Candida sp.、Candida tropicalis、Pichia sp.和
Saccharomyces cerevisiae 菌株，在給予 Fluconazole 的壓力下，發現並不是每種念珠屬都具有 W/O 表現型的轉換，而且也不是每一種念珠屬都會有抑制圈的產生。在以超音波震盪 12 分鐘後，經由 Fluconazole 敏感性試驗所培養的 十四株菌株中，在給予 Fluconazole 敏感性試驗( E-test )發現 S. cerevisiae 菌株會產生抑制圈，且有少許呈現紅色菌落、C. albicans 中包括 CaF、
14053、C1、C2、C3 和 C. parapsilosis包括 C6、C7 均產生明顯的抑制 圈，並且有清楚的 Opauqe 轉換現象(如 Figure 4-2 B、C、D、E、F、I、
J)。而 C. sp.包括 C8 及C. tropicalis 包括 C9、C10 沒有抑制圈的產生，
但是有清楚的Opauqe 轉換現象(如 Figure 4-2 K、L、M)。在 C. glabrata 包括 C4、C5 及 Pichia sp.包括P11 不但沒有抑制圈的產生，亦沒有 Opauqe 轉換現象(如 Figure 4-2 G、H、N)。
這個結果發現 S. cerevisiae、C. albicans、C. parapsilosis、C. sp.、
和 C. tropicalis 有 W/O 表現型轉換的現象，C. glabrata 和 Pichia sp.沒有 W/O 表現型轉換的現象，
C. glabrata
可能是因為本身就是單倍體，所以不 會有W/O 表現型轉換的現象。
Table 4-2 在念珠菌屬中，Fluconazole 對 Opaque 轉換及抑制圈的影響 菌種 有無抑制圈 內抑制濃度 (ppm) 外抑制濃度(ppm)
SC + 64
CaF +++ 2 0.38
14053 +++ 3 0.5
C1 +++ 8 0.75
C2 +++ 4 0.38
C3 +++ 6 0.5
C4 -
C5 -
C6 +++ 2 0.125
C7 +++ 16 0.25
C8 + 4
C9 + 0.75
C10 + 8
P11 -
Figure 4-2 在念珠菌屬中，Fluconazole 對 Opaque 轉換及抑制圈的影響
14053 C1 C2
C3 C4 C5
C6 C7 C8
C9 C10 P11
SC CaF
4-1.3 在 Terbinafine 的壓力下所產生的抑制圈，在抑制圈內外對白色念珠 菌 W/O 表現型的轉換之頻率
給予 200ppm Terbinafine 的 Paper Disc，觀察菌落抑制圈內外的六區 (如 Figure 4-4)，每區的 W/O 表現型轉換機率：在 L1 區，Terbinafine 影 響濃度最低，菌落呈現白色，Opaque 轉換機率為 0.23%、在 L2 區，
Terbinafine 影響濃度次低，菌落呈現白色，Opaque 轉換機率為 0.38%、
在 L3 區，Terbinafine 影響濃度中低，菌落呈現白色，Opaque 轉換機率 為 0.19%、在 L4 區，Terbinafine 影響濃度中高，菌落呈現紅色，Opaque 轉換機率為 7.10%、L5 區，Terbinafine 影響濃度次高，菌落呈現紅色，
Opaque 轉換機率為 4.90%、L6 區，Terbinafine 影響濃度最高，菌落呈現 紅色，Opaque 轉換機率為 0.52%(如 Table 4-3 及 Figure 4-3)。
挑選標準白色念珠菌菌株 14053 進行在 Terbinafine 的壓力下所產生 的抑制圈，在抑制圈內外對白色念珠菌 W/O 表現型的轉換影響。發現在 Terbinafine 的壓力下，抑制圈內部會有比較高頻率的 W/O 表現型轉換，
而在抑制圈外部的白色念珠菌菌落呈現白色(White Phase)的形態。以等距 區分白色念珠菌上面的位置分為六等份，以抑制圈最外圍接收到最低藥劑 濃度的區域稱為 L6 漸漸向內，越接近含有藥劑的貼片數字越小(如 Figure 4-3)，分別觀察 Plating 出來後的菌落其紅色菌落佔全部菌落的百分比。
可以明顯發現在抑制圈最外圍的一圈菌落即 L4 區，發生 W/O 表現型
Table 4-3 抑制圈內外對白色念珠菌 W/O 表現型的轉換影響
0.23 0.38 0.19
7.1
4-2 形態觀察
4-2.1 光學顯微鏡(Optical Microscopy)
利用光學顯微鏡觀察在 Terbinafine 壓力下的白色念珠菌形態。
4-2.1.1 每日觀察白色及紅色菌落的生長情況
分別利用光學顯微鏡觀察菌落巨觀形態及生長形態，觀察白色及紅色 菌落的生長情況。給予 Fluconazole 刺激，將抑制圈中菌落塗勻並以光學 顯微鏡觀察，其中第 4 天藥物刺激，菌落呈現白色；第 5 天藥物刺激，菌 落轉變成紅色，且菌數有些微增加；第 6 天藥物刺激，菌落呈現紅色，並 停止增加數量(如 Figure 4-5 箭頭 A)。第 4 天藥物刺激，菌落呈現白色；
第 5 天藥物刺激，菌落仍維持白色，且菌數大量增加；第 6 天藥物刺激，
菌落仍維持白色，並大量增加且覆蓋過紅色菌落(如 Figure 4-5 箭頭 B)。
以上結果均顯示在抑制圈中紅色的菌落生長到一定的時間，即會進入 停滯期，或是有紅色細胞從不生長，可能是已經死亡。而白色菌落生長快 速，若白色菌落存在紅色菌落旁，即會用很快的速度將紅色菌落蓋過。
Figure 4-5 觀察白色念珠菌在抑制圈內外之菌落不同時間點的形態
A B 4d
5d A
B
6d
A B
I
II
III
4-2.1.2 白色念珠菌細胞的形態
Terbinafine 刺激下，在光學顯微鏡下觀察白色念珠菌的形態，可以觀 察到一個母細胞(Parent cell)帶著兩個子細胞(Daughter cell)(如 Figure 4-6 A, B)、一個母細胞帶著三個子細胞(如 Figure 4-6 C, D)和一個母細胞帶著 四個子細胞(如 Figure 4-6 E, F)。
以上結果均顯示在 Terbinafine 壓力下的白色念珠菌，可以發現有類 似擔子菌的外型，像是有 Snoopy 掌印(如 Figure 4-6)，有一個母細胞帶有 2 個子細胞的構造、一個母細胞帶有 3 個子細胞的構造和一個母細胞帶有 4 個子細胞，類似擔子的構造。
Figure 4-6 Terbinafine 刺激下，在光學顯微鏡下觀察白色念珠菌的形態
A
B D
C E
F
4-2.2 共軛焦顯微鏡(Confocal microscopy)
利用螢光染色染出白色念珠菌的細胞核，在以共軛焦顯微鏡觀察給予 藥物 Terbinafine 的白色念珠菌細胞形態。在 Fluconazole 敏感性試驗 ( E-test )對念珠屬 W/O 表現型的轉換影響實驗中，選出四株可以在藥物的 壓力下發生高頻率 W/O 表現型轉換的白色念珠菌，分別為 14053、C1、
C2、CaW，在利用這四株菌觀察 1~2 星期的藥物處理下及 3~4 星期的藥 物處理下，白色念珠菌細胞核的變化。
在不同時間的 Terbinafine 處理，及利用 DAPI 將細胞核定位，以共軛 焦顯微鏡觀察白色念珠菌的細胞核分佈位置，以下照片藍色螢光為經由 DAPI 染色，細胞核所在位置。
在控制組中的 C. albicans 14053 白色念珠菌，每個細胞都會有一個 細胞核存在 (如 Figure 4-7)。在實驗組中的 C. albicans 14053、C1、C2、
CaW 白色念珠菌經由藥物處理 1~2 星期，在某些細胞中可以觀察到有 4 個細胞核存在的單一細胞(如 Figure 4-8、4-9、4-10、4-11)。
在實驗組中的 C. albicans 14053、C1、C2、CaW 白色念珠菌經由藥 物處理 3~4 星期，可以觀察到一個母細胞(parent cell)伴隨著兩個、三個、
或四個的子細胞(daughter cell)，且母細胞呈現凹陷狀，無核，並將四個核 送入新生之出芽子細胞中(如 Figure 4-12、4-13、4-14、4-15)。
中發現，也同樣的可以在 C1、C2 及 CaW 菌株中看到相同的情況。
Figure 4-7 C. albicans 14053 控制組
Figure 4-8 C. albicans 14053 藥物處理 1~2 星期
Figure 4-9 C. albicans C1 藥物處理 1~2 星期
Figure 4-10 C. albicans C2 藥物處理 1~2 星期
圖 4-12 C. albicans 14053 藥物處理 3~4 星期
Figure 4-14 C. albicans C2 藥物處理 3~4 星期
4-2.3 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy)
在掃描式電子顯微鏡中觀察在 Terbinafine 壓力下的白色念珠菌形 態，以 14053、C1、C2、CaW 這四株菌在 1~2 星期的藥物處理下及 3~4 星期的藥物處理下，白色念珠菌外表形態的變化。
在不同時間的 Terbinafine 處理，將白色念珠菌從抑制圈取出，觀察 1~2 星期以及 3~4 星期的菌株，其表面的形態變化。在控制組中的 C.
albicans 14053 白色念珠菌，每個細胞呈現圓形的形態，且有一些細胞正 在進行出芽生殖(如 Figure 4-16)。在實驗組中的 C. albicans 14053 白色 念珠菌，有一些細胞表現會有四個突起，類似擔孢子形成(如 Figure 4-17)。
在實驗組中的 C. albicans 14053、C1、C2、CaW 白色念珠菌，發現有很 類似 Snoopy 掌印的細胞，其母細胞都會有塌陷變成扁帄的狀況(如 Figure 4-18、4-19、4-20、4-21)。
以上結果均顯示在以 14053 為例，在 1~2 星期的藥物處理下，在白 色念珠菌的細胞中，可以發現有小細胞的產生，而且在一個大細胞的周圍 會有超過兩個小細胞的產生。而在 3~4 星期的藥物處理下可以發現有很類 似 Snoopy 掌印的細胞，其母細胞都會有塌陷變成扁帄的狀況。
Figure 4-16 C. albicans 控制組
Figure 4-17 C. albicans 14053 藥物處理 1~2 星期
Figure 4-18 C. albicans 14053 藥物處理 3~4 星期
Figure 4-19 C. albicans C1 藥物處理 3~4 星期
Figure 4-20 C. albicans C2 藥物處理 3~4 星期
Figure 4-21 C. albicans CaW 藥物處理 3~4 星期
4-2.4 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy)
在穿透式電子顯微鏡中觀察在 Terbinafine 壓力下的白色念珠菌形 態，以 14053 菌株在 Terbinafine 藥物處理下，白色念珠菌外表形態的變 化。
在控制組中的 C. albicans 白色念珠菌，細胞與細胞交接處呈現出芽 生殖的構造(如 Figure 4-22)。在實驗組中的 C. albicans 白色念珠菌，發 現細胞與細胞交接處有與控制組不同的構造，其構造是類似於擔子菌的子 座(如 Figure 4-23)。
Figure 4-23 C. albicans 控制組
Figure 4-24 C. albicans 經由 Terbinafine 藥物處理
4-3 在光學顯微鏡下觀察多重出芽細胞與 W/O 表現形轉換頻率之相 關性
利用光學顯微鏡觀察在 Terbinafine 壓力下的白色念珠菌形態，以 14053、C1、C2、CaW 這四株菌在 Terbinafine 藥物處理下，與經由 Plating 產生紅色菌落佔全部菌落的比例之間的關連性。觀察在 14053 菌株中，在 第一個星期到第三個星期，W/O 表現型轉換的頻率漸漸升高，而且在第三 個星期可以發現有最高頻率的 W/O 表現型轉換；觀察在 CaW 菌株中，在 第一個星期到第四個星期，W/O 表現型轉換的頻率漸漸升高，而且在第四 個星期可以發現有最高頻率的 W/O 表現型轉換；觀察在 C1 菌株中，在第 一個星期到第五個星期，W/O 表現型轉換的頻率之間差距不大，但它的 W/O 表現型轉換與控制組相比有些許的升高；觀察在 C2 菌株中，在第一 個星期到第四個星期，W/O 表現型轉換的頻率漸漸降低，而且在第四個星 期可以發現有最低頻率的 W/O 表現型轉換，之後再慢慢回升。
Figure 4-24 白色念珠菌 14053 控制組 Snoopy 掌印與 Opaque 轉換頻率
1WL 2WL 3WL 4WL 5WL Weeks
Percentage(%)
Opaque II III VI III+IV II+III+IV
14053 Lamisil
1WL 2WL 3WL 4WL 5WL Weeks
Percentage(%)
Opaque II III VI III+IV II+III+IV
C1 Lamisil
25 30
1WL 2WL 3WL 4WL 5WL Weeks
Percentage(%)
Opaque II III VI III+IV II+III+IV