一、 緒論
1.2 白色念珠菌型態轉變與致病力之關聯
一、 緒論 1.1 白色念珠菌 (Candida albicans)
白色念珠菌是人體內常見的共生菌叢，屬二倍體 (diploid) 伺機 型的真菌 (Magee, 1998)，在正常的人體內會少量存在於口腔、皮膚、
消化道及生殖道黏膜 (Joon Kim and Peter Sudbery, 2011；Odds, 1988)。
在美國，有 30% ~ 55% 健康的年輕成人口腔中會發現念珠菌的存在。
當人體免疫力下降時，白色念珠菌就有機會侵入人體並造成嚴重且全 面性的感染 (Joon Kim and Peter Sudbery, 2011；Odds, 1988)。在美國 的統計中，全身性系統感染的病人其血液中分離出的病原結果，白色 念珠菌位居第四位 (Pfaller et al., 2007；Rangel-Frausto MS et al., 1999) 。而在 HIV 的感染患者中，有 90 % 以上的病人在口腔黏膜 中有白色念珠菌的發現 (Repentigny L et al., 2004)。雖然目前臨床上 已有許多抗真菌藥物並且有良好的抑菌效果；但因為藥物的濫用，真 菌的抗藥性也隨之產生，造成治療效果不佳 (Cannon et al., 2007；
Ghannoum and Rice, 1999)。因此希望能研究出與白色念珠菌毒性或抗 藥性有關的基因，可找出藥物的作用標的或將抗藥性的現象改善，做 為日後治療上能夠發展的方向。
1.2 白色念珠菌型態轉變與致病力之關聯
白色念珠菌有三種型態：酵母菌型 (yeast form)、假菌絲型 (pseudohyphae form) 及菌絲型 (hyphae form)。其三種型態在特定環 境條件下可以互相轉換 (Berman and Sudbery, 2002)。目前已知能夠刺 激菌絲生成的因素包括：營養源、CO2、細胞密度及黏附情形 (Biswas and Van Dijck et al., 2007)、 N-acetylglucosamine (GlcNAc) (Mattia et al., 1982)、pH 值 (Brown and Gow, 1999)、溫度、血清 (Gow and Gooday, 1982) 等，而在實驗上則會利用培養基中添加血清、環境中 性及溫度 37 ℃ 的環境下誘導菌絲的生成 (Berman, 2006；Yang, 2003)。目前對於白色念珠菌型態轉變的機制尚未完全了解，而文獻 研究中對於其中的三條調控路徑有較多且較清楚的研究，包括兩條正
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調控路徑 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway 和 cAMP-PKA pathway 及一條負調控路徑 Tup1 pathway (Biswas and Van Dijck et al., 2007)，其調控機制示意圖如附錄一所示。
B. cAMP signaling pathway，
cAMP-PKA pathway 主要包括細胞膜上的 receptor Mep2 及 Gpr1，下游基因 Gpa2、Ras1、Cdc34、cAMP-dependent protein kinase A (PKA) ……等直到下游的轉錄因子 Efg1 ；路徑中可受一 些外在環境訊號 (pH 值、CO2含量、營養源) 所刺激，而路徑中 基因的活化或抑制，皆能調控細胞由酵母菌型及菌絲型之間的轉 變。此路徑目前被認為是調控白色念珠菌型態轉變的主要路徑，
原因為此路徑的基因突變株的性狀改變比 MAPK 路徑的基因突 變株較明顯 (Brown et al., 2007；Dieterich et al., 2002；Lo et al., 1997) 。文獻中，白色念珠菌 Efg1 的雙套剃除株在添加血清的 培養條件下依然缺少菌絲生成的能力 並且對於小鼠的毒性及致 病力大幅下降 (Sonneborn et al.,2000；Lo et al., 1997)。
C. Tup1 pathway，
此路徑是第一個被定義為對於白色念珠菌的菌絲生成呈現 負調控的路徑 (Burkhard R. et al., 2000；Braun an Johnson, 1997) 。
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在剔除 Tup1 雙套基因的白色念珠菌發現正常應該停留在酵母 菌型態的情況下，卻會出現菌絲的生長的情況，同時亦對小鼠毒 性降低。而目前研究上認為 Nrg1 及 Rfg1 跟 Tup1 之間的作 用很有相關性，會與 Tup1 形成 co-regulation 的現象 (Kadosh and Johnson, 2005；Braun et al., 2001)。
1.3 抗真菌藥物及抗藥機制
由於真菌為真核生物，因此在抗真菌藥物的使用上也容易會對 人體產生傷害或是許多的副作用 (Rex JH et al., 2001；Dismukes WE., 2000；Georgopapadakou NH et al., 1994) 。抗真菌藥物的種類有限，
加上臨床治療上過度頻繁的使用，無形中篩選出對於藥物具有抗性的 菌株或由於真菌長期暴露在藥物下而透過 genetic drift、recombination 及 migration 逐漸產生了抗性 (Leah E. Cowen et al., 2002；Levin BR 床使用上屬本類的藥物為 amphotericin B。本類藥物的作用機制 為藥物與細胞膜上的 ergosterol 結合後嵌入真菌的細胞膜中，使 細胞膜上形成孔洞造成細胞內外離子濃度不平衡而使細胞死亡 (White T.C. et al, 1998；Vanden Bossche et al., 1994)。
B. Azoles。
此類為抑真菌之藥物，其作用標的是阻斷麥角固醇
(ergosterol) 生合成的酵素。本類藥物又分兩小類：imidazoles (例 如：ketocnazole、miconazole) 及 triazoles (例如：fluconazole、
voriconazole)。例如 fluconazole 的藥物作用機制是利用抑制屬 cytochrome P450 酵素中的 lanosterol demethylase，此酵素是真菌 合成細胞膜上 ergosterol 路徑中所需的，並且缺少此酵素後所形
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成之中間產物亦對細胞有毒性，會造成細胞膜的破壞 (Lamb D. et al., 1999；Sanglard D. et al.,1998)。本類藥物在臨床上廣泛的被使 用且目前也有許多人致力於此類抗真菌藥物的研究及發展
(Sheehan D.J. et al., 1999；Georgopapadakou N.H., 1998)。
1.4 HGT family。
葡萄糖在生物界被認為是最主要的碳來源及能量來源並且參與 了許多代謝的過程。而對於白色念珠菌而言，葡萄糖被認為與菌絲的 生成有相關性，能夠促使白色念珠菌由酵母菌型轉變為菌絲型，可以 調控細胞的基因表現 (Victoria Brown et al., 2006；Hudson et al., 2004)。
另外，葡萄糖同時也與 pH 的調節以及 germ tube 的生成有關 (Paranjape and Datta, 1991)。而在文獻中，負責傳送葡萄糖的 transporter 也被認為具有潛力夠發展成為與抗真菌藥物結合的作用 標的，作為開發抗真菌藥物發展的一個新方向 (Fan. J et al., 2002) 。 目前在白色念珠菌中被認為與葡萄糖傳送相關基因有 20 個，組成 HGT (High Glucose Transporter) family，此家族中每個基因之間的 ORF (open reading frame) 相似度由 10 ~ 90 % 不等，而這 20 個基 因 (HGT1 ~HGT20) 利用 Phylogenetic Analysis 又可分成三個 subfamilies，而這些 subfamilies 作用的不同推測可能與環境中的葡 萄糖的濃度有相關性 (Fan. J et al., 2002)。另外也有文獻指出白色念 CaSAT1，此基因可以轉譯出酵素 streptothrin acetyltransferase，此酵
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素可使藥物 Nourseothricin 失去活性，在此處作為藥物篩選標記；此 外，由 MAL2 promoter 所調控的 CaFLP，當將培養基中將碳源換成 maltose 後可誘發 MAL2 promoter 表現基因 CaFLP，產生酵素 site-specific recombinase。此酵素可辨認結合到 cassette 兩端的 FRT (minimal FLP recombination target sequence) 序列，進行 site-specific recombination 將 cassette 剔除出 genome 中 (以下將此機制稱為 HLC54 (efg1/efg1 cph1/cph1) 兩者之間表現量有差異的基因，而本篇 研究的基因 CaCDR3、CaHGT1 及 CaHGT7 即為結果中發現表現量
因此將 CaCDR3 歸類於 CDR (Candida Drug Resistance) family
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中，被認為或許與白色念珠菌的抗藥機制相關 (Balan I, et al., 1997)。
而目前已知 CaCDR3 屬 Pdrp/Cdrp family 且為 ATP-binding cassette (ABC)。目前文獻中發現，在 CAI4 的菌株
(Genotype : ura3::imm434/ura3::imm434 iro1/iro1::imm434) 中對 CaCDR3 做雙套剔除後，對於細胞型態、生長速率以及對藥物 fluconazole 的感受性並無明顯差異 (Balan I, et al., 1997)。
1.6.2 白色念珠菌 CaHGT1 及 CaHGT7 基因之相關探討
CaHGT1 及 CaHGT7 皆屬於 HGT (High Glucose Transporter) family 中的基因，皆與葡萄糖的傳送相關。由於其家族中有部分的 基因 ORF 相似度極高，如圖八<A>所示，因此在本實驗中的同源 位置設計將此兩基因設計在 ORF 外，而基因剔除流程圖則由圖八
<B> 所示。然而，目前對於 CaHGT1 的文獻中發現 CaHGT1 基 因表現量受 progesterone 及藥物 cycloheximide、hloramphenicol、
benomyl 而增加 (Varma A, et al., 2000)。另外，對於基因 CaHGT7 (Alias：CaHXT3
、
CaHXT62、
CaHXT61) 基因的研究，發現其表現 量會受 glucose、 fluconazole、Snf3p 刺激而增加，並且在 biofilm 中表現量也提升，而在單套剔除此基因的白色念珠菌中，對於 Amphotericin B 的抗性降低 (Xu D, et al., 2007；Copping VM, et al., 2005；Garcia-Sanchez S, et al., 2004)。- 7 -
二、材料與儀器 2.1 菌株 (Strain)
(1) Escherichia coli：DH5α (2) Candida albicans：
菌株 (Strain)
SC5314 SC5314 Wild-type strain Gillum et al., 1984 HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 Lo et al.,1997 C3HE-6
C3Res2 cdr3::FRT /cdr3::CDR3 本實驗 H1HE-4
H1Res2 hgt1::FRT /hgt1::HGT1 本實驗 H7HE-3
H7Res2 hgt7::FRT /hgt7::HGT7 本實驗
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pSAT1-CDR3-RESA1B1-B1
pSAT1-CDR3-A1B1 將其中 A1 region 以 CaCDR3
(CaCDR3 gene：-49 ~ +1498) 大小為 1547 bp 的完整 ORF
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CDR3-A1-F AAAGGTACCAAGAAATGGTGCTAGTAAATGTCC KpnI
CDR3 gene：
-49 ~ -26 CDR3-A1-R TTTCTCGAGTCTTGGATGGTCTTTCTCTTGC
XhoI
CDR3 gene：
+430 ~ +451 CDR3-B1-F TTTCCGCGGCCATTCATAATTTTGGTAGAGATAC
SacII
CDR3 gene：
+1040 ~ +1064 CDR3-B1-R AAAGAGCTCGGGGGTATAATAATTGTACATACATACG
SacI
CDR3 gene：
+1262 ~ +1289 CDR3-A2-F AAAGGTACCTCTGAAAGGTGAAACTTTGGT
KpnI
CDR3 gene：
-946 ~ -926 CDR3-A2-R TTTCTCGAGAATTAGGCTGACGTAAACG
XhoI
CDR3 gene：
-462 ~ -444 CDR3-B2-F TTTCCGCGGTTGTACTCCATTGACTTATTT
SacII
CDR3 gene：
+792 ~ +813 CDR3-B2-R AAAGAGCTCTCCAAAAATTGGTTAGTCTTATCCATG
SacI
CDR3 gene：
+999 ~ +1025 CDR3-RES-F AAAGGTACCAAGAAATGGTGCTAGTAAATGTCC
KpnI
CDR3 gene：
-49 ~ -26 CDR3-RES-R TTTCTCGAGAATGGAAATTACAAGTTT
XhoI
CDR3 gene：
+1481 ~ +1498
2.3.2 針對使用 SAT1 system 踢除 CaCHGT1 所設計的引子
引子 (Primer) 序列 5’ ~ 3 位置
HGT1-A-F AAAGGTACCAGAGTGGATTCAACACTTTAT KpnI
HGT1 gene：
-245 ~ -225 HGT1-A-R TTTCTCGAGATTCGTTGAGATTATAAGTGA
XhoI
HGT1 gene：
-22 ~ -2
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HGT1-B-F TTTCCGCGGTAATTCGTTATGTGTGTAGAT SacII
HGT1 gene：
+1740 ~ +1760 HGT1-B-R AAAGAGCTCAGAAACAGGTGTTTAGTGTGGTT
SacI
HGT1 gene：
+2171 ~ +2193 HGT1-RES-F AAAGGTACCAACCCATGTAAGTCTCC
KpnI
HGT1 gene：
-101 ~ -85 HGT1-RES-R TTTCTCGAGTAACGAAAACAATACTGATAA
XhoI
HGT1 gene：
+1789 ~ +1809
2.3.3 針對使用 SAT1 system 踢除 CaCHGT7 所設計的引子
引子 (Primer) 序列 5’ ~ 3 位置
HGT7-A-F AAAGGTACCCTTTATATCGTTAGTAGTGGACA KpnI
HGT7 gene：
-460 ~ -438 HGT7-A-R TTTCTCGAGTTGACTATTCTTTTTCATTTTG
XhoI
HGT7 gene：
-177 ~ -156 HGT7-B-F TTTCCGCGGTATAACTGATACTAATTGGTA
SacII
HGT7 gene：
+1822 ~ +1842 HGT7-B-R AAAGAGCTCACCCACACAAAGCAAATA
SacI
HGT7 gene：
+2330 ~ +2347 HGT7-RES-F AAAGGTACCCCAAACTAAACTGATAATCTT
KpnI
HGT7 gene：
-478 ~ -458 HGT7-RES-R TTTCTCGAGACAAATTAAAACATAACCG
XhoI
HGT7 gene：
+1671 ~ +1689
2.3.4 篩選用引子
引子 (Primer) 序列 5’ ~ 3 位置
CDR3 pre-A TGTGCCTAGTGGATTTGGATATCC CDR3 gene：
-1168 ~ -1145 HGT1 pre-A TGCACCTGCAATCAGAAAGTCATTTCTTAC HGT1 gene：
-523 ~ -494 HGT1 pro-B CGACTAAGTTTCCGGTATTTAGGGTTCA HGT1 gene：
+2532 ~ +2559 HGT7 pre-A CACTCTACACTGCTGGTATTTCCTCAAGTC HGT7 gene：
-532 ~ -503 HGT7 pro-B CACCACTGGTGGAAAATGAGTGATAGA HGT7 gene：
+2445 ~ +2471
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2.3.5 定序用引子
引子 (Primer) 序列 5’ ~ 3 位置
C3seq1 CGCAATTAACCCTCACTAAAGGG
CDR3 gene：
-89 ~ -67 C3seq2 AAGACATTTTCGTGGTTGGCATT CDR3 gene：
+448 ~ +470 C3seq3 TGGATAAGACTAACCAATTTTTGGAT CDR3 gene：
+1001 ~ +1026 H1seq1 CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA HGT1 gene：
-308 ~ -286 H1seq2 GAAGATTATCATTATTGACTTGT HGT1 gene：
+293 ~ +315 H1seq3 ATTGGTTATGCTACTTTATTCAC HGT1 gene：
+793 ~ +815 H1seq4 TGCCATTTCCACTTCTGCTAATT HGT1 gene：
+1293 ~ +1316 H7seq1 CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA HGT7 gene：
-685 ~ -663 H7seq2 CCCCATGGCAAAATGAAAAAGAA HGT7 gene：
-185 ~ -161 H7seq3 GGTTGTGCCATTGGTGCATTATT HGT7 gene：
+316 ~ +338 H7seq4 CCTTATACCGTGAACTTCAATTAATTC HGT7 gene：
+806 ~ +832 H7seq5 CCATTGAAAGTTAGAAGTAAGGCTATGG HGT7 gene：
+1312 ~ +1339
2.4 化學藥品
Alpha Biociences Inc.: LB agar (Cat. No. L12-111)
Ameresco: Agarose (Cat. No. 0710-500G)、EDTA (Cat. No.
0105-1KG)、 Glycerol (Cat. No. 0854-1L-PTM)、Phenol (Cat. No.
0945-400ML)、Sodium chloride (Cat. No. 0241-1KG)、Tris base (Cat.
No. 0826-1KG)、Tris-hydrogen chloride (Cat. No. 0234-500G)
AppliChem: Ampicillin (Cat. No. A0839)
Difco laboratories: Bacto agar (Cat. No. 143175)、D-mannitol (Cat.
No. 217020), Nutrient broth (Cat. No. 149018)、YPD broth (Cat. No.
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235141XB)
Fluka: Maleic acid (Cat. No. 63190-1KG)
Invitrogen: Goat serum (Cat. No. 01-6201)
J. T Baker: Sodium hydroxide (Cat. No. 3722-01)、Triton X-100 (Cat.
No. X198-07)
Kodak: X-film (Cat. No. 1651454)
Merck: Sodium acetate (Cat. No. 1.06268.0250)
Protech: 100 bp DNA ladder (Cat. No. M1-100T)
Riedel-de Haёn: Chloroform (Cat. No. 32211)、Sodium dodecyl sulfate (Cat. No. 62862)
Roche: Anti-DIG-AP (Cat. No. 1093274)、Blocking reagent (Cat. No.
1096176)、 CSPD (Cat. No. 1655884)、DIG DNA labeling mix (Cat.
No. 1277065)、DIG Easy Hyb (Cat. No. 11603558001)
Scharlau: LB broth (Cat. No. 02-385)
Sigma Chemical Co.: Dithiothreitol (Cat. No. D9779)、Glassbeads (425～600 μm) (Cat. No. G9268-50G)、Lithium acetate (Cat. No.
L-6883)、Sorbitol (Cat. No. S-0900)、Tween 20 (Cat. No. p-1379)
Subenzyme: 1kb DNA ladder (Cat. No. SEM11C001)
Werner Bioagents: Nourseothricin (Cat. No. 5.1000)
景明化工: 99.5% Ethanol 2.5 酵素
Fermentas : T4 DNA Ligase (EL0011) 、Taq DNA polymerase (EP0402) 、Thermo Scientific DreamTaq DNA polymerase (EP0702)
NEB : Alf II (Cat. No. R0520)、AlwN I (Cat. No. R0514)、Ava I (Cat.
No. R0152) 、BamH I-HF (Cat. No. R3136)、Bsa I (Cat. No. R0535)、
Bsa I-HF (Cat. No. R3535)、BspE I (Cat. No. R0540)、BspH I (Cat.
No. R0517) 、Dra III-HF (Cat. No. R3510)、EcoR V-HF (Cat. No.
R3195)、Hind III (Cat. No. R0104)、Kpn I-HF (Cat. No. R3142)、
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Nco I-HF (Cat. No. R3193)、Nsi I (Cat. No. R0127)、Pci I (Cat. No.
R0655)、Sac I-HF (Cat. No. R3156) 、Sac II (Cat. No. R0157) 、Sca
3 M Sodium acetate: 40.83 g sodium acetate dissolved in ddH2O to 100 ml
1 M Dithiothreitol (DTT): 3.09 g DTT dissolved in 20 ml 0.01 M Sodium acetate, store at -20 °C
1 M Lithium acetate: 10.2 g lithium acetate dissolved in ddH2O to 100 ml (pH7.5)
Washing buffer: maleic acid buffer contained 0.3% Tween 20
10X blocking buffer: 10% (w/v) blocking reagent dissolved in maleic acid buffer
10% (w/v) SDS: 10 g SDS dissolved in ddH2O to 100 ml
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dextrose, 2% agar, 200 μg/ml nourseothricin
YPD 培養基 (含4% goat serum): 1% yeast extract, 2% peptone, 2% digest of casein, 4% dextrose, 1.5 % agar
SD 培養基: 0.67 % Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid, 2 % dextrose, 2 % agar
2.7 儀器設備
電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技) 超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE)
震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 (SCIENTIFIC INDUSTRICS) 水平式電泳槽 MJ-105 (MEDCLUB)
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往復式恆溫水槽 B206-T1 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC)
恆溫式震盪培養箱 B206 (FIRSTEK SCIENTIFIC)
迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY)
核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)
電磁式奈米級偵測儀 ND-1000 (博克科技有限公司)
分光光度計 20GENESYS (SPECTRONIC INSTRUMENTS) PCR溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD)
梯度核酸增值儀 labcycler (SENSOQUEST)
微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.) 微量冷凍高速離心機 centrifuge 5415R (eppendorf)
桌上型低溫高速離心機 centrifuge 5804R (eppendorf)
桌上型高速離心機 KUBOTA 5100 (KUBOTA CORPORATION) 4 °C三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON)
-20 °C直立冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE)
-80 °C超低溫冷凍櫃 925/926 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 無菌操作台 VCM-420 (造鑫)
倒立相位差螢光顯微鏡 TE2000-U (Nikon) 數位相機 C-5050ZOOM (OLYMPUS)
脈衝器 Micro pulserTM 411BR 0897 (BIO-RAD) 雜交連結器 (UVITEC)
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3.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 3.4.1 Fermentas Taq DNA polymerase
在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: 0.3～0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X Taq buffer (-MgCl2) 5 μl、25 mM MgCl2 4 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1 unit Taq DNA polymerase，補無菌 二次水至總體積 50 μl。
3.4.2 DreamTaqTM DNA polymerase
在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: 0.3～0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X DreamTaqTM buffer 5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1.25 unit DreamTaqTM DNA polymerase，補無菌二次水至 總體積 50 μl。
3.4.3 TaKaRa Ex TaqTM
在 200 μl 微量離心管內混合以下藥品: ＜0.5 μg template genomic DNA、50 μM primer 1 μl、10X Ex Taq buffer 5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、1.25 unit Taq DNA polymerase，補無菌二次水至總體積
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3.8 白色念珠菌勝任細胞的轉型 (Transformation) 3.8.1 白色念珠菌勝任細胞的製備
3.8.2 電穿孔 (Electroporation）
在預冷的無菌 1.5 ml 微量離心管中混合 40 μl 白色念珠菌之勝 任細胞和 1 μg 的 DNA 片段，稍作混合後加入預冷的 cuvette 中 (電穿孔專用，0.2 cm)，靜置於冰上 5 分鐘。用試鏡紙擦拭電極處之 水珠後，以 1.8 kV 進行電穿孔，之後在 cuvette 中加入 1 ml 冰的
- 21 - 序 cloning 接進 SAT1 flipper cassette 上下游的 multiple cloning site。
如圖一所示，而後將帶有目標基因上下游片段的 SAT1 flipper cassette 利用限制酵素 Kpn I 及 Sac I 由質體上切下，利用電穿孔的方式轉
如圖一所示，而後將帶有目標基因上下游片段的 SAT1 flipper cassette 利用限制酵素 Kpn I 及 Sac I 由質體上切下，利用電穿孔的方式轉