1.利用染色質免疫沉澱法(Chromatin immunoprecipitation)研究 response regulator 11 在細菌體內是否能直接調控 PspC 基因的表現。
在microarray 與 RT-PCR 確定 response regulator 會調控 PspC 的表現後，我更 進一步想探討response regulator 11 是否直接調控 PspC 基因的表現來影響細菌生物 膜的形成。首先，利用純化的RR11 蛋白免疫兔子得到 RR11 polyclonal antibody，
之後以染色質免疫沉澱法來研究response regulator 11 是否可以直接調控 PspC 基因 的表現。由實驗結果發現response regulator 11 可以直接調控 PspC 基因的表現(圖
七A)。然而在先前筱菁學姊的研究中發現 PspC 會與前段的另外兩的基因 SMU.751 與SMU.752 形成一個 operon，而利用生物資訊的方式我們也發現 PspC 前有一段 小段的intergenic region，我們推測 PspC 基因除了可以 operon 的方式被表現，另外 可能也會受response regulator 11 的調控。所以我另外也以染色質免疫沉澱法來觀 察response regulator 11 是否可以調控 SMU.751 基因，我發現 response regulator 11 在細菌體內似乎無法直接調控SMU.751 的表現。在以往的研究曾經發現 Two component regulatory systems 有時可藉由自我調控(autoregulation)的方式來調控 two component system sensor 與 regulator 的表現，所以我也利用染色質免疫沉澱法來觀 察response regulator 11 (SMU.485)是否可以有自我調控的狀況。由結果發現
response regulator 11 似乎不會自我調控基因的表現(圖七 A)。
2.膠體電泳阻滯實驗(electrophoretic motility shift assay) 研究 response regulator 11 是否可與 PspC 前可能的啟動子區位結合。
更進一步，我利用膠體電泳阻滯實驗來驗證 response regulator 11 是否確實可 與PspC 前可能的啟動子區位結合，進而調控 PspC 的表現。利用 microarray 的結 果，一一比對在可能受response regulator 11 所調控基因前的 intergenic region 與 PspC 之間是否有相類似的區位。由結果發現有一段約 16 mers
( GTTTATACTAATAGCA )的 DNA 序列，在多個基因中有相當高的相似性。因此 我選用這段DNA 序列來進行膠體電泳阻滯實驗。由結果我發現 response regulator 11 確實可與這段序列進行結合(圖七 B)，顯示 response regulator 11 可能是與此段 DNA 序列結合，進一步調控 PspC 的表現。
3.利用共軛焦螢光顯微鏡觀察富含血小板血漿中 Wild-type GS5、RR11 mutant、PspC mutant 與 PspC complementation strain 生物膜形成的差異。
利用共軛焦顯微鏡的觀察可以發現GS-5、RR11 mutant 與 PSPC mutant 在富 含血小的血漿中形成生物膜的狀態有所不同。在野生株 GS-5 中，生物膜的形成是 較為緊實而且其生物膜形成範圍也較大。但在RR11 mutant 中，生物膜的狀態可見 到明顯的微聚落 (microcolonies)形成，且其結構也較為鬆散，而在 PspC 基因有所
缺失的菌株，則可以發現其生物膜幾乎無法形成，然而在將PspC 送回的 GS5、RR11 mutant、PspC mutant 與 PspC complementation strain 生物膜 形成的差異。
在利用體外模式觀察生物膜形成後，我們更進一步利用感染性心內膜炎大鼠 模式來探討野生株GS5、RR11 mutant、PspC mutant 與 PspC complementation strain 體內生物膜形成的差異。由結果我們發現，在PspC 基因有所缺失的菌株中，其形 成體內生物膜的能力會有明顯的缺失(圖六B)。而在 PspC complementation strain 中則可以發現其體內生物膜形成有明顯被恢復。顯示PspC 基因在感染性心內膜炎
complementation strain 先 coating 在 ELISA plate 後，外加富含血小板的血漿部分與 之結合，觀察PspC 的缺失是否與血小板的黏附有關。由結果發現 PspC 的缺失並 不影響轉糖鏈球菌與血漿中血小板的結合。而我將野生株GS5 和 PspC mutant 與血 小板貧乏血漿培養後，利用西方墨點法(western blot)研究 PspC 的缺失是否影響轉 糖鏈球菌與血漿中的纖維蛋白原的結合。由結果發現PspC 的缺失並不影響轉糖鏈
球菌與纖維蛋白原的結合。
6.檢測野生株 GS5 和 PspC mutant 在生物體內及全血中生存能力。
我進一步將GS5 與 PspC mutant 打到老鼠體內觀察生物體內細菌被清除的速 率是否有所不同，我發現PspC mutant 比起 GS5 會更容易在體被被清除。而利用人 類全血殺菌試驗也發現PspC mutant 在全血中的存活率也是較 GS5 低。這些結果顯 示PspC 蛋白可能參與了細菌對抗宿主免疫系統的功能。
四、討論 異。在 Streptococcus gordornii 的研究中曾發現體外生物膜有明顯缺失的菌株，在 動物實驗中，並不會影響其造成感染性心內膜炎的致病力 (Bizzini et al ., 2006)。
而有學者利用signature-tagged library selection 方式，篩選出多個 Streptococcus sanguinis 的突變株，在體外生物膜培養中會發生明顯缺失，然而，這樣的突變卻
擾細菌與血小板的結合而形成生物膜？在以往的研究中，免疫球蛋白
(Immunoglobulin)已經被發現可以黏附於 S. aureus 的表面，並進一步抑制 S. aureus 培養基培養生物膜的形成(Merino et al., 2009)。然而，有學者發現在 S. Sanguis 中，
S. Sanguis 可能藉由免疫球蛋白與血小板的 FcγRIIA 結合，進一步誘發血小板的活 化(Ford et al., 1997)。而在 S. pyrogenes 中也有報導指出，S. pyrogenes 可以藉由細 菌的表面蛋白M1 protein 先與血漿中的纖維蛋白原結合，並黏附到未活化的血小 板上，當血液中對抗M1 protein 的免疫球蛋白與 M1 protein 結合後，S. pyrogenes 可以藉由免疫球蛋白的Fc 與血小板的 Fc receptor 結合，最後誘發血小板的活化 (Shannon et al., 2007)。此外，在 Kahn 等人的研究中也發現，S. pyrogenes 可以利用 M1 protein 與纖維蛋白原及免疫球蛋白結合後，進一步活化血液中的嗜中性球 (Neutrophil)促使 heparin-binding protein 的釋放，引發血管的受損，最後造成鏈球 菌毒性休克症候群(streptococcal toxic shock syndrome)的發生(Kahn et al., 2008)。因 此我們猜測在缺乏血小板的狀況下，血漿中的免疫球蛋白很有可能去抑制細菌形 法改善心內膜炎病患常發生的血栓情形(Chan et al., 2003)。而在近期的研究中卻發 現給予病患抗血小板治療(antiplatelet therapy)可以有效減少病患血栓(Embolism)的 形成，但不影響六個月內病患的死亡率(Anevakar et al.,2007)。然而在 2009 年 Pepin 等人的研究中卻又有不同的發現，他們篩檢出有感染性心內膜炎早期症狀之病
人，並同時給予長期的抗血小板治療(Chronic antiplatelet therapy)後。他們發現這樣 長期的治療可以有效減低感染性心內膜炎造成的致死率，但並不會影響病患血栓 之形成(Pepsin et al., 2009)。此外，也有醫療案件指出阿斯匹靈的給予曾有效減輕 一新生兒的感染性心內膜炎中贅疣的增生(Adler et al., 2004)。根據這些研究結果，
迄今對於抗血小板藥物是否適用於感染性心內膜炎患者仍舊留有爭論。然而為何 這些抗血小板藥物(尤其是 salicylate 系列藥物)所造成之結果有如斯的差異，現在 主要有兩種想法:第一是個體間的差異性造成的藥物抗性不同。在臨床研究中發現 大約有5%至 45%的急性冠狀動脈症候群患者(Acute coronary syndrome patients)會 對阿斯匹靈產生抗藥性，而其中又有約8%到 18%的患者服用阿斯匹靈後，兩年中 會發生週期重複性的心血管問題(Mason et al., 2005)。此外，有學者也發現女性比 男性似乎更容易有阿斯匹靈抗藥性的狀況(Dorsch et al., 2007)，且低藥量的阿斯匹 靈(75 mg)可有效改善男性所發生的心肌梗塞(Myocardial infarction)情形，但對於女 性則無顯著差異(Kjeldsen et al., 2000)。第二是藥物劑量的多寡。在 Levison 等人 1977 年的研究中發現當他們給予感染性心內膜炎兔子單次高劑量的阿斯匹靈(600 mg)或批次性給與阿斯匹靈(75 mg)八次後，他們發現高劑量阿斯匹靈並無法減少贅 疣的增生與贅疣中的菌量(Levison et al., 1977)。然而，卻有另外的研究指出 24 小 時給予一次感染性心內膜炎兔子低劑量的阿斯匹靈(5 mg/kg)，總共五次後，可以 發現贅疣的重量與菌量有明顯的減少(Nicolau et al., 1993)。而在 Kupferwasser 等人 的研究中又更一步指出阿斯匹靈的治療效果並不會隨著濃度增加而增加，而是有 其治療的劑量範圍(Kupferwasser et al., 1999)。根據這些結果，現今的治療不斷嘗 試找出阿斯匹靈治療感染性心內膜炎的Goldilocks effect(恰到好處的效果)，但迄 今對於阿斯匹靈的劑量給與仍未有定論(Eison et al., 2008)。而在我的研究中先利用 ADP 將血小板先行活化後，我發現外加的血小板抑制劑便無法有效抑制細菌形成 生物膜，這也暗示血小板活化後細菌便可以黏附上去，形成生物膜。而在亞急性 感染性心內膜炎的發生過程中，第一步是心臟瓣膜要先有所缺損，造成血小板與 纖維蛋白的凝集後，草綠色鏈球菌才能有效黏附於受傷的瓣膜上(Moreillon et al., 2004)。就此我們推測在人工造成心臟瓣膜缺損時，便會誘發血小板活化凝集在受 傷的組織上，當我們將菌打入大鼠體內時，細菌便能黏附到活化的血小板上。而 給予抗凝血劑阿斯匹靈後，會抑制未活化的血小板受細菌刺激而活化，卻無法回 復已活化的血小板，因此我們雖然不能觀察到明顯的多層結構生物膜形成，但仍
可見到明顯的生物膜形成。而在人體中很有可能也是相似的原因造成阿斯匹靈無 法有效治療感染性心內膜炎病患。
2.PspC 蛋白表現的缺失影響轉糖鏈球菌體內生物膜的形成。
在本實驗室奇玄學長的研究中曾經發現在轉糖鏈球菌第十一對雙分子調控系 統(two component regulatory system)的 response regulator (RR11)發生缺失的菌株 中，可以觀察到其體內生物膜的形成有明顯的缺失(林奇玄，2008)。而在俊達學長 的研究中，利用microarray 的方式檢測野生株 GS5 與 RR11 mutant 基因表現的差 異，發現 pspC 基因在 RR11 mutant 中表現量會有明顯的下降。而我更進一步利用 染色質免疫沉澱法(Chromatin immunoprecipitation)證明 pspC 基因在體內很有可能 是直接受RR11 所調控。而利用生物資訊的方法找到 pspC 基因前段的 intergenic region 有一段約 16 mers ( GTTTATACTAATAGCA )的 DNA 序列，在多個可能受 RR11 調控的基因前段可能啟動子區位中有相當高的相似性。利用膠體電泳阻滯實 驗(electrophoretic motility shift assay)也更一步確定這段序列很有可能是 RR11 與 DNA 結合的區位。
在先前的研究中，Psp 蛋白首先是在 Escherichia coli 中被發現，當 E. coli 受到 絲狀嗜菌體(Filamentous phage)感染時，Psp 蛋白會大量被表現，因而稱為
phage-shock-protein (Psp) (Brissette et al., 1990)。此外，學者們發現 Psp 蛋白是一種 具高度保留性的蛋白，在大多數的革蘭氏陽陰性菌，如：Escherichia coli、Yersinia enterocolitica、Salmonella enterica 中，都有發現高度相似性的蛋白存在(Darwin ., 2005)。此外，在革蘭氏陰性菌中，Psp 蛋白的調控的生理機制多由數個 Psp 蛋白 所構成，一般也稱為phage-shock-protein system (Psp system)。其中以 E. coli 的 Psp system 研究較多也對其調控機制較為瞭解。在 E. coli 中，Psp system 主要被發現有
phage-shock-protein (Psp) (Brissette et al., 1990)。此外，學者們發現 Psp 蛋白是一種 具高度保留性的蛋白，在大多數的革蘭氏陽陰性菌，如：Escherichia coli、Yersinia enterocolitica、Salmonella enterica 中，都有發現高度相似性的蛋白存在(Darwin ., 2005)。此外，在革蘭氏陰性菌中，Psp 蛋白的調控的生理機制多由數個 Psp 蛋白 所構成，一般也稱為phage-shock-protein system (Psp system)。其中以 E. coli 的 Psp system 研究較多也對其調控機制較為瞭解。在 E. coli 中，Psp system 主要被發現有