ㄧ、微型電腦斷層掃描 (micro-computed tomography, μCT)
本研究將樣本送至國立台灣大學醫學院藥理學研究所，以微電腦斷層掃描器 (Micro-CT, Skyscan 1176, Kontich, Belgium)（圖 3） 進行左脛骨與股骨的 3 維結構掃描。
以下為該單位進行分析的標準流程之簡述：藉由1mm 鋁質濾器在 65 伏特 (kV) 與 350 毫安培 (uA) 的條件下進行掃描，影像搜集的解析度為 9μm /pixel，並以影像重建軟 體GPU-based scanner software (NRecon) 執行影像重建。脛骨與股骨的海綿骨骨密度與 結構參數之掃描區域分別被定為距離生長板底下2-3 mm 與 2-4 mm。脛骨與股骨的皮質
骨骨密度則以生長板下6-7mm 處進行掃描。
上述分析是以兩種軟體 (CTAn) 與 (CTvox) 進行分析與計算。最後可得參數分別 有皮質骨與海綿骨的體積骨密度 (volumetric bone mineral density, vBMD, g/cm3) 與海綿 骨結構參數，結構參數分別有骨量比率 (bone volume/ tissue volume, BV/TV, %)、骨小樑 厚度 (trabecular thickness, Tb.Th, mm)、骨小樑間距 (trabecular separation, Tb.Sp, mm) 與 骨小樑數目(trabecular number, Tb.N, 1/mm)。
圖 3 微型電腦斷層掃描器
二、骨細胞分析
以切片機自長骨遠端或近端中央取一骨組織縱向切片，共切 2 片，厚度為 7μm。
採用兩種染色法進行組織切片染色，一為抗酒石酸鹽酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 染色法，以TRAP染色劑 (Leukocyte Acid Phosphatase Kit, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 進行，待染色完成後在 10 10 倍的顯微鏡下，計算 骨組織中生長板以下 3 公厘範圍內的海綿骨破骨細胞 (osteoclast) 數目，用以代表骨吸 收作用的指數；另外，骨生成作用的指數以鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 染
色法進行，以ALP染色劑 (BCIP-NBT Liquid Substrate System, Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO, USA) 進行。待染色完成後，架設高解析度相機 (COOLPIX4500, Nikon, Japan) 於顯微鏡上，以20 10 倍之鏡頭進行次級海綿骨處的拍攝，並以影像分析軟體 (Image Pro Plus 6.1for Windows (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) 進行分析與計算。
以上各項的切片染色流程與數據計算方法參照先前的研究 (Huang, Lin, Chen, & Yang, 2011)，詳細敘述如附錄二和附錄三。
三、骨組織生物力學特性與斷面參數分析
以先前研究所採用的三點壓斷方式進行 (Huang et al., 2008b)。三點壓斷的兩支撐點 距離20mm，第三點則以每秒鐘 1mm的速度向兩支撐點反方向下壓。以上骨骼材料測驗 以 國 立 成 功 大 學 物 理 治 療 研 究 所 的 雙 軸 材 料 測 試 系 統 (material testing system) (MTS-858, MTS System, Minneapolis, MN) （圖 4）進行，實驗過程中的負荷-形變數據 (loading-deformation) 透過MTS-858 所附之原廠資料擷取軟體收集。
圖 4 雙軸材料測試系統
所有骨組織在壓斷後隨即進行斷面的攝影，架設高解析度相機於 25 倍的顯微鏡 上，在固定距離的條件下，將所有組織斷面拍攝下來，隨後再以影像分析系統 Image Pro
Plus 5.1 for Windows (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) 測量組織斷面的各項參數，
以供進一步計算斷面的轉動慣量矩 (cross-sectional moment of inertial, CSMI) 之用。其計 算方法與公式是參考先前的研究 (Huang et al., 2008b; Turner & Burr, 1993)，簡述如下：
I =
n (wh3/12 + whdi2)i=1
I 是指轉動慣量矩；n 為映像點 (pixel) 的數目，w 和 h 分別為任何一個映像點的
高度與寬度；di 為橫斷面面積裡的質心到各映像點的距離。此外，透過進一步的計算可 得到橫斷面面積 (cross-section area)、皮質骨面積 (cortical bone area)、骨髓腔面積 (bone marrow area)、皮質骨厚度 (cortical bone thickness)、斷面高度與寬度。
在生物力學數據的部份，本研究將所得的數據進行運算後，得到骨骼的降伏點負荷 值 (yield load, 單位：N)、斷裂負荷值 (fracture load, 單位：N)、達降伏點所需能量值 (energy to yield load, 單位：mJ)、降伏點後所需能量 (energy to post-yield, 單位：mJ) 及 骨骼斷裂所需能量 (energy to fracture load, 單位：mJ) 、剛性 (stiffness)。
而再以斷面的轉動慣量矩進行組織的均質化運算後，又將可得出骨骼的降伏點應力 (yield stress,單位：MPa)、降伏點堅韌度 (yield toughness s,單位：mJ/mm3)、楊氏係數 (Young’s modulus,單位：GPa)，以上相關的計算公式為：
應力值 (σ) 公式：σ=FLc/4I 應變值 (ε) = 12cd/L2
楊氏係數 (E) 公式：E=F/d*L3/48I
其中，c為質心的距離；F負荷值；d是位移；L是兩個支撐點的距離。有關降伏點負荷與 降伏點應力值是以0.2% 補償法所計算，詳細內容可參考先前研究 (Huang et al., 2008b;
Turner & Burr, 1993)。
四、地面反作用力
本研究的地面反作用力之數據與分析的方法是參考先前的研究所進行 (Lin et al., 2011; 林欣仕等，2010)，以量測後腳 (hindlimb) 為主。以八週訓練組為樣本 (n=10)，
進行每週2 次（每週的第一天與第五天的訓練），總計16 個時間點的地面反作用力測量，
重點描述如下：
（一）測力板系統裝置（圖5）
所使用之測力板是由長與寬皆 30cm 的鋁製板組成，另外含有四顆最大受力值為 50N 之荷重計 (load cell, MDB-10,Transducer TechniquesR, USA)。量測的數據由訊號放大 器與資料擷取系統（包含資料擷取盒 InstruNet-100 與資料擷取卡 InstruNet-230），樣本 蒐集頻率為100 HZ，取得後並傳送到個人筆記型電腦。
A
B C
D
圖 5 自製之測力板裝置
註：A 為力板；B 為荷重計；C 為資料擷取系統；D 為個人筆記型電腦。
(二)
片經由繪圖軟體標 示四肢落地位置，隨後以Image Pro-Plus5.1 軟體計算而得到座標。
落地座標
架設攝影機於測力板上方拍取每次的落地位置（圖 6），所得圖
圖 6 落地位置標記示意圖
(三) 地面反作用力的計算公式
而得到地面反作用力之數值。有關地面反作用力的計算公式與基本概念如 7 所示：
大鼠每次落地時均會產生GRF 峰值，本研究以此峰值的數據與座標，以 Matlab 6.5 進行程式運算
圖
F2 F3