其他金屬離子耐受度的影響

將金屬離子濃度以其在海水中的濃度為基準，再比較其濃度降低到 1/10 倍和提高到 10 倍的差異，將此不同濃度之金屬離子分別加入作用 的基質中，測量其活性的變化以推測其對酵素為加強或是抑制效果，由 於各金屬離子濃度差異大，故以 1 mM 的濃度下做為比較各金屬離子 對洋菜酶的影響，其结果如表四，各離子對 Yen-agarases 都有不同程 度的加強或是抑制效果，以同一濃度相比較，含 1 mM MnCl₂ 及ZnCl₂ 有較佳增加活性的效果分別為 127.77% 及 111.01%，而高濃度 CoCl₂ 會抑制其活性使活性減低為 61.67% 。

添加其他金屬離子和化學藥劑會對微生物所產洋菜酶有不同的影 響，0.005 M MgCl₂ 會增加 Pseudomonas atlantica 的 β-agarase II 20%

活性 (Morrice et al., 1983a)；0.1 mM 的Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺ 和 Al³⁺

等離子會完全抑制 Pseudomonas sp. PT-5 agarase活性 (Yamaura et al.,1991)；Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Cs²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺ 等 離子對 P. vesicularis MA103 的洋菜 agarase I 的活性具有不同程度的 抑制作用，但 agarase I 需要有5 mM 的 Ca²⁺ 存在時才具有活性(陳，

2006)。

四、酵素動力學(Km、Vmax)

取 Yen-agarase 分別以 high and low-melting-point agarose 為基 質，與催化速率做成雙倒數圖(Lineweaver-Burk plot )，經回歸，由 Michalis-Menten 方程式分別求得以 high-melting-point agarose 為基質 時，Km 為 2.76 g/L，Vmax 為 68.03 μmole min^-1(圖十二)；以

low-melting-point agarose 為基質時，Km 為 1.54 g/L，Vmax 為 36.9

μmole min^-1(圖十三)，顯示 Yen-agarase 對 low-melting-point agarose 較 high-melting-point agarose 的基質親和力高。

五、洋菜酶之分解產物的探討

以薄層層析法 TLC 來分析 Yen- agarases 之水解產物(圖十四)。調 整各洋菜酶酵素活性為 10 U / mL ，與 0.2 % agarose 於35℃ 下，分別 作用 0.5、1、2、5、24 小時之水解產物。洋菜酶處理後之多糖液使 用毛細管點在 silica gel 60 上，然後進行展開，終止後拿起風乾。使用 呈色劑呈色，再拿至 110 ℃ 烘箱烘乾 10 分鐘。

洋菜酶水解洋菜糖之水解產物，皆是隨著作用時間延長，水解產物 逐漸趨向較小的寡糖。從結果中發現，Yen –agarase 粗洋菜酶與 agarose 作用後，產生之水解產物主要為新洋菜二糖、新洋菜四糖和半乳糖，其 他寡醣次之，由於洋菜酶具有基質特異性，因此不同洋菜酶水解洋菜之 水解產物也不完全相同。目前所發現之洋菜酶依其洋菜酶之水解產物來 區分。Arthrobacter sp. S-22 ( Osumi et al., 1998 )、Pseudomonas

atlantica ( Groleau and Yaphe, 1977 )、Cytophaga flevensis ( van der Meulen and Harder, 1976 )、Vibrio sp. AP-2 enzyme ( Aoki et al.,

1990b )、Vibrio sp. AP-2 enzyme B ( Aoki et al., 1990a )、Alteromonas sp. E-1 ( Kirimura et al., 1999 )之菌株洋菜酶水解洋菜主要產物為新洋 菜雙糖。 Cytophaga flevensis ( van der Meulen and Harder, 1975 )、

Vibrio sp. PO-303 enzyme B ( Araki et al., 1998 )、Vibrio sp. JT0107 ( Sugano et al., 1993a )之菌株洋菜酶水解洋菜主要產物為新洋菜四糖 及新洋菜雙糖。 Pseudoalteromonas atlantica N-1 ( Vera et al., 1998 )、

Vibrio sp. PO-303 enzyme A ( Araki et al., 1998 ) 之菌株洋菜酶水解洋菜

主要產物為新洋菜六糖及新洋菜四糖。Alteromonas agarlyticus GJ1B ( Potin et al., 1993 ) 之菌株洋菜酶水解洋菜主要產物為 agarotetraose 及洋菜三糖( agarotriose )。Bacillus cereus ASK202 ( Kim et al., 1999 ) 之菌株洋菜酶水解洋菜主要產物為新洋菜六糖、新洋菜四糖及新洋菜雙 糖。Vibrio sp. JT0107 ( Sugano et al., 1994 ) 之菌株洋菜酶水解洋菜主要 產物為洋菜五糖( agaropentaose )、agarotriose、洋菜雙糖及 D -galactose。

Vibrio sp.PO-303 enzyme C ( Araki et al., 1998 ) 之菌株洋菜酶水解 洋菜主要產物為新洋菜八糖( neoagarooctaose ) 及新洋菜十糖

( neoagarodecaose )。Cytophaga flevensis ( van der Meulen and Harder, 1975 ) 、 Pseudomonas atlantica ( Day and Yaphe, 1975 )之菌株洋菜酶水 解洋菜主要產物為 D –galactose 及 3,6-脫水-L型半乳糖

( 3,6-anhydro-L-galactose )。

由於Potin et al. ( 1993 ) 指出如果洋菜酶為切 α-form，並不會產生 還原端，所以無法以測還原糖的方法測到活性，但如果含有 β-半乳糖苷 酶，會將非還原端切掉，露出還原端使可以偵測到的還原糖量上升。

本研究利用這個特點，在酵素中加入 β-半乳糖苷酶偵測到的還原糖 量，如果有上升表示洋菜酶為切α-form 的洋菜酶，如果沒有上升表示 洋菜酶為切 β-form 的洋菜酶，結果發現可能含有大部份切 β-form 的 洋菜酶。由此可以推測菌株 Yen 可能為 β-agarase。若要更精確知道水 解產物及其分型，則需要利用其他儀器如 NMR、HPLC 分析才能確定 產物為何，並利用產物判斷其為那種類型的洋菜酶作用模式。