分析方法

六 六

六、、、、 分析方法分析方法分析方法分析方法

(一一一一)血清胰島素濃度測定血清胰島素濃度測定血清胰島素濃度測定血清胰島素濃度測定

1. 原理

本實驗是以商業套組進行分析，乃是利用 ELISA 的原理。具 Insulin 特異性的多株抗體已 coating 於 96 孔盤上，將實驗樣品加入孔盤中，

此 時 樣 品 的 insulin 會專一性結合於其抗體上，再加入過氧化酶 (peroxidase)的受質 3,3^,,5,5^,-tetramethylbenzidine(TMB)作為呈色劑，最 後加入 H2SO4終止反應後，測其 OD450nm 之吸光值，代入標準曲線換 算 insulin 濃度。

2. 實驗步驟

1) 將 25µl 的血清樣品分別加入微孔中

2) 加入 50µl 的 conjugate solution，於室溫使用震盪器搖晃 2 小時 3) 使用免疫分析微盤清洗機以 wash buffer 清洗孔盤 6 次

4) 加入 200µl 的 TMB 於各微孔內，避光反應 15 分鐘 5) 加入 5µl 的 H2SO₄ 終止反應

3. 標準曲線之製作

以濃度為 0、0.29、0.74、1.7、3.7 及 6.4 µg/l 之 insulin 標準品，

和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為 X 軸、所測 得之波長 OD_450nm 之吸光值為 Y 軸，則可得到一標準曲線。

4. 計算方法

(二二二二) 總總總總蛋白質濃度蛋白質濃度蛋白質濃度蛋白質濃度

1. 原理

以 Bradford protein-binding assay 的方法進行定量，此定量法利用 coomassie brilliant blue G-250 與蛋白質有結合之特性，在 G-250 與蛋 白質結合後，G-250 的顏色會從紅色轉變成藍色，於 OD595nm 波長下 可測其吸光值。故可利用其吸光值計算樣品之蛋白質濃度。

2. 實驗步驟

1)將實驗樣品(腎臟均質液)稀釋 100 倍並取 10µl 注入 96 孔盤

2)於每一微孔中加入 20µl 已稀釋過之 Bio-Rad 染劑 (Bio-Rad 原液:二

次水=1:4)

3)於室溫下使用震盪器反應五分鐘後 4)測其 OD_595nm 之吸光值

3. 標準曲線

使用 BSA 作為實驗標準品，將標準品原液分別稀釋成為 0、0.1、

0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml。標準品和實驗樣品同時以上述方法分析 測定後，以標準品濃度為 X 軸，所測得之 OD595nm 吸光值為 Y 軸，

則可得一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於波長 OD_595nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內 插法代回一次方程式(y=ax+b)計算，再乘回稀釋倍數(x100)，則可求得 樣品之蛋白質濃度。

(三三三三) 腎臟均質液中腎臟均質液中腎臟均質液中腎臟均質液中總抗氧化量總抗氧化量總抗氧化量(Total antioxidant)濃度總抗氧化量 濃度濃度濃度測定測定測定 測定

1. 原理

本實驗是以商業套組進行分析，原理利用 ABTS (2,2-Azino- bis- [3-ethylbenzthiazoline sulphonate]) 被 metmyoglobin 反應而生 成的 ABTS^．＋。此為一相當穩定之藍綠色物質，抗氧化物質(包括維生 素、蛋白質、脂肪、GSH、尿酸等抗氧化物質)可抑制此產物之生成。

因此吸光值愈低，表示總抗氧化物質濃度愈高，因此可由波長 OD750nm

下之吸光值變化算出總抗氧化物質之濃度。

2. 實驗步驟

1) 取 10µl 樣品(腎臟均質液)注入 96 孔盤

2) 加入 10µl 的 metmyoglobin 和 150µl 的 chromogen 於 96 孔盤中 3) 加入 40µl 的 hydrogen peroxide 使反應開始，並置於震盪器於室溫

反應 5 分鐘。

4) 測其 OD750nm 之吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 0、0.045、0.09、0.135、0.18、0.225、0.33 mM

之總抗氧化物標準品和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準 品濃度為 X 軸，所測得之 OD_750nm 吸光值為 Y 軸，則可得一標準曲 線。

品之總抗氧化物濃度，除以樣品蛋白質濃度後，濃度單位以 mM/mg protein 表示。

(四四四四) 腎臟均質液麩胱苷肽過氧化酶腎臟均質液麩胱苷肽過氧化酶腎臟均質液麩胱苷肽過氧化酶腎臟均質液麩胱苷肽過氧化酶(Glutathione Peroxide;GPx)活性測定活性測定活性測定 活性測定

1. 原理

本實驗是以商業套組進行分析，原理是利用 GPx 催化 H₂O₂ 與 GSH 作用，會使 GSH 轉變為 oxidized glutathione(GSSG)，再經由 glutathione reductase 的催化，由 NADPH 得到 H⁺ 後再還原成 GSH。

因此可由測定波長 OD340nm 下之吸光值於每分鐘之濃度變化來檢測 GPx 之活性。

2. 實驗步驟

1) 將 sample 稀釋 50 倍

2) Background:於三個微孔中各加入 120µl 的 assay buffer 和 50µl co-substrate mixture。

Positive control: 於三個微孔中各加入 100µl 的 assay buffer 和

50µl co-substrate mixture 和 20µl 已稀釋的 GPx 標準品。

Sample: 於 各 微 孔 中 加 入 100µl 的 assay buffer 和 50µl

co-substrate mixture 和 20µl 腎臟均質液。

3) 於每一微盤中加入 cumene hydroperoxide 使反應開始,並置於震 盪器反應 10 秒。

4) 於每一分鐘測其 OD340nm 吸光值，連續測 6 次，總共檢測時間 為 6 分鐘。

將樣品的吸光值減背景值後，選擇任一連續 1 分鐘之時間點計 系統，藉以測量 glutathione reductase 的活性，再推算 GSH 濃度。GSH 的 sulfhydryl group 會與 DNTB(5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid )反 應，產生黃色的 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB)和 disulfide-GSTNB，

並籍由 TNB 的產生速率會直接和此循環的反應呈現正比例關係而反

Sample dilution = nmole/min/ml ΔA₃₄₀/min

GPx activity =

0.00373 M^-1

Х 0.19 ml Х

0.02 ml

Sample dilution = nmole/min/ml

圖 3-1、GSH 的反應循環圖

2. 實驗步驟

(1) 將 50µl 腎臟均質液注入 96 孔盤 (2) 準備 assay cocktail 包括:

(a) MES buffer: 11.25 mL

(b) reconstituted cofactor mixture: 0.45 mL (c) reconstituted enzyme mixture: 2.1 mL (d) ddwater: 2.3 mL

(e) reconstituted DTNB: 0.45 mL

(3) 再將配製好的 assay cocktail 加入 150 µl 到 96 孔盤中 (4) 在避光環境下，搖晃 25 分鐘後測其 OD405nm 之吸光值

3. 標準曲線

以濃度為 0、0.5、1、2、4、8、12、16 µM 之 GSH 標準品和實驗 樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為 X 軸。所測得之

OD405nm 吸光值為 Y 軸，則可得一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於波長 OD_405nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內插 法代回一次方程式(y=ax+b)計算，再乘回稀釋倍數，則可求得樣品之 GSH 濃度，除以樣品蛋白質濃度後，濃度單位以 µM/mg protein 表示。

(六六六六) 腎臟均質液超氧化物歧化酶腎臟均質液超氧化物歧化酶腎臟均質液超氧化物歧化酶腎臟均質液超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase;SOD)活性測定活性測定活性測定活性測定

1.原理

本實驗是以商業套組進行分析，原理是當 xanthine 轉變為 uric acid 的過程中，經由 xanthine oxidase 的催化會有超氧陰離子產生。此 時若有超氧化物歧化酶存在便能催化超氧陰離子與 H⁺ 作用得到 H2O2

及 O₂ ，而產生紫色物質。因此可由測定波長 OD_450nm 下之吸光值算出 SOD 之活性。

反應方程式為: 2O₂^-．+2H⁺+SOD
H2O₂+O₂

2.實驗步驟

(1)將 200µl 腎臟均質液注入 96 孔盤

(2)加入 20µl 已稀釋之 xanthine oxidase 於 96 孔盤

(3)於室溫下使用震盪器反應二十分鐘後，測其 OD450nm 之吸光值。

3. 標準曲線之製作

所測得之吸光值/standard(B)所測得之吸光值; LR(B)=standard(B)所 測得之吸光值/standard(A)所測得之吸光值，以此類推。以標準品活 性(U/ml)為 X 軸、linearized rate(LR)為 Y 軸，則可得到一標準曲線。

4.計算方法 公式:

* LR(sample)=sample 所測得之吸光值/standard 所測得之吸光值由標準 曲線可得一次方程式(y=ax+b)，以實驗樣品所測得之吸光值代入上述

Sample LR － y-intercept (b) Slope (a)

Sample LR － y-intercept (b) Slope (a)

(2) 立即加入 20µl 的 hydrogen peroxide，使反應開始 (3) 於室溫下使用震盪器反應二十分鐘

(4) 加入 30µl 的 potassium hydroxide 於每一微孔中，使反應終止再加 入 30µl 的 purpald，並於室溫下使用震盪器反應十分鐘

(5) 加入 10µl 的 potassium periodate 於每一微孔中，再於震盪器反應 五分鐘後，測其 OD540nm 之吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 0、5、15、30、45、60、75µM 之 catalase 之標準品和實 驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為 X 軸，所測得之

OD_540nm 吸光值為 Y 軸，則可得一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於波長 OD540nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內 插法代回一次方程式(y=ax+b)計算再乘回稀釋倍數則可求得樣品之 Catalase 活性，除以樣品之蛋白質濃度後，catalase 活性單位以 U/mg protein 表示。

(八八八八)腎臟均質液之腫瘤壞死因子腎臟均質液之腫瘤壞死因子腎臟均質液之腫瘤壞死因子腎臟均質液之腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor; TNF-α)濃度測定濃度測定濃度測定濃度測定

1.原理

本實驗以商業套組進行分析，是利用 ELISA 的原理。具 TNF-α 特 異性之多株抗體已 coating 在 96 孔盤上，將腎臟均質液加入微孔內，

3,3^,,5,5^,-tetramethylbenzidine(TMB)。Avidin-HRP 中的 Avidin 會結合上 Biotin，而 TMB 是過氧化酶的受質，TMB 受過氧化酶催化後會有藍 色氧化產物產生，加入終止劑中止反應後，即可測其 OD_450nm 之吸光 值，代入標準曲線換算 TNF-α 濃度。

2.實驗步驟

(1) 將實驗樣品 100µl 注入 96 孔盤中，室溫下使用震盪器反應二小時 後，以 wash buffer 清洗各微孔 5 次。

(2) 各微孔加入 100µl 已稀釋 250 倍的 detection antibody，室溫下使用 震盪器反應一小時後，以 wash buffer 清洗各微孔 5 次。

(3) 各微孔加入 100µl 已稀釋 250 倍的 Avidin-HRP，室溫下使用震盪 器反應三十分鐘後，以 wash buffer 清洗各微孔 7 次。

(4) 各微孔加入 100µl substrate solution，室溫下使用震盪器反應十五分 鐘後，最後加入 50µl stop solution (1N HCL)後，在波長 OD_450nm 下 測其吸光值。

3. 標準曲線之製作

以濃度為 500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 pg/ml 之 TNF-α 標準品和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃 度為 X 軸，所測得之 OD_450nm 吸光值為 Y 軸，則可得一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於波長 OD_450nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內 插法代回一次方程式(y=ax+b)計算，再乘回 2 倍之稀釋倍數則可求 得樣品之 TNF-α 濃度，除以樣品蛋白質濃度後，濃度單位以 pg/mg

(九九九九) 腎臟均質液之白介素腎臟均質液之白介素腎臟均質液之白介素腎臟均質液之白介素-6(Interlukin-6; IL-6)濃度測定濃度測定濃度測定濃度測定

1. 原理

本實驗以商業套組進行分析，是利用 ELISA 的原理。具 IL-6 特 異性之多株抗體已 coating 在 96 孔盤上，將腎臟均質液加入微孔 內，此時樣品的 IL-6 會專一性的被留在微孔中，移除微孔內的液 體後再加入與生物素共軛的抗 IL-6 抗體(biotin conjugate anti IL-6 antibody)，使其與孔盤內的 IL-6 共軛結合，再依序加入 Avidin-HRP 及 TMB。TMB 受過氧化酶催化後會有藍色氧化產物產生，加入終 止劑中止反應後，即可測其 OD_450nm 之吸光值。代入標準曲線則可 換算 IL-6 濃度。

2. 實驗步驟

(1)將實驗樣品 100µl 注入 96 孔盤中,室溫下使用震盪器反應二小時 後，以 wash buffer 清洗各微孔 5 次。

(2)各微孔加入 100µl 已稀釋 250 倍的 detection antibody，室溫下使 用震盪器反應一小時後，以 wash buffer 清洗各微孔 5 次。

(3)各微孔加入 100µl 已稀釋 250 倍的 Avidin-HRP，室溫下使用震 盪器反應三十分鐘後，以 wash buffer 清洗各微孔 7 次。

(4)各微孔加入 100µl substrate solution，室溫下使用震盪器反應十五 分鐘後，最後加入 50µl stop solution (1N HCL)後，在波長 OD450nm

標準品和實驗樣品同時以上述方法分析測定後，以標準品濃度為 X 軸，所測得之 OD450nm 吸光值為 Y 軸，則可得一標準曲線。

4. 計算方法

測得實驗樣品於波長 OD_450nm 下之吸光值後，依據標準曲線以內 插法代回一次方程式(y=ax+b)計算，再乘回 2 倍之稀釋倍數則可求得 樣品之 IL-6 濃度，除以樣品蛋白質濃度後，濃度單位以 pg/mg protein 表示。

(十十十十)腎臟均質液之纖維蛋白原腎臟均質液之纖維蛋白原腎臟均質液之纖維蛋白原腎臟均質液之纖維蛋白原(Fibrinogen)濃度測定濃度測定濃度測定 濃度測定

1. 原理

本實驗以商業套組進行分析，是利用 ELISA 的原理。具 Fibrinogen 特異性之多株抗體已 coating 在 96 孔盤上，將腎臟均質液加入微孔 內，此時樣品的 Fibrinogen 會專一的與孔盤上的 anti- fibrinogen 抗體 結合並留在孔盤壁上，移除孔盤內的液體後再加入與

生物素共軛的抗 Fibrinogen 抗體(biotin conjugate anti Fibrinogen antibody) ， 使 其 與 孔 盤 內 的 Fibrinogen 共 軛 結 合 ， 再 依 序 加 入 Avidin-HRP ， Fibrinogen antibody 與 Avidin-HRP 產 生 複 合 物 (complex)， 再藉由 96 孔盤清洗機清除殘餘物，再加入呈色劑 TMB。

2 實驗步驟

(1) 將實驗樣品 100µl 注入 96 孔盤中,室溫下使用震盪器反應 一小時

(1) 將實驗樣品 100µl 注入 96 孔盤中,室溫下使用震盪器反應 一小時