相關蛋白活性的表現

（一）西方墨點法（Western blot）

1. 細胞蛋白抽取

1）J5（2×10⁵ cells /well）種於 6 well-plate 上，每 well medium 總 量為 3 ml，放入細胞培養箱，待細胞貼附完全貼附後，更換新鮮的 pipetman 吸掉剩餘水分（盡量吸乾避免影響 lysis），加入 lysis buffer 200 μl，用 pipetman 抽吸 10 次後且 votex 1 分鐘，放入-20 ℃冰箱。

先取Bradford 染劑 2 ml 加 8 ml 二次水（5 X 稀釋）混合均勻備 用，將上述不同濃度的蛋白質標準品（BSA）取 15 µl 加入 735 µl Bradford 染劑混合均勻，分別取 200 μl 移入 96 well-plate，做六重複 試驗，靜置5 min 後，利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D.595 nm 的波長下測定各蛋白質標準品之吸光值。將每個濃度所測的之吸 光值取平均與相對濃度畫出標主檢量線，並求出趨勢線方程式及 R² 值。（R²必須≧0.99 以上的準確度方可接受。）

2）樣品蛋白質定量

先取 10 µl 蛋白質與 90 µl-DDW 混和（10 X 稀釋），從稀釋蛋 白中取15 µl 加入 735 µl Bradford 染劑混合均勻，分別取 200 µl 移入 96well-plate，做六重複試驗，靜置 5 min 後，利用酵素免疫分析儀

（ELISA reader）在 O.D.595 nm 的波長下測定各蛋白質標準品之吸光 值。將每個濃度所測的之吸光值取平均帶入趨勢線方程式中，再乘以 稀釋倍數，則可求得檢體蛋白質之實際濃度。

3.電泳膠片的製作

下層膠注入鑄膠台後，緩緩加滿 isopropanol 去除氣泡並壓平下 層膠之上緣，約 30 分鐘後待膠片凝固，移去 isopropanol。隨即，注 入上層膠並小心地插入電永梳（comb），避免氣泡出現在 well 的下 緣。待上層膠凝固後拔出電泳梳，並以二次水小心沖洗 well 內，避 免雜質殘留。將鑄好的膠片移至電泳槽中，加入running buffer。

表2-10. 下層膠及上層膠的配製

分鐘）即可停止電泳，接著進行蛋白質樣本轉印。

5.蛋白質樣本轉印（Immunoblotting）

1）轉印步驟：

先將 PVDF membrane 裁剪好，再以 methanol 短暫濕潤後，再浸 入轉印緩衝液（transfer buffer；表 2-12）中，接著將裁好的 3 M 濾紙 先浸泡在transfer buffer 中備用，將轉漬夾打開後白色一面朝上，黑色 2%FBS（溶於 0.05 %Tween 20/1X PBS 中）進行 blocking 步驟，以室 溫1 小時為條件進行，目的在於 blocking non-specific sites。取出轉印 膜後再以0.05 %Tween 20/1X PBS 清洗 5 分鐘共 6 次。緊接著進行免 疫反應，以一級抗體（溶於新鮮配製之blocking solution 中，不同品牌 的抗體有不同的稀釋倍數），4 ℃隔夜進行搖盪。隔天取出，回收一 級抗體，以 0.05%Tween 20/1X PBS 清洗轉印膜 5 分鐘共 6 次。加入 稀釋5000 倍的 goat anti IgG（HRP）horseradish peroxidaseconjugated antibody 二級抗體（溶於含 2% FBS 的 0.05%Tween 20/1X PBS 中），

於室溫下搖盪進行 1 小時，最後取出轉印膜後以洗清洗 5 分鐘共 6 次。

清洗完後，浸漬於 0.05%Tween 20/1X PBS 中，等待壓片。

6.壓片製作（暗房操作）：

將轉漬膜以濾紙吸乾後，浸泡於 ECL 試劑之混和液（每瓶各 取 1mL 等比例混和）中反應 1 分鐘；以兩張投影片平整包覆轉漬膜，

正面朝上放置於壓片卡夾（cassette）內，再用膠帶固定投影片；以 Hyperfilm 軟片置於上層投影片上，對準轉印膜進行壓片，感光時間 依轉印膜上螢光亮度決定時間長短，約 5 秒至 1 小時不等。取出放 入顯影劑中進行顯影步驟（所需時間依實際觀察而定）並輕微搖晃，

以自來水沖使 30 秒後放入定影劑中，約 1 分鐘後即可取出，再以自 來水沖洗乾淨，晾乾後即可看見 signal 於感光底片上呈現。

7.軟體分析：

將成色完成之底片，以 Tatal-lab 軟體對每一個 band 的密度 加以比較分析。

表2-11. 電泳緩衝液（running buffer）之組成

表2-12. 轉印緩衝液（Transfer buffer）之組成

圖 2-3. 轉漬夾的三明治結構

組成 體積（ml）

10 X SDS buffer（25 mM Tris、

192 mM glycine、0.1％ SDS） 200 加H2O2到 2000 ml

組成 重量（g）

Tris 6 Glycine 28.8 100% Methanol 400 ml

加 H₂O₂到總體積2000 ml