2.1 昆蟲寄生真菌介紹與發展
昆蟲寄生真菌為可寄生在昆蟲上，汲取昆蟲養分，以昆蟲為生之真菌。目前 世界各地有 1000 種以上的真菌被鑑定可以感染昆蟲，大約有 10 種現正用來生物 防 治 或 正 在 開 發 中 。 比 較 常 見 的 有 白 殭 菌 屬 （ Beauveria ）、 黑 殭 菌 屬
（Metarhizium）、輪枝菌屬（Lecanicllium）、橙色真菌屬（Aschersonia）、多毛菌屬
（Hirsutella）和擬青黴菌屬（Isaria）(Hajek & Leger, 1994; Kabaluk et al., 2005; Gul et al., 2014)。 蟲、紅火蟻和森林害蟲等，其中 Paranosema locustae 已有產品上市多年，用來防 治蚱蜢 (Solter et al., 2012)。
2.1.2 游離胞子類真菌 (Zoosporic fungi)
具有鞭毛的真菌原先僅有壺菌門 Chytridiomycota，後來壺菌門再細分出芽枝 黴門 Blastocladiomycota 和新美鞭菌門 Neocallimastigomycota (Hibbett et al., 2007)。
其中蟲生真菌僅芽枝黴目 Blastocladiales 的幾個屬，Coelomycidium spp.可寄生在甲 蟲幼蟲、雙翅目的蛹和介殼蟲；Catenaria spp.多寄生於線蟲，少部分可寄生在昆 蟲；Coelomomyces spp.則需要交替寄生於孑孓和蟯足科動物上(Gleason et al., 2010)。
2.1.3 接合胞子類真菌 (Zygosporic fungi)
此類即以往的接合菌門，現被細分為 Glomeromycota 門，和四個亞門(Hibbett et al., 2007) 。 昆 蟲 寄 生 菌 主 要 在 Entomophthoromycotina 亞 門 內 的 Entomophthoraceae 科，例如：Strongwellsea spp. 寄生於雙翅目昆蟲、Massospora spp. 則好發於蟬類 (Benny, 2009)。Anyclistaceae 科中亦有少數昆蟲記生菌集中於
Conidiobolus spp.。Neozygitaceae 科中 Neozygites spp. 可寄生在纓翅目、半翅目昆 種。此目分成麥角菌科 (Clavicipitaceae)、蟲草科 (Cordycipitaceae) 和蛇型蟲草科 (Ophiocordycipitaceae) 。麥角菌科中無性世代的座殼菌 Aschersonia spp.可寄生於 柑桔介殼蟲 (Wang et al., 2013)；黑殭菌屬中 Metarhizium anisopliae 可寄生於鞘翅 目等昆蟲、綠殭菌屬 Nomuraea rileyi 則可防治鱗翅目昆蟲 (Ignoffo et al., 1976;
Quintela & Mccoy, 1997)。另外 Pochonia 和 Rotiferophthora 分別感染線蟲與輪蟲 (Zare et al., 2001)。蟲草科有 Torrubiella 屬可寄生在介殼蟲、蜘蛛上 (Johnson et al., 2009)；Cordyceps 屬內則有北方蟲草 (Fukatsu & Nikoh, 2003)；蟲草科的無性世代 白殭菌 Beauveria bassiana 可防治多種害蟲 (Ugine et al., 2005; Castrillo et al., 2010)、擬青黴菌屬中 Isaria fumosorosea 及臘玠輪支菌屬中 Lecanicillium lecanii, L.
muscarium 被用來防治溫室小型害蟲 (Goettel et al., 2008; Hamdi et al., 2011)。蛇型 蟲草科 Ophiocordyceps sinensis 為著名的中華蟲草寄生於蝠蛾；蛇行蟲草科無性 世代 Hirsutella spp. 有螞蟻、蟎類等寄主，而 Hirsutella sinensis 是中華蟲草的無 性世代。
2.1.5 擔子菌門
擔 子 菌 蟲 生 真 菌 較 為 稀 少 ， 只 在 Septobasidiales 科 內 ， Septobasidium, Auriculoscypha, Uredinella, Coccidiodictyon 和 Ordonia 這五個屬，均寄生於介殼 蟲中。這些菌也被認為與介殼蟲行互利共生，吸取介殼蟲的養分後，於蟲體上長
由於體壁上具有角質與外骨骼，真菌侵染昆蟲多經由口器、各節間或氣孔。 subtilisin (Pr1) 研究最為透徹。Pr1 為 M. anisopliae 之水溶性蛋白質酶基因。當 Pr1 基因被增強表現時，能水解更多角質蛋白，分解寄主的表皮並利用，與寄主致死 率成正相關。而此基因被終止時，寄主死亡率也降低。取液態培養 I. fumosorosea 的 上清液接種於小菜蛾上，會降低其取食和化蛹的能力，而此上清液經檢測內含有 蛋白質水解脢 Pr1 和 Pr2、幾丁質酶與脂質酶 (Ali et al., 2010)。
研究發現，許多蟲生真菌外泌的二次代謝物為昆蟲毒素，可使昆蟲中毒而 死。例如：Metarhezium spp. 會產生超過 28 種不同的毒素 destruxin。不同的 destruxin 對每種蟲類具有不同的致死性。而 Beauveria spp. 也會分泌毒素，例：oosporein, beauvericin, bassianolide。另外還有 Tolypocladium spp. 分泌 efrapeptins、Hirsutella thomposnii 分泌 hirsutellin‧而 Isaria fumosorosea 也會分泌毒素，例：beauvericin, beauverolides, dipicolinic acid, 2,6-pyridindicarboxylic acid (Asaff et al., 2005)。
蟲生真菌經由體表入侵後，進入體腔中殖據，所分泌的酵素與毒素干擾並抑 制寄主的免疫系統，經吸收寄主水溶性養分後，於體腔內繁殖芽孢 (blastospore)，
破壞並吸收寄主養分。當寄主無力負荷臟器運作，能量耗盡死亡後，真菌即利用 昆蟲殘體大量生長與繁殖。至感染末期，菌絲會由蟲體節間穿出，產生分生胞子 (aerial conidia)，經由外界之風、雨水傳播，或其他寄主動物的接觸，行下一次感 染 (Meyling & Eilenberg, 2007)。
2.3 昆蟲的防禦模式
在血細胞循環系統內，含有顆粒球 (granular cells)和漿細胞(plasmatocytes)，會 行胞噬作用或包膜作用 (encapsulation) 將入侵細胞隔離。視入侵細胞抵抗能力，
包膜的細胞會形成多層、多皺褶，並生成大量黑色素來阻絕入侵者代謝進而造成 死亡 (Vilcinskas & Götz, 1999)。
遭受感染的昆蟲，體內防禦反應之一是使蟲體內溫度增高，溫度過高不利於 蟲生真菌的生長。蝗蟲為抵禦 Metarhizium anisopliae var. acridum 的侵染，會讓體 內溫度快速升高，讓體內的芽孢胞子無法增殖，藉此拉長存活時間與降低死亡率 (Ouedraogo et al., 2003)。
2.4 環境對昆蟲寄生菌影響 2.4.1 溫度
真菌在遇高溫逆境時，細胞內會迅速產生耐熱逆境的物質，如：液態脂肪、
經熱休克後迅速合成的代謝蛋白質及抗熱結構組織 (John & Naresh, 1999)。在許多 生物中，細胞內含有較高的 polyol 和 trehalose 的含量，其耐熱、耐乾等耐逆境的 能力較高 (Fernandez et al., 2010; Hallsworth & Magan, 1996; Benoit, 2011)。要獲得 耐高溫的菌株，除於炎熱環境中篩選外，另於培養基中添加水楊酸或脂肪酸可以 生成耐高溫的分生胞子 (Rangel et al., 2012; Kim et al., 2010)，
2.4.2 濕度
真菌需要水分才能發芽和延伸菌絲。許多研究發現蟲生真菌需要在較高的濕
度下方能發芽，大都介於相對濕度 97-99%間。如：Beauveria bassiana 和 Isaria 成 UV-A、UV-B 與 UB-C。其波長分別為 320-400 nm、280-320 nm 與 100-280 nm。
紫外線中約有 95%為 UV-A。一般含有黑色素或顏色較深的真菌比較耐紫外線的照
2.5 Isaria javanica
Isaria javanica 舊名為 Paecilomyces javanicus。擬青黴菌屬 (Paecilomyces) 是 一種絲狀真菌，早期被分為兩類，一類存於土壤、腐植質、食品中，另一類為昆 蟲病原菌，皆可成為人體伺機感染菌或是食品汙染菌 (Schinabeck & Ghannoum, 2003)。於 1907 年隸屬於散囊菌目 (Eurotiales)，初期物種數不多，被認為是單系 群。1957 年 Brown 和 Smith 將原 Isaria 屬及 Spicaria 屬內，嗜中溫並與昆蟲有 關的菌歸於 Paecilomyces 屬中。Samon 於 1974 年將 Paecilomyces 中特徵為嗜高 溫，具散囊型態分生胞子定為 Paecelomyces 群 (sect. Paecilomyces)，而將原位於 Isaria, Spicaria 屬中的菌定為 Paecilomyces Isariaoidea 群(sect. Isariaoidea)。2004 年 Luangsa-ard 等人運用 18S rDNA 確定 Isariaoidea 群與 Paecilomyces 群親緣關係 遠，其中 Paecilomyces 群較接近青黴菌屬，也證明 Paecilomyces 屬不為單系群，
不應將兩群歸為同一屬。包含 Paecilomyces 屬的模式物種之有性世代經 rDNA 鑑 定 為 Byssochlamys ， 而 Isaria 屬 的 有 性 世 代 則 為 Cordyceps ， 作 者 並 認 為 isariaoidea 群中物種依然不是單系群 (Luangsa-ard et al., 2004)。
Isaria javanica 最早於 1957 年由 Friedrichs 與 Bally 記載於英國 British Mycological Society 期刊 (Brown & Smith, 1957)，有性世代經 18S rDNA 比對屬子
囊菌門 (Ascomycota)肉座菌目 (Hypocreales) 蟲草菌科 (Cordycipitaceae) 中的 Cordyceps sp.。傳統鑑定上，以其菌落顏色和生理型態諸如：分生胞子梗、分生胞 子形態來辨別種。
它是一種寄主廣泛的蟲生真菌 (entomopathogenic fungi)，於自然界中主要於鱗 翅目幼蟲上發現，亦可寄生於雙翅目、半翅目、等翅目等昆蟲上。被寄生初期， (inoculative control)與淹沒式防治 (inundative control)，古典生物防治主要防治外來 入侵種，特指引進入侵種當地天敵來進行防治。此需經過縝密的試驗，確認外來
& Birthisel, 2014)。
油分散劑 (oil dispersion, OD)：一種或一種以上固體穩定懸浮於油性溶劑中，
使用前需加水稀釋攪拌。因油劑可防止胞子內水分散失，油性態下又較容易附著 於昆蟲體壁上，下雨時，又不怕雨水沖刷，且具有部分反射紫外線的效果。但胞 子懸浮於溶液上方，噴灑時需要不斷的攪拌，才能均勻散佈於溶液中。可製作成 超低容量製劑 (ultra-low volume (ULV) application)，降低藥劑用量。
水基乳劑 (emulsion, oil in water (O/W), EW)：添加界面活性劑的油滴與有效成 分混合，再施用前以水劑稀釋，使包被真菌胞子之油滴分散於水中。分散效果較 油分散劑佳，且也兼具油劑不被雨水沖刷、容易附著於葉表昆蟲體表的優點，目 前廣泛被製為真菌微生物製劑。
多重乳劑 (double emulsion)：將有效成分包被於水相中，外再覆一層油滴，使 用時添加水劑稀釋，則可見內含原體的小水滴包被在大油滴中，大油滴又與外界 的水劑成乳化狀態。此劑型具乳劑優點，且更不易乳水分離。惟製作時有難度。
微膠囊 (capsule suspension, CS )技術：雖然微膠囊的技術在實驗室中已探討多 年，但將其商業化呈產品仍相當有限。主因是製作過程較昂貴且防治成效較緩慢。
水懸劑 (suspension concentrates, SC)：原體經水等溶液混合，即一般的懸浮菌 液，使用時須注意有效物質是否均勻。
可濕性粉劑或粒劑 (wettable powder, WP)：將真菌原體(胞子或菌絲片段)風乾 後，加入惰性載體及介面活性劑加以製成。惰性載體可為高嶺土、紅土、矽藻土、
滑石粉等不會與介面活性劑、環境或胞子發生不良反應之物質。有些在製作過程 中會添加養分保持真菌活性 (Skinner et al., 2012)。因其方便農民施用、儲存，製 造成本低廉，目前為微生物製劑主要的劑型。
水分散性粒劑 (water dispersible granules, WG)：因水分散性粒劑包裝上較為方 便，搬運過程中不會揚起粉末，對人體健康較佳；且粒劑投入水中後可在 2 分鐘 內溶於水中開始施用，因此逐漸成為水懸粉劑和可濕性粉劑的替代品。它溶解後 的顆粒更為細小，更均勻，但相對成本較高。Hsia et al. (2014)將 M. anisopliae 中 添加不同鈉鹽為輔劑並製作成此劑型，其中 sodium lingosulfonate, sodium acetate 經高溫 45℃暴露 30 分鐘後仍有高發芽率。
2.8 大量培養
大量培養蟲生真菌的目標為：在低廉的成本下，生產出數量高、致病力高、
穩定性高的良好接種源。絲狀真菌喜歡生長在營養高的基質上，多數農業廢棄物、
殘餘物、穀物、蔬菜、種子皆可生長 (Sahayaraj & Namasivayam, 2008)。依基質狀 態，可分成固態培養與液態培養。固態培養於基質表面生成氣生分生胞子；相較 於液態培養多於液體中生成芽生孢子 (blastospore) 和菌絲球。氣生分生胞子壁較 厚、耐環境逆境，且儲藏的穩定性高，較不易喪失活性 (Arzumanov et al., 2005)。
因此，目前微生物製劑商品化中的真菌原體仍以氣生分生胞子為大宗。現今培養 技術多為雙相培養生產系統 (diphasic production system)，即以液態培養基生產接 種源，再接種至大量的固態基質上培養分生胞子，此方法具有接種操作簡便、降 低雜菌汙染及接種胞子源齡期相近的優點 (Machado et al., 2010)。
在基質上大量培養時，除基質營養成分選擇外，尚要顧及基質含水量、水活 性、產胞空間密度和熱梯度。Arzumanov et al. (2005) 以 500 g 的米作為培養基質，
分別測量通氣與含水量對 M. anisopliae var. acridum 生長產胞的影響，發現產胞時 氧氣需求量低，通氣與否對產胞量沒有太大影響；而基質含水量在 57-58%間，經 培養可獲得最多的分生胞子，低於或高於此含水量都會阻礙分生胞子生成。Ye et al.
(2006) 針對開發中國家大量生產蟲生真菌，設計了一種廉價、簡易的箱型裝置，
fumosoroseus，待產胞後連同基質置於 50℃中 2 小時，分生胞子仍有 91.2%的發芽 率。比較以米、大麥或高粱培養後之 M. anisopliae，經儲藏於 4℃半年後，大麥與
fumosoroseus，待產胞後連同基質置於 50℃中 2 小時，分生胞子仍有 91.2%的發芽 率。比較以米、大麥或高粱培養後之 M. anisopliae，經儲藏於 4℃半年後，大麥與