerase

在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: 0.3～0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X Taq buffer (-MgCl₂) 5 μl、25 mM MgCl₂ 4 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1 unit Taq DNA polymerase，補無菌 二次水至總體積 50 μl。

3.4.2 DreamTaq^TM DNA polymerase

在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: 0.3～0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X DreamTaq^TM buffer 5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1.25 unit DreamTaq^TM DNA polymerase，補無菌二次水至 總體積 50 μl。

3.4.3 TaKaRa Ex Taq^TM

在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: ＜0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X Ex Taq buffer 5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1.25 unit Taq DNA polymerase，補無菌二次水至總體積

- 19 -

- 20 -

3.8 白色念珠菌勝任細胞的轉型 (Transformation) 3.8.1 白色念珠菌勝任細胞的製備

3.8.2 電穿孔 (Electroporation）

在預冷的無菌 1.5 ml 微量離心管中混合 40 μl 白色念珠菌之勝 任細胞和 1 μg 的 DNA 片段，稍作混合後加入預冷的 cuvette 中 (電穿孔專用，0.2 cm)，靜置於冰上 5 分鐘。用試鏡紙擦拭電極處之 水珠後，以 1.8 kV 進行電穿孔，之後在 cuvette 中加入 1 ml 冰的

- 21 - 序 cloning 接進 SAT1 flipper cassette 上下游的 multiple cloning site。

如圖一所示，而後將帶有目標基因上下游片段的 SAT1 flipper cassette 利用限制酵素 Kpn I 及 Sac I 由質體上切下，利用電穿孔的方式轉 型至白色念珠菌野生株中。送入的片段利用目標基因上下游同源的區 域進行同源重組置換 (homologous recombination)，將目標基因以

- 22 -

SAT1 flipper cassette 取代，接著藉由藥物 nourseothricin 篩選出帶有 SAT1 flipper cassette 的菌株。再將篩選到的菌株培養在 YP/maltose 培養液中進行 pop-out，達到基因剔除的目的。三日後抽取菌株 genomic DNA，以 PCR 確認是否得到預期菌株後，藉由複製平皿培 養法 (replica plating)，排除部分未將 SAT1 flipper cassette 剔除的菌 株，再一次抽取菌株 genomic DNA，並且再以 PCR 確認菌株內的 構築符合預期，如此即獲得不帶有 SAT1 flipper cassette 的單套基因 剔除株 (heterozygous strain)。之後即可重複使用 SAT1 flipper cassette 將另一個 allele 作剔除，得到雙套基因剔除株 (homozygous strain)。

3.12 建構白色念珠菌單套基因回復株 (rescued strain)

建構目的是當基因剔除株對於白色念珠菌性狀有影響，單套基因 回復株可以作為反證的對照組。方法為建構一 SAT1 flipper cassette 上游帶有目標基因 ORF 完整序列，以及 cassette 下游帶有目標基因

- 23 - 微量離心管中，加入等體積的 phenol，vortex 30 秒。離心 15700 xg、

4 °C、10 分鐘後取 200 μl 上清液移入新的 1.5 ml 微量離心管中， Taq^TM DNA polymerase system。

在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: ＜0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X Ex Taq buffer 5 μl、2.5 mM

- 24 -

- 25 -

接著將 membrane 換至已預熱的 high stringency buffer (0.5X SSC，

0.1% SDS)，65 °C、60 rpm 平面震盪 15 分鐘，重複此步驟一次。

 免疫偵測 (Detection)

將 membrane 浸入 washing buffer 中，60 rpm 平面震盪 5 分鐘。

接著將 membrane 浸入 1X Blocking buffer 中 以 60 rpm 平面震盪 2~3 小時。配製 Antibody buffer，將 Antibody (Roch, Anti-DIG-AP) 4 °C、10000 rpm 離心 5 分鐘，以 1 μl Antibody 加 10 ml 1X

Blocking buffer 的比例混合均勻。將 membrane 移入 Antibody buffer 中，以 60 rpm 平面震盪 30 分鐘。接著將 membrane 浸入 washing

- 26 -

3.15 突變株之性狀分析 (Characterization) 3.15.1 不同葡萄糖濃度之環境生長情形

3.16 CLSI Broth Microdilution Method 3.16.1 藥盤配製

首先將實驗所需的藥物 amphotericin B、miconazole 及

fluconazole 溶於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO) 中，而後使用 RPMI 1640 的培養基來稀釋藥物配成本實驗使用最高藥物濃度的二

- 27 -

倍濃度：fluconazole (128 mg/l)、amphotericin B (32 mg/l) 及

miconazole (4 mg/l)。接著將每一種藥物進行序列稀釋，最終配成十個 濃度，藥物範圍分別是 Fluconazole (0.25~128 ug/ml)，Amphotericin B (0.0625~32 ug/ml)，Miconazole (0.0078~4 ug/ml)。分別在 96 孔盤第 一到第十個孔盤加 100 μl 的藥物，第十一個孔盤加入 100 μl RPMI 1640 (之後加菌液做對照組)，第十二個孔盤加入 200 μl RPMI 1640 作為控制組 blank (此孔盤不加菌液)。

3.16.2 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 偵測各突變株 之藥物感受性實驗

根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute) 所建議的 M27-A3 的修編版本進行實驗 (CLSI, 2008)。配製適量 RPMI 1640 broth、無菌 0.85 % NaCl，置於 1 L 的 血清瓶中，並裝上分注器置於 4 °C 冰箱中備用。

 DAY 1: 自-80°C 冰箱取出本實驗中之 mutant strains

(Heterozygous、Homozygous、Rescued strains)、wild-type strain

(SC5314)、negative control (HLC54)，以及控制組 YLO6 (ATCC® 6258)，

YLO7 (ATCC® 22019)，YLO12 (ATCC® 90028)。用滅菌之竹籤挖取 少許菌液，塗抹在 SDA 培養基，溫度 35 °C 培養 24 小時。準備所

- 28 - microplate reader 的電源，點選電腦桌面程式 20120416 bio-rad

protein assay dye 595nm ，開啟視窗後，點選 read new plate，再點選

3.17 Agar dilution test

 DAY1：將所有試驗菌株從凍管劃在 SDA plate 上，溫度 30℃，

培養 18 ~ 24 小時。

- 29 -

 DAY2：將所需要的藥物濃度之 SD (含 2% Glucose) plate 配好後 放置於室溫下待使用。準備含有 2 ml 滅菌 0.85 % NaCl 之玻璃試管，

利用竹籤挖取菌體至 0.85 % NaCl 中並稀釋 100 倍測 OD₆₀₀值，將 菌量調整至 OD₆₀₀ 值為 0.2 (菌量過多再加 0.85 % NaCl 稀釋)，此 調完之菌即為 agar dilution 最高濃度的菌量。將調好 OD₆₀₀ 值 0.2 的菌液做十倍序列稀釋連續三次後可得到每株菌的四種濃度。將 Agar dilution 的裝置架設好後，在每排加入 300 ul 的菌液，因此每 排會有一株菌之四種濃度的菌液，經推算後約為 10⁴、10³、10²、10 四 種不同菌量。操作裝置將菌液複印在含有藥物之 SD plate 上，待表 面菌液乾後放置至 30℃ 培養箱培養 24 ~ 72 小時，每天拍照觀察。

 DAY3 ~ DAY5：拍照觀察。

- 30 -

四、結果

4.1 建構 CaCDR3 單套、雙套基因剔除株和單套基因回復株 4.1.1 建構基因剔除所需含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及

CaCDR3 上下游同源區域之質體 pSAT1-CDR3-A1B1 及質 體 pSAT1-CDR3-A2B2

本實驗針對剔除白色念珠菌雙套 CaCDR3 基因，設計了兩組不 同的質體 pSAT1-CDR3-A1B1 及 pSAT1-CDR3-A2B2 分別做念珠菌 的兩個 allele 的基因剔除，其原因為使用質體 pSAT1-CDR3-A1B1 域之質體 pSAT1-CDR3-A1B1

以白色念珠菌野生株 SC5314 genomic DNA 作為模板

pSAT1-CDR3-A1。如圖四<A>所示，將質體以限制酶 BspH I 做質體 確認，預期會得到片段 4162 bp、 2400 bp 和 1008 bp；電泳圖結果 所示，NC (pSFS2-SAT1) 有得到符合預期約 4.2 kbp (4162 bp)、1.9 kbp 及 1 kbp (1008 bp) 三個片段。而 Lane 3 和 Lane 7 在 4 kbp 上 方、2.5 kbp 下方及 1 kbp 處各有一條片段，將所得質體命名為 pSAT1-CDR3-A1。下游片段同樣以 PCR 方式，利用分別帶有限制酶

- 31 - 方各有一條合乎預期之片段。將此質體命名為 pSAT1-CDR3-A1B1。

4.1.1.2 建構含 SAT1 flipper cassette 及 CaCDR3 上下游同源區 域之質體 pSAT1-CDR3-A2B2

同建構 pSAT1-CDR3-A1B1 之方法，將上游片段利用帶有限制

- 32 -

期會得到片段 3964 bp、3364 bp 及 468 bp；如圖五<B>之電泳圖結 果所示，NC (pSAT1-CDR3-A2) 有得到符合預約 4.0 kbp (3964 bp)、

3.4 kbp (3364 bp) 及 0.24 kbp (236 bp) 三個片段 Lane 1、2、3、5 皆 在 4 kbp 下方、3 kbp 上方及在 500 bp 下方各有一條合乎預期之片 段。將此質體命名為 pSAT1-CDR3-A2B2。

4.1.2 建構基因回復株所需含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaCDR3 完整基因之質體 pSAT1-CDR3-RESA1B1-B1 利用質體 pSAT1-CDR3-A1B1 將其 A1 region 置換成 CaCDR3 完整基因片段來建構回復株之質體。首先以白色念珠菌野生株

SC5314 genomic DNA 作為模板 (template)，利用前端已加入限制酶 切位利 Kpn I 和 Xho I 的引子 CDR3-RES-F 及 CDR3-RES-R 得 上游並且在正確的位置上。如圖七<B>定序結果顯示，CDR3 RES 有 正確連結質體 pSFS2-SAT1 的預期區域，但在 + 83 位置有點突變

- 33 - SAT1 flipper cassette 的 pop-out，三天後萃取 genomic DNA，依圖十 五<A>所示利用引子 CDR3-A2-F 和 CDR3-B1-R 進行 PCR 確認。

若有成功剔除一股 CaCDR3 基因，預期會得到片段 2235 bp、1681 bp。

為了排除在 YP maltose 的菌液中部份仍還帶有 SAT1 flipper cassette 的菌株，會再利用方法 3.10 將上述 PCR 結果合乎預期的菌株稀釋 塗於 YPD 培養基進行 replica plating，藉以挑選出將 SAT1 flipper cassette pop-out 之菌株。選擇只生長於不含 nourseothricin 培養基的 菌落，進行存菌並和萃取 genomic DNA。依圖十五<A>所示同樣再 使用引子 CDR3-A2-F 和 CDR3-B1-R 進行 PCR 確認。以圖十五

- 34 -

B2 region 片段的質體利用膠上純化的方式得到，以電穿孔的方式送 入 CaCDR3 單套基因剔除株 C3HE-6 中。透過相似序列同源重組置 換 (homologous recombination) 的機制再以含藥物 nourseothricin 的 YPD 培養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。再挑選 single plating，藉以挑選出將 SAT1 flipper cassette pop-out 之菌株。選擇只 生長於不含 nourseothricin 培養基的菌落，進行存菌並和萃取 換 (homologous recombination) 的機制再以含藥物 nourseothricin 的 YPD 培養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。培養至 YPD 培 養液中 16 ~ 18 小時，萃取 genomic DNA ，之後利用南方點墨法進 行菌株確認。

- 35 -

其餘 C3HE-2、C3HE-3、C3HE-5 雖有預期片段但仍有其餘非預期片 段產生。而第二組使用限制酶酵素 EcoR V / BspE I 之結果圖十七

<B>示意圖所示，預期 wild-type 得到 2893 bp 的片段；而用 A1、 B1 region 之 CaCDR3 剔除 allele 則預期會有 2311 bp 的片段，結果圖 十七<B> 底片圖所示 wild-type 有得到在 3 kbp 下方的預期片段；

而在 C3HE-2、C3HE-3、C3HE-5、C3HE-6 皆有得到分別於 3 kbp 下 方以及 2.5 kbp 下方之兩條預期片段。選用兩組酵素確認皆正確之

- 36 -

C3HO-6-3 (-1 及-2)、C3HO-6-6、C3HO-6-7 及 C3HO-6-15 如同第一 組酵素，除了 C3HO-6-7 之外其餘皆得到符合預期於 2.5 kbp 下方以

- 37 -

- 38 - bp 及 688 bp；如圖九<B>之電泳圖結果所示，NC (pSAT1-HGT1-A) 有得到符合預期之 3964 bp、3105 bp 及 236 bp 三個片段。而 Lane 1 ~ Land 10 皆在 4 kbp 處、 3 kbp 上方及在 1 kbp 和 0.5 kbp 間各 有一條合乎預期之片段。此質體命名為 pSAT1-HGT1-AB。

4.2.2 建構基因回復株所需含篩選標記 SAT1 flipper cassette 及 CaHGT1 完整基因之質體 pSAT1-HGT1- H1RES-B

利用質體 pSAT1-HGT1-AB 將其 A region 置換成 CaHGT1 完

- 39 -

1580 bp；電泳圖結果所示，NC (pSAT1-HGT1-AB) 得到符合預期約 4kbp (3964 bp) 及 3.8 kbp (3793 bp) 兩個片段。而除了 Lane 4 之外，

其餘皆在 4 kbp 下方及 1.5 kbp 上方處各有一條符合預期之片段，

將所得質體命名為 pSAT1-HGT1-H1RES-B。之後再利用定序作分 析。

4.2.3 回復株質體 pSAT1-HGT1-H1RES-B 之序列分析

如圖十一<A>所示，利用引子 H1seq1、H1seq2、H1seq3 及 H1seq4 進行定序分析，確認 HGT1 RES 是否有成功接合進 SAT1 flipper cassette 上游並且在正確的位置上。如圖十一<B>定序結果及 圖十一<C>結果總表顯示，HGT1 RES 有正確連結質體 pSFS2-SAT1 的預期區域，但在 + 150 位置有點突變 T  C，並且胺基酸由 Ser  flipper cassette 的 pop-out，三天後萃取 genomic DNA，如圖二十一

- 40 -

nourseothricin 培養基的菌落，進行存菌並和萃取 genomic DNA。同 樣再使用引子 HGT1 pre-A 和 HGT1-B-R 進行 PCR 確認。以圖二 (homologous recombination) 的機制再以含藥物 nourseothricin 的 YPD 培養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。再挑選 single

藉以挑選出將 SAT1 flipper cassette pop-out 之菌株。選擇只生長於不 含 nourseothricin 培養基的菌落，進行存菌並和萃取 genomic DNA。

同樣使用引子 HGT1 pre-A 和 HGT1-B-R 進行 PCR 確認。如圖二

- 41 -

(homologous recombination) 的機制再以含藥物 nourseothricin 的 YPD 培養基篩選帶有 SAT1 flipper cassette 之菌株。培養至 YPD 培

- 42 -

- 43 -

CaHGT7 上下游同源區域之質體 pSAT1-HGT7-AB

CaHGT7 上下游同源區域之質體 pSAT1-HGT7-AB