参、實驗材料與方法
二 培養基 (culture medium)
Table 3-2 Culture medium used
Culture medium Ingredient Composition PDA** Potato dextrain agar 1.95%
PDAPCF PDAP medium with 4 ppm fluconazole and liquate freeze/thaw C. albicans
PDAPSF PDAP medium with 4 ppm fluconazole and suspension of 12 hr C. albicans in liquid culture
Glucose 0.1%
三、實驗方法(methods)
1. 選擇CaW菌株，在無菌操作台(THM-220, Tsao Hsin enterprise, Taiwan)中，從貼有Terbinafine貼片(disc，內含Terbinafine 200ppm /1ml ETOH)的Phloxine B-PDA帄板(plate)培養基中挑選 經由Terbinafine壓力下造成抑制圈中的紅色菌落。
2. 在此Terbinafine藥物的壓力下，將培養於Phloxine B-PDA培養基 中的白色念珠菌CaW利用接種環，挖取經由藥物處理所產生抑制 圈的抑制圈邊緣紅色菌落，約半顆米粒大小的菌量置入已加入無 菌Tween 80溶液的離心管中。
3. 將含有CaW白色念珠菌的離心管在震盪機上震盪3~5秒鐘，讓白色
5. 震盪好的菌液以細胞計數器(cell counter)調整菌液濃度直到細胞 濃度為105個/ml。
6. 將無菌棉棒浸入菌液內，於管內旋轉數圈後以角度120度之3個方 向均勻塗抹至Phloxine B-PDA培養基上。
7. 於室溫下培養24 ~ 48 小時，觀察紅色菌落佔全部菌落的比例。
3-1.2 Fluconazole 敏感性試驗( E-test )對念珠屬 W/O 表現型的轉換影響
1. 在無菌操作台中，以念珠菌屬的Candida albicans、Candida
glabrata、Candida parapsilosis、Candida sp.、Candida tropicalis
及酵母菌Pichia和Saccharomyces cerevisiae(如Table 3-1)，利用接 種環挖取白色菌落，約半顆米粒大小的菌量置入已加入無菌4. 震盪好的菌液以細胞計數器(cell counter)調整菌液濃度直到細胞 濃度為105個/ml。
5. 將無菌棉棒浸入菌液內，於管內旋轉數圈後以120度之3個方向均 勻塗抹至Phloxine-PDA帄板(plate)培養基上。
3-1.3 在 Terbinafine 的壓力下所產生的抑制圈，在抑制圈內外對白色念珠 菌 W/O 表現型的轉換影響
1. 在無菌操作台中，以含有Terbinafine之圓型濾紙片(Terbinafine 200ppm /1ml ETOH)的Phloxine B-PDA帄板培養基中挑選經由 Terbinafine壓力下造成抑制圈中的紅色菌落。
2. 將在Terbinafine藥物的壓力下，培養於Phloxine-PDA帄板培養基 中的白色念珠菌利用接種環，挖取經由藥物處理所產生抑制圈的
5. 震盪好的菌液以細胞計數器(cell counter)調整菌液濃度直到細胞 濃度為105個/ml。
3-2 形態觀察
分別利用顯微鏡觀察白色念珠菌的細胞形態，分別以光學顯微鏡觀察 每天白色及紅色菌落的生長狀況和單一細胞的形態、以共軛焦顯微鏡搭配 染色法觀察細胞核的改變、以掃描式電子顯微鏡觀察細胞表面構造的差異 及以穿透式電子顯微鏡觀察細胞內部的差異。
3-2.1 光學顯微鏡(Optical microscopy)
取以 Fluconazole 和 Terbinafine 處理造成抑制圈內、外以及週邊之少 許 C. albicans 菌體，以光學顯微鏡(DM 2500, Leica, Germany)觀察；菌 落(colony)之形態則以解剖顯微鏡(SM 2800, Nikon, Japan)觀察。
3-2.1.1 每日觀察白色及紅色菌落的生長情況
1. 在無菌操作台中，將在Terbinafine藥物的壓力下，培養於 Phloxine-PDA培養基中的白色念珠菌利用圓滑的毛細管(開口處 已用火將其變圓潤，已不至於破壞細胞)將菌塗開。
2. 在顯微鏡下觀察同一個地區連續三天，觀察白色細胞與紅色細胞 之間的關係。
3-2.1.2 白色念珠菌細胞的形態
1. 在無菌操作台中，將在Terbinafine藥物的壓力下，培養於
Phloxine-PDA培養基中的白色念珠菌利用細針，挖取抑制圈邊緣 的紅色菌落，約半顆米粒大小的菌量置入已加入無菌Tween 80溶 液的離心管中。
2. 將含有白色念珠菌的離心管在震盪機上震盪3~5秒鐘，讓白色念珠 菌可以均勻散佈在Tween 80溶液中。
3. 再利用超音波震盪機震盪，在12分鐘分別將震盪的菌液取出。
4. 震盪好的菌液先利用Tween 80稀釋100倍，再以稀釋過後的菌液 以細胞計數器(cell counter)觀察。
5. 在光學顯微鏡下觀察細胞計數器中的白色念珠菌，並將觀察到的 白色念珠菌加以拍照。
3-2.2 共軛焦顯微鏡(Confocal microscopy)
1. 前處理：準備長方形載玻片，在載玻片上面註明實驗日期、菌株 來源、處理藥物時間、處理藥物名稱。另外在載玻片上面以Blocking marker筆畫一個約十元硬幣大小的圈。在以Blocking圈中滴入約 100μl的ddH2O。
2. 在顯微鏡下觀察，將在有Terbinafine壓力下，培養1~2星期或3~4 星期的白色念珠菌利用無菌的細針，輕輕沾一些念珠菌之後，將 細針上的白色念珠菌輕輕的放到已加100μl的ddH2O玻片上的水 中，以劃圓圈的方式使菌可以均勻分布在以Blocking圈中，而且要 注意濃度不可以太稀或是太濃。
3. 等約30~40分鐘待載玻片上面的菌液變乾(注意：此時不可以讓菌 液乾太久，以免影響到實驗結果)。
4. 待菌液乾後，加入150μl的4% Formaldehyde再靜置20~30分鐘。
5. 將靜置後的玻片，以PBS清洗3次，再利用試鏡紙將Blocking圈以 外之的水漬擦乾淨。
6. 將擦乾後的玻片帄放入已經鋪好濕紙巾的微波盒中。在Blocking 圈中加入150μl的Blocking Buffer(Blocking Buffer內利用PBS為溶 劑再加入含有3% BSA、0.2% Triton-X100、0.1% Tween 20)，再 將微波盒用包鮮膜包住後放入4oC冰箱中過夜。
外之的水漬擦乾淨。
10. 在避光的情況下，將擦乾後的玻片加入3ng/ml的DAPI(溶劑為 HBSS)約150μl，靜置30~40分鐘。
11. 將靜置後的玻片，以PBS清洗3次，再利用試鏡紙將Blocking圈以 外之的水漬擦乾淨。
12. 在避光的情況下，將擦乾後的玻片加入50μl 20%Glycerol的 mounting solution，在蓋上蓋玻片，以透明指甲油封片。
13. 以雷射共軛焦顯微鏡(TCS SP5, Leica, Germany)觀察。
3-2.3 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy)
1. 前處理：準備直徑1公分的圓形載玻片及12 Well的Plate，在12 Well 的Plate上面註明實驗日期、菌株來源、處理藥物時間、處理藥物 名稱。直徑1公分的圓形載玻片頇先經過0.1% Tween 80溶液的浸 泡，在超音波震盪機上震盪30分鐘後，用70%的酒精清洗，再以 試鏡紙將圓形載玻片上面的水漬擦乾。在圓形載玻片上面滴入約 20μl的ddH2O。
2. 在顯微鏡下觀察，將在Terbinafine壓力下於以置含Terbinafine試 紙片之帄板，培養1~2星期或3~4星期的白色念珠菌利用無菌的細
4. 將圓形玻片置入12 Well的Plate，加入1 ml的Glutaldehyde，靜置 30分鐘。
5. 將靜置過後12 Well Plate中的Glutaldehyde倒掉，以ddH2O清洗3 次，每次5分鐘。
6. 加入1 ml 1%OsO4到12 Well的Plate中，靜置30分鐘。
揮發，即可送至電子顯微鏡室進行coating。
10. 以掃描式電子顯微鏡(S-2400, Hitach, Japan)觀察。
3-2.4 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope)
1. 在無菌操作台中，將在Terbinafine的壓力下，培養於Pholxine B-PDA培養基中的白色念珠菌利用細針，挖取抑制圈邊緣的紅色 菌落，約半顆米粒大小的菌量置入已加入50 ml PDB和含有濃度 10ppm Terbinafine的三角錐瓶中。
2. 將含有白色念珠菌的三角錐瓶在旋轉攪拌器旋轉3天，讓白色念珠 菌在Terbinafine的環境下經由旋轉可以增加分裂的速率。
3. 3天後，將三角錐瓶中的菌液以無菌dropper吸至TEM專用塑膠格 子中(吸取時要注意需要吸有菌體的部份)。
4. 靜置一天後，將至TEM專用塑膠格子送至電子顯微鏡室。
5. 以穿透式電子顯微鏡(H-600, Hitach, Japan)觀察。
3-3 在光學顯微鏡下觀察多重出芽細胞與 W/O 表現形轉換頻率之相 關性
1. 在無菌操作台中，將在Terbinafine的壓力下，培養於Pholxine B-PDA培養基中的白色念珠菌利用接種環，挖取經由藥物處理所 產生抑制圈的抑制圈邊緣紅色菌落，約半顆米粒大小的菌量置入 已加入無菌Tween 80溶液的離心管中。
2. 將含有白色念珠菌的離心管在震盪機上震盪3~5秒鐘，讓白色念珠 菌可以均勻散佈在Tween 80溶液中。
3. 再利用超音波震盪機震盪，在12分鐘分別將震盪的菌液取出。
4. 震盪好的菌液先利用Tween 80稀釋100倍，再以稀釋過後的菌液 以細胞計數器(cell counter)觀察。
5. 在光學顯微鏡下觀察細胞計數器中的白色念珠菌，並將觀察到的 白色念珠菌中帶有多重出芽(multiple budding稱為snoopy)的細胞 發生於抑制圈周圍內外之頻率。
6. 震盪好的菌液以細胞計數器(cell counter)調整菌液濃度直到細胞 濃度為105個/ml。
7. 將無菌棉棒浸入菌液內，於管內旋轉數圈後以相異之3個方向均勻 塗抹至PDA+PB培養基上。