本實驗以 2500-3000 g 的紐西蘭雄性大白兔作為實驗動物，未添加 中藥骨碎補的多孔性GGT 對照組共 8 隻，分成 4 組，每組 2 隻，其中 1 組兔子頭蓋骨植入未培養間質幹細胞的多孔性GGT，另外 3 組則分別自 腸骨抽取骨髓，經培養約 2-3 週後得到足夠數量的間質幹細胞，將間質 幹細胞植入多孔性GGT 中，置入磁攪拌培養瓶(spinner flask)中進行動態 培養，在培養 1 週、2 週及 4 週時分別將含有自體間質幹細胞的多孔性 GGT 植回原兔子頭蓋骨進行體內測試。添加中藥骨碎補的多孔性 GGT 實驗組共 12 隻兔子，也分成 4 組，每組 3 隻，流程與對照組相同。
抽取兔子骨髓前須先在兔子後大腿肌，以肌肉注射方式，將兔子予 以全身麻醉。麻醉劑為全痛寧(Ketamin 10 ml/瓶 50 mg/ml，南光，台南) 及若朋(Rompun, Bayer, Germany)以 1：1 方式混合，劑量為 0.8~1.5 ml/kg，待兔子熟睡後，以電動剃毛機剃除腸骨上方兔毛，再以優碘及 70 %酒精作局部消毒後覆蓋紙洞巾，製造出一個無菌操作空間以避免汙 染。
於腸骨上方以皮下注射方式做局部麻醉，給予局部麻醉劑 Lidocaine (2 ml/瓶，10 mg/ml，林化學，台南)約 1.0~1.2 ml，待局部麻醉劑吸收後 開始抽取骨髓。抽取骨髓前須先以亞魯特注射液(Agglutex injection, Heparin Sodium 5,000 Unit/ml，中國化學，台灣)潤濕 20 ml 注射針筒內 側管壁，以免抽骨髓時產生凝血。將注射針頭沿腸骨方向刺入，抽取約
5 分鐘後抽去上清液，置入另一培養瓶進行培養，如此數次更換可將懸 浮性的造血幹細胞及血球細胞去除，而得到貼附性的初代間質幹細胞。
兔子骨髓的抽取實驗如圖3-9 所示，而實際的細胞培養情形參見圖 3-10。
初代間質幹細胞在 T-75 培養瓶中長滿後，將培養瓶自培養箱中取 出，以自動吸量管(Pipet-aid)抽除培養液，加入 5 ml 的磷酸緩衝溶液 (phosphate buffer solution, PBS, Sigma, USA)兩次予以清洗乾淨，再加入 1 ml 的 0.25 % Trypsin/EDTA (Sigma, USA)溶液，輕搖幾下使溶液均勻覆 蓋到所有細胞，置回細胞培養箱中靜置 2-3 分鐘後取出，輕拍培養瓶幾 下，於電子顯微鏡下觀察確定間質幹細胞懸浮於 Trypsin/EDTA 溶液中，
加入5 ml 間質幹細胞培養液加以稀釋，將含有細胞之培養液抽入 15 ml 離心管中，以轉速 1500 rpm，離心 5 分鐘後抽去上清液，此時視所需分 盤的數目加入適當的培養液，將離心管置於震盪器中將細胞打散均勻，
再分裝於培養瓶中，每 2-3 天更換培養液 1 次，待細胞長滿後便得到繼 代的間質幹細胞，本實驗即取第2 代或第 3 代的間質幹細胞作為實驗材 料。
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
圖3-9 抽取兔子骨髓的程序，(A)全身麻醉，(B)剃毛，(C)覆蓋洞巾，
(D)局部麻醉，(E)抽骨髓，(F)將血塊打散
(A)
(B)
(C)
圖3-10 間質幹細胞於培養瓶中實際生長情形，(A)培養第 4 天，懸浮細 胞很多，間質幹細胞有少量貼附，(B)培養第 6 天及第 8 天，懸