第三章 研究材料與方法
3.5 內皮細胞之培養
內皮細胞之培養主要分為動態植覆、靜態培養與動態培養三個部份。
一般細胞培養都是將細胞懸浮液加於要培養表面上利用重力使細胞貼附，
不過由於人工血管細胞生長支架為曲面，細胞會集中貼附於底面，為了使 細胞均勻地貼附於人工血管細胞生長支架的內壁，動態植覆細胞比重力植
覆的方式為佳[59]。另外，為了模擬血管內皮細胞所生長的血流環境，利用 流動的培養液來培養細胞。
3.5.1 實驗設備
內皮細胞之培養主要儀器與設備如下：
1. 恆溫水浴槽，YIH DER。
2. 無菌操作台，HERA Safe。
3. 二氧化碳培養箱，HERA Cell 150。
4. 高溫高壓滅菌爐。
5. 倒立透射式光學顯微鏡，型號為 Leica DMIL，德國製品，主要功 能為觀察細胞的生長情形，具有明視野、暗視野、相位差、螢光觀 察、影像截取等功能。
6. 血球計數盤。
7. 滾輪式混合器，圖 3-5。
8. 蠕動幫浦，圖 3-6。
其中滾輪式混合器為本人自行設計加工組裝，首先購得減速馬達、減 速齒輪組、齒輪、培林、工程塑膠棒與不鏽鋼棒，將減速齒輪組裝設完成，
並將工程塑膠棒軸心鑽孔並插入不鏽鋼棒以製作成滾軸，將不鏽鋼棒串入 齒輪中心，利用齒輪使滾軸具有相同的旋轉方向與速度，另外，將設計好
的壓克力架交由奇華廣告事業有限公司製作完成後，組裝成簡易式滾輪式 混合器，並利用直流電源供應器調整輸入電壓與電流以控制轉速。
3.5.2 實驗藥品
內皮細胞之培養主要藥品如下：
1. Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline(DPBS)，Gibco。
2. Trypsin-EDTA Solution，Sigma。
3. Trypan Blue Solution，Sigma。
4. MCDB 131，Gibco。
5. Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose(DMEM Low Glucose)，Gibco。
6. Sodium Bicarbonate，Sigma。
7. Fetal Bovine Serum(FBS)，HyClone。
8. Hydrocortisone，Sigma。
9. Ethanol Absolute，Panreac。
10. Recombinant Human EGF Lyophilized(HEGF)，Gibco。
11. L-Glutamine，Gibco。
12. Penicillin Streptomycin(PS)，Gibco。
DMEM Low Glucose 培養液之調配方式如下：
1. 將 DMEM Low Glucose 粉末培養基溶於 650ml 超純水中，攪拌使 其溶解。
2. 稱取 1.5 g/L 之碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)粉末溶於 200ml 超純 水中，攪拌使其溶解。
3. 將溶解的碳酸氫鈉溶液加入溶解的培養基中混合，並添加超純水至 溶液體積為 900ml，繼續攪拌至完全溶解。
4. 以 0.22μm 無菌過濾膜過濾培養基，並以每瓶 450ml 的容量分裝至 滅菌後的血清瓶中，於 4℃保存備用。
5. 要用前將 50ml FBS、5ml PS 與 450ml 培養基放在 37℃恆溫水浴槽 中溫熱後於無菌操作台調配成 DMEM Low Glucose 培養液。
MCDB 131 培養液之調配方式如下：
1. 以 1mg／ml 的濃度將 Hydrocortisone 溶於純酒精，以 MCDB 131 培養基稀釋體積成 20 倍，使其濃度為 50μg／ml，以 0.22μm 無菌 過濾膜過濾後分裝成 10ml 至無菌離心管中，於-20℃冷凍保存備 用。
2. 以 10μg／ml 的濃度將 HEGF 溶於 MCDB 131 培養基中，以 0.22μm 無菌過濾膜過濾後分裝成 0.5ml 至無菌離心管中，於-20℃冷凍保存
備用。
3. 將 MCDB 131 培養基放在 37℃恆溫水浴槽中溫熱後於無菌操作台 以每瓶 440ml 的容量分裝至滅菌後的血清瓶中，於 4℃保存備用。
4. 要用前將 50ml FBS、10ml Hydrocortisone、0.5ml HEGF、5ml PS 與 440ml 培養基放在 37℃恆溫水浴槽中溫熱後於無菌操作台調配 成 MCDB 131 培養液。
依據張晃猷師門提供的 HMEC-1 細胞株培養液調配方式，將 DMEM Low Glucose 培養液與 MCDB 131 培養液以 1：1 等體積混合，並加入適量 的 L-glutamine，調配成 HMEC-1 細胞株的培養液。
3.5.3 動態植覆的實驗方法
本研究是用 HMEC-1 細胞株於人工血管細胞生長支架上植覆細胞以進 行實驗，細胞代數為 26~35 代，培養液主要成分為 MCDB 131 培養液和 DMEM Low Glucose 培養液以等體積混合。為了使血管內皮細胞於人工血 管細胞生長支架內壁均勻貼附，實驗於小管徑人工血管細胞生長支架內壁 動態植覆細胞，人工血管細胞生長支架長度控制為 5mm，首先浸泡 70%酒 精與照射紫外光 1 小時進行滅菌，以滅菌過的超純水浸泡 3 次，每次 10 分 鐘，去除酒精殘留，最後浸泡 DPBS 溶液中備用，要植覆細胞前將人工血
管細胞生長支架置入內徑 5mm 的無菌矽膠管內，並且以滅菌過的鐵氟龍塞 塞住支架的一端。在無菌操作台吸除培養皿中的舊培養液，將培養皿上的 細胞以 DPBS 溶液清洗兩次，將適當濃度的 Trypsin-EDTA 溶液加入培養皿 中作用使細胞從培養皿分離，待細胞分離後加入新培養液中止作用，並均 勻混合細胞液，以等體積比將細胞液與 Trypan Blue 溶液均勻混合，利用血 管計數盤測量細胞液的細胞濃度，調整細胞濃度至 4.879×105 cells／cm3， 並將 66μl 細胞液注入支架內腔後用鐵氟龍塞塞住另一端，植入單位內壁表 面積細胞密度為 5×104 cells／cm2的細胞量，在溫度 37℃、5% CO2濃度的 二氧化碳培養箱中，以轉速 0.1 rpm 於滾輪式混合器上動態植覆 1 天，使細 胞均勻貼附。
3.5.4 靜態培養的實驗方法
將前述不同體積比例(純 PLA、3：1、1：1、1：3 與純 PCL)與不同收 集棒轉速(60、1500、3000、4500、6000、7500、9000 與 10500rpm)之人工 血管細胞生長支架，動態植覆 1 天後，從矽膠管中取出放入 48well 的培養 盤中，先用 DPBS 溶液浸泡後緩緩地吸盡，再加入 0.4 ml 培養液將人工血 管細胞生長支架完全浸泡，分別進行靜態培養 2 天與 6 天。
3.5.5 動態培養的實驗方法
另外將製備條件為體積比例 1：1 以及收集棒轉速分別為 1500、3000、
4500、7500 與 10500rpm 的人工血管細胞生長支架，分別動態植覆 1 天、動 態植覆 1 天後靜態培養 2 天與 6 天之後，將人工血管細胞生長支架移出置 入新的無菌矽膠管中，並以止漏帶封住後用矽利康加強密封性，待數小時 矽利康固化後，連接到裝入 100ml 培養液的無菌血清瓶管線上，並以蠕動 幫浦控制流速，以靜脈流速(12 cm／s)動態培養 2 天後取出人工血管細胞生 長支架，進行 HE 染色，並更換新的培養液，將剩下的人工血管細胞生長支 架繼續以動脈流速(30 cm／s)動態培養 2 天後，取出進行 HE 染色，並更換 新的培養液，最後將剩下的人工血管細胞生長支架以動脈流速(30 cm／s) 動態培養 2 天後，取出進行 HE 染色。