第三章 材料與方法
第二節 實驗方法
四、 流式細胞儀分析 (Flow Cytometry)
原理：
細胞在早期程序性細胞死亡 (programmed cell death)時，也就是細胞 凋亡(apoptosis)，磷脂絲氨酸 phospholipid phosphatidylserine (PS)從細 胞膜內層轉移至外層，此時PS暴露在細胞外可與Annexin V結合。
Annexin V大小約35~36 kDa ，為一種具鈣離子依存性的磷脂質結合 蛋白，且它與PS有高度的專一性。因此，藉著使Annexin V帶有螢光 物質 (如FITC)可觀察到細胞PS外翻的程度，進而以流式細胞儀偵測 螢光強度，再統計分析觀察細胞凋亡的程度。且配合它種螢光染劑 (Propidium Iodide, PI)更能區分出細胞凋亡的時期，如細胞存活 (Annexin V/ PI ; -/-)、早期細胞凋亡 (Annexin V/ PI ; +/-)、晚期細胞 凋亡或細胞死亡 (Annexin V/ PI ; +/+)(37)。
步驟：
本實驗使用BD生化公司生產的Annexin V-FITC apoptosis detection kit。分別以2×105 cells/1.5 ml的密度種入6 well的培養盤，以DMSO為 溶劑，最後加入1.5 ml不同濃度(S)-HDAC-42 (0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、
0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1 μg/ml)，以最高濃度DMSO為control組。等 待培養時間48小時，以1500 rpm離心5分鐘收取細胞，去上清液，以 PBS清洗後，加入100 μL PBS轉至FACS 管中，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，震盪均勻後於室溫 (25oC) 避光反應，再加入400 μL 1X binding buffer終止反應，再以流式細胞儀收集10000顆細胞分 析螢光量，之後以CellQuest®軟體分析。
五、 西方墨點法 (Western blotting) (一) 細胞總蛋白的抽取
步驟：
培養細胞之細胞數約 2×106/well，將人類多發性骨髓癌細胞株(U266, IM-9 and RPMI-8226)種於 10 cm2 dish 培養盤中，給予(S)-HDAC-42 最後濃度0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1 μg/ml 培 養48 小時後收集細胞，收細胞離心兩次後，將細胞收取下移至 1.5 ml 的eppendorf tube，加入 lysis buffer（依細胞量來增添 lysis buffer 的 量），震盪2 分鐘，置於-20℃，隔夜後，離心 14000 rpm、20 分鐘，
取上清液此為總蛋白質，即可置於-20 ℃冰箱保存備用。
(二) 蛋白質濃度的測定 (1) 蛋白質定量
步驟：
取 2 μl 收下來蛋白質與 5 倍稀釋的 Bradford 染劑 200 μl 混合，作三 重覆以增加準確度，測定吸光值，所得之吸光值平均，扣去背景值，
將最小值設為最高 loading 量(如：10 μl 或 15 μl)，依照比例方式推算 出其他 loading 值。
(2) SDS-PAGE 電泳分析
A﹒試劑材料（表一至表六）
組成 10﹪separation gel
（四片量）
12﹪separation gel (四片量) 40﹪acrylamide/Bis（29:1） 5 mL 6 mL
running buffer 5 mL 5 mL
10﹪SDS 0.2 mL 0.2 mL
10﹪APS 0.2 mL 0.2 mL
TEMED 20 μL 12 μL
表一、SDS-PAGE 下層膠（separation gel）之配製及組成
組成 stacking gel（四片量）
D.D.Water 4.06 mL
40﹪acrylamide / Bis（29：1） 1.02 mL stacking buffer 1.66 mL
10﹪SDS 66 μL
10﹪APS 33.4 μL
TEMED 12 μL
表二、SDS-PAGE 上層膠（stacking gel）之配製及組成
組成 重量
Tris 36.3 g
D.D.Water 150 mL
HCl 調整至 pH 值為 8.8
加D.D.Water 到總體積為 200 mL
表三、電泳緩衝液（running buffer；1.5 M Tris-HCl, pH 8.8）之組成
表四、stacking buffer（0.5 M Tris-HCl, pH 6.8）之組成
組成 重量
Tris 3 g
D.D.Water 40 mL
HCl 調整至pH 值為 6.8 加D.D.Water 到總體積為 50 mL
B﹒電泳膠片製作
將配製好的下層膠（表一）注入鑄膠台中，再以 isopropanol 去除 氣泡並壓平下膠，靜置一段時間，可觀察管子當中的剩餘下層膠 是否凝固，約需 40 分鐘使下層膠凝固後，將 isopropanol 倒掉，注 入上層膠（表二）並插上 comb，並避免 comb 的下緣有氣泡產生，
待上層膠凝固約需 15 分鐘。
C﹒電泳 (Electrophoresis)
將製好的膠體放置於電泳槽中，加入電泳緩衝液（running buffer；
表三），預先將將萃取出的蛋白質與4X sample buffer 混合並以 95
℃加熱 10 分鐘後，在冰上冷卻後低速離心，依序將標示標準分子 量的 multimaker 5 μL 及各 sample 注入膠體的孔槽中，通以電壓 90 伏特（volts），待樣品通過stacking gel 後，電壓調高為 110 volts，
繼續進行電泳，當SDS-PAGE 染劑跑到 SDS-PAGE 膠片底部後或 視需要，即可停止電泳。
D﹒轉漬步驟 (Transfer)
先將 PVDF membrane 事先裁剪好，以 methanol 濕潤 10 秒後，再 浸入轉漬緩衝液中（transfer buffer；表五），接著將事先裁好的 3M 濾紙先浸泡在 transfer buffer 中備用，將轉漬夾打開後，黑色面 為底部並朝上，將預先以transfer buffer 潤濕的海綿墊片鋪在黑夾 上，再將3M 濾紙鋪上，接下來裁剪下層膠中所要轉漬的區域後，
將SDS-PAGE gel 小心的鋪於 3M 濾紙上，可在濾紙上加入多量的 transfer buffer，鋪上 SDS-PAGE gel 時勿陷入任何氣泡，依序放上 PVDF membrane（同樣避免氣泡產生），及 3M 濾紙，最後放上一
溫狀態，以免在轉漬的過程中，因溫度過高而熔化SDS-PAGE gel。
以100 mA、90 分鐘的條件下進行蛋白質轉漬。轉漬完成後取出轉 漬膜裁去多餘部分，轉漬膜以0.05﹪的 tween-20 / 1X PBS 清洗 3 次，每次至少5 分鐘。緊接將轉漬膜以 5﹪的牛奶（溶於 0.05﹪tween 20 / 1X PBS 中）進行 blocking 的步驟，以室溫 1 小時為條件進行。
blocking 之後以 0.05﹪的 tween 20 / 1X PBS 清洗轉漬膜 3 次，每次 至少5 分鐘。倒掉清洗液，加入 3~5 ml 的一級抗體（溶於新鮮配 製的blocking solution 中，稀釋倍數依不同抗體有所不同），在 4 ℃ 下進行搖盪。隔天一級抗體回收，再以0.05﹪的 tween 20 / 1X PBS 清洗轉漬膜3 次，每次至少 5 分鐘。加入 8 mL 稀釋 10000 倍的 goat anti-IgG（HRP）horseradish peroxidase conjugated antibody 二級抗 體（溶於含2﹪FBS 的 0.05﹪tween 20 / 1 X PBS 中），於室溫下 搖盪1 小時，最後取出轉漬膜，以 0.05﹪的 tween 20 / 1 X PBS 清 洗3 次。
表五、轉印緩衝液（transfer buffer）之組成
Figure 5. 西方墨點法-轉漬夾的內部組成
組成 重量
Tris 4.5 g
glycin 21.6 mL
methanol 300 mL
加D.D.Water 到總體積 1500 mL
紅、正極（＋）
黑、負極（－）
E﹒暗房壓片步驟
將轉漬膜浸泡於ECL混合液中（每瓶各取2 mL等比例混合）1分鐘 反應，轉漬膜並正面朝上放置於壓片卡匣（cassette）內的兩張透明 投影片中間，以hyperfilm軟片置於上層投影片上，對齊轉漬膜進行 壓片，感光時間依轉漬膜上螢光亮度決定時間長短，約15秒至30分 鐘不等。感光完後放入顯影劑進行顯影步驟（時間依實際觀察決 定），再以清水沖洗後浸泡在定影劑中，過30秒後再浸泡清水沖洗。
表六、PBS-tween 20 之組成
組成 重量
Tween 20 500 μL
PBS 1000 mL
下膠 0.5% low melting agarose 0.5% normal agarose 上膠 0.5% low melting agarose
表七、 上下膠之組成
表八、Lysis buffer 之組成 (新鮮配置 pH=8~10)
組成 重量
NaOH 12 g
EDTA-Na2 0.3742 g DDW 加至 1000 ml
表九、Alkalin buffer 之組成
組成 重量
Tris 48.456 g
DDW 加至 1000 ml
組成 重量
5M NaCl 100 ml 1M Tris-HCl 2 ml
0.5M EDTA 40 ml
Triton 2 ml
DDW 56 ml
六、 DNA 裂解與電泳分析 (一)彗星實驗 (Comet assay)
原理：
PI是一種核酸螢光染劑，會專一性的結合在DNA雙股螺旋之小溝，當細 胞產生凋亡時會有染色質皺縮、DNA斷裂現象。因此當凋亡的現象越嚴 重，DNA斷裂越多。使用buffer使細胞膜不穩定，再經過電泳片段DNA 的部分便會被電極拉出細胞外，所以經過PI後的細胞，在顯微鏡下觀察 時，即可觀察到凋亡細胞所產生的拖尾現象，其形狀如慧星一般，故稱 為彗星實驗。
步驟：
培養細胞之細胞數約1×105/well。將人類多發性骨髓瘤細胞株（IM-9）
種於6 well培養盤中，給予(S)-HDAC-42最後濃度0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、
0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1 μg/ml 培養48小時後收集細胞，收取細胞，以 PBS將細胞清洗並打散，將下膠(表七)以微波爐加熱融化，於磨砂玻片 上加70 μl的下膠，蓋上蓋玻片，要注意不可有氣泡產生，凝固後小心將 蓋玻片拿下，取10 μl細胞液與70 μl上膠(表七)混合均勻，將混合液取70 μl加於下膠之上，再蓋上蓋玻片後至於冰上，凝固後拿下蓋玻片，再將 整片膠浸於Lysis buffer (表八)中一個小時，再轉浸於Alkalin buffer (表九) 中20分鐘，接下來置於電泳槽中以25 V 300 I的條件跑膠30分鐘，結束後 再泡在0.4 M Tris buffer (表十)中數分鐘，再浸於methanl中5分鐘，最後 加40 μl的PI作染色於螢光顯微鏡下觀察。
(二) TUNEL assay (PI / FITC staining) 原理：
TUNEL assay，為 Terminal transferase dUTP nick end labeling 的簡寫，nick 指的是 DNA 的缺口，當細胞凋亡發生時會有 DNA 斷裂的特徵，terminal transferase 則是會去辨認 DNA 的缺口，並且進行把 dUTP 補上 DNA 的 反應，我們會加入特殊的 dUTP，也就是由溴染色以作為 marker 的 BrdUTP。所以看到 DNA 發出綠光，就表示該細胞進行 apoptosis。
其中 PI 為一 DNA 染劑，染色原理是利用其在細胞膜完好的狀態下，不
能穿透細胞膜，但在細胞膜不完整的時候，則可穿透細胞膜，與 DNA
結合在一起，這樣的特性。當 PI 與 DNA 結合時，會發出紅色螢光。
步驟：
培養細胞之細胞數約 1×105/well。將人類多發性骨髓瘤細胞株（IM-9）
種於 6 well 培養盤中，給予(S)-HDAC-42 最後濃度 0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1 μg/ml 培養 48 小時後收集細胞，收取 細胞，以PBS 將細胞清洗並打散，加入 70%的冰酒精，將細胞液取 70 μl 置於玻片上，再置於冰上或冰箱15 分鐘~2 小時，用 PBS 清洗兩次，加 入已配置好的DNA-labeling solution (表十一)室溫反應 1 小時，而後再 用rinse buffer 清洗 5 分鐘，加入 antibody staining solution (表十二)避光 反應30 分鐘，在加入 PI 試劑避光反應 30 分鐘，最後用 PBS 清洗兩次，
即可於螢光顯微鏡下觀察。
表十一、DNA-labeling solution 之組成
表十二、Anti-body staining solution 之組成
組成 重量
Reaction buffer 10 μl TdT enzyme 0.75 μl
BrdUTP 8 μl
DDW 31.25 μl
組成 重量
Alexa FluorR 488 dye-labeled anti-BrdU antibody
5 μl
Rinse buffer 95 μl
第三章 實驗結果
第一節 SAHA 和(S)-HDAC-42 對人類骨髓癌細胞株(U266, IM-9 and
RPMI-8226)的存活率及型態影響之探討
人 類 骨 髓 癌 細 胞 株(IM-9) 經 過 培 養 ， 並 加 入 特 定 濃 度 實 驗 藥 物 ((S)-HDAC-42)作用 48 小時後，用顯微鏡觀察其存活率及細胞型態。由觀察結 果顯示，(S)-HDAC-42 並不會造成細胞型態的改變(Figure 7A)，但細胞的數目 則有明顯的下降(Figure 7B)。
人類骨髓癌細胞株(U266, IM-9 and RPMI-8226)經過培養，並加入特定濃 度實驗((S)-HDAC-42 and SAHA)後，在不同的時間點(24h, 48h and 72h)，利用 MTS 試劑來測定藥物對細胞的毒殺作用。統計結果顯示，三株人類骨髓癌細 胞株(U266, IM-9 and RPMI-8226)皆有隨著藥物濃度及其作用時間的上升，存 活率下降的趨勢(Figure 8)。
第二節 (S)-HDAC-42 對人類骨髓癌細胞株(IM-9)的細胞凋亡引發之影響
一、 利用流式細胞儀(Annexin V/PI staining)探討(S)-HDAC-42對人類骨髓癌細 胞株(IM-9)的引發細胞凋亡之影響
當細胞進行細胞凋亡(apoptosis)時,細胞膜的磷脂絲氨酸會外翻(原 本只存在內膜)到外膜,(PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在於細胞 膜的内面，在細胞發生凋亡時才外翻)而外翻的PS會被Annexin V辨識並 結合,所以在偵測細胞有無凋亡時可用此種蛋白作為辨識的工具。以 DNA染劑—PI檢測細胞膜是否完整，同時作為篩選過於碎裂而不足以作 為探討對象的細胞。
在實驗結果分析方面可依照兩種染劑的反應狀況分為四個象限：(Figure 6)
Figure 6. Flow cytometry data analysis
從X軸區分是否偵測到Annexin V的反應，也就是判別PS是否有外翻現 象。從Y軸區分是否偵測到PI的反應，有就是細胞膜不完整而被PI結合 於DNA之上。依照細胞的狀況不同區分的四大類細胞：
Q2：Necrosis / late apoptosis cells Q3：Living cells
Q4：Early apoptosis cells
在本實驗中，當人類骨髓癌細胞株（IM-9）經(S)-HDAC-42處理48小時 過後，隨藥物濃度增加，其Q3的訊號比例降低，相對Q4的訊號比例則 是隨之上升(Figure 9)。
Living cells
Necrosis / Late Apoptosis
Early Apoptosis
二、 利用comet assay探討(S)-HDAC-42對人類骨髓癌細胞株(IM-9)的引發細胞 凋亡之影響
在本實驗中，人類骨髓癌細胞株(IM-9)經過培養，並加入特定濃度 實驗藥物((S)-HDAC-42)作用48小時後，最後經過PI染劑標定DNA。由 結果顯示，隨藥物濃度增加，其拖尾現象及其出現的比例隨之上升 (Figure 10)。(S)-HDAC-42對於人類多發性骨髓癌細胞株( IM-9)，是具有 引發DNA斷裂，進而促進細胞凋亡能力的。
三、 利用 TUNEL assay 探討(S)-HDAC-42 對人類骨髓癌細胞株(IM-9)的引發 細胞凋亡之影響
三、 利用 TUNEL assay 探討(S)-HDAC-42 對人類骨髓癌細胞株(IM-9)的引發 細胞凋亡之影響