第三章 結果
第十節 共軛焦顯微鏡（confocal）探討粒線體內蛋白的
胞之各項結構與分子，並將螢光離子流的影像擷取之後進行分析，也 可以將影像重疊判斷。我們將特定蛋白分子結合上具有螢光（FITC）
的二級抗體，在雷射光波長488 nm 激發成綠色螢光。再依蛋白的表 現特徵，加入Rhodamine 123（RH-123）染粒線體，PI 染細胞核，雷 射光波長543 nm 激發成紅色螢光，觀察蛋白的表現。
探討經由 ROS 產生造成粒線體通透性改變，造成細胞凋亡啟動 因子cytochrome c、凋亡誘導因子（AIF）和核酸內切酶 endonuclease G（Endo G）釋放；AIF 會進入核內 DNA 與 Endo G 作用，導致 DNA 斷裂（約50 kb），引起 caspase independent pathway 的細胞凋亡，還 可與caspase 及 cytochrome c 協同引起細胞的凋亡。
因 cytochrome c 會進入到細胞質中，啟動細胞凋亡路徑，結果顯 示加藥組的cytochrome c
細胞質中的
螢光表現量高於控制組；AIF、Endo G 則會進入細胞核內，促使 DNA 斷裂而引起細胞凋亡。顯示，
若蛋白進入到細胞核內與DNA 作用，在細胞核內看到紅光跟綠光的 重疊光源呈現橘黃色，表示 AIF 或 Endo G 進入到細胞核中，造成 DNA 斷裂，並引發細胞凋亡，且綠色螢光明顯比控制組高。
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
圖 3-10. 共軛焦顯微鏡探討粒線體內細胞凋亡蛋白 cytochrome c、
AIF、Endo G 之觀察。(A)(C)(E)分別為之控制組，(B)(D)(F) J5 經黃 芩素（75 μM）培養 72 小時之加藥組。
Control 75μM
Cyto C
Endo G AIF
第十一節 黃芩素對人類肝癌細胞（J5）移動及相關蛋白的 影響
本實驗探討黃芩素是否能影響 J5 細胞的移動。其中由細胞移動 試驗（cell motility assay）評估 J5 cells 移動的能力。實驗當中為避免 因細胞的增生能力而有所誤差，故於加藥前置換不含FBS 的培養液，
進行觀察。發現控制組，於 12 小時，即有移動的現象，且隨著時間 的增加，移動更明顯。而加藥組，有很明顯的抑制效果（圖3-11-A）。
由結果顯示，黃芩素能有效抑制 J5 細胞的移行（migration），
另外評估細胞侵入的能力，使用 Boyden chamber（細胞轉移分析 器）系統偵察癌細胞侵入的能力，並計算侵入細胞數目。
48 小時後由結果顯示，控制組穿透 membrane 的數目為 17±5 cells，加藥組為 2±1 cells（圖 3-11-B,C）。證實黃芩素的確可以抑制 細胞的侵入。
轉移蛋白的影響，利用西方墨點法探討轉移蛋白的表現，結果顯 示 MMP-9 的確也是受到抑制；因 COX-2 會刺激基質金屬蛋白酶
（matrix metalloproteinases，MMPs)的表現，結果顯示 COX-2 的表現 也下降（圖3-11-D）。
(A)
(B) (C)
圖3-11. 人類肝癌細胞（J5）以黃芩素不同濃度與不同時間培養後轉 移之影響。(A) 黃芩素（baicalein）對 J5 細胞移行之結果，(B)黃芩 素（37.5 μM）抑制細胞侵入的結果（2±1 cells），(C)控制組侵入的 結果（17±5 cells）。
Control 37.5 μM
(D)
0 6 12 24 48 72 (h)
COX-2 72 kDa 1.00 0.78 0.83 0.62 0.67 0.65
MMP-9 92 kda 1.00 0.88 0.76 0.71 0.74 0.83
β-actin 43 kDa
圖3-11-D. 轉移蛋白的影響（如：COX-2、MMP-9）之表現變化。
Baicalein（75 μM）
第十二節 黃芩素對人類肝癌細胞（J5）細胞凋亡蛋白的影 響
藉由西方墨點法檢測黃芩素（75 μM）以不同時間點培養(0、6、
12、24、48、72 h)相關蛋白的表現。在粒線體路徑蛋白的表現，促凋 亡蛋白Bax 上升，抑凋亡蛋白 Bcl-2 下降，促使膜間蛋白 Cytochrome c 與 Apaf-1 釋放，活化 caspase-9 與 caspase-3，導致細胞凋亡。凋亡 誘導因子（AIF）及核酸內切酶 G（Endo G）表現上升，會進入到細 胞核中，造成DNA 的斷裂（圖 3-12-A）。
在內質網凋亡路徑蛋白的表現，GRP78 與 GADD153 表現上升
（圖3-12-B）。抗氧化酵素蛋白的表現，清除 Catalase 下降，Mn-SOD 上升（圖3-12-B）。
(A)
0 6 12 24 48 72 (h)
Bax 21 kDa 1.00 1.06 0.99 1.10 1.04 1.01
Bcl-2 26 kDa 1.00 0.62 0.65 0.65 0.70 0.72
Cytochrome c 12 kDa 1.00 0.81 1.09 1.05 1.34 1.37
Apaf-1 130 kDa 1.00 1.12 1.09 1.11 1.05 1.13
pro-caspase-9 34 kDa 1.00 1.00 1.02 1.24 1.16 1.20
AIF 67 kDa 1.00 1.07 1.17 0.94 1.17 1.25
endo G 30 kDa 1.00 0.93 1.00 1.31 1.47 1.57
Caspase-3 17 kDa 1.00 1.26 1.62 1.78 1.60 1.23
β-actin 43kDa
圖3-12-A. 黃芩素對 J5 細胞相關凋亡蛋白的影響（如：Bax、Bcl-2、
cytochrome c、Apaf-1、pro-caspase-9、AIF、endo G、Caspase-3）。
Baicalein（75 μM）
(B)
0 6 12 24 48 72 (h)
GRP 78 78 KDa 1.00 1.06 1.07 0.91 1.06 1.11
GADD153 30 KDa 1.00 1.69 1.73 1.75 1.67 1.12
Catalase 60 KDa 1.00 0.52 0.55 0.63 0.69 0.65
Mn-SOD 25 KDa 1.00 1.26 1.81 1.97 2.01 1.76
β-actin 43 KDa
圖 3-12-B. 黃芩素對 J5 細胞相關內質網蛋白的影響（如：GRP78、
GADD153）與抗氧化蛋白（Catalase、Mn-SOD）之表現。
Baicalein（75 μM）