實驗藥物：(S)-HDAC-42

第二章緒論

第一節實驗藥物：(S)-HDAC-42

本實驗使用藥物為化學合成藥物(S)-HDAC-42，為一 Phenylbutyrate 的衍生物，同類藥物例如：Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)，目前已為臨床試驗用藥(17)。其主要功能為細胞中組蛋白去乙醯酶 Histone deacetylaes (HDAC)的抑制劑，Histone (組蛋白)的乙醯化修飾，在細胞中基因轉錄機制中扮演重要角色，也是在癌化過程中的重要指標之一 (18-19)。可以使組蛋白乙醯化恢復而促使相關基因轉錄，在癌細胞中有許多因突變或外在因素影響而被造成沉默的基因，如 Bcl-2 或 p53 等 anti-apoptotic protein，可經由此機回復表現，達到抗癌效果(20-22)。

然而除了對組蛋白乙醯酶抑制效果的認知以外，(S)-HDAC-42 對癌細 胞生

長、分化及凋亡的詳細機制尚未完全明瞭。但已有相關文獻指出，SAHA 能使人類白血病細胞株細胞走向intrinsic and extrinsic apoptosis pathway (14)。SAHA 和(S)-HDAC-42 能抑制前列腺癌細胞生長，而(S)-HDAC-42 具有較佳活性。經由調節Akt signaling、mitochondrial integrity 和 caspase activity 能促使細胞走向凋亡 (13) 。以上這些文獻都支持 SAHA 與 (S)-HDAC-42 在前列腺及白血病等癌細胞中，具有引起細胞生長抑制、細 胞週期停滯甚至凋亡等現象出現(15-16)。

第二節實驗癌症的探討 一、癌症

就台灣地區而言，癌症，自民國七十一年來已連續二十幾年高居國人死因之首位(1)，且癌症的發生率及死亡率皆有逐年升高的趨勢，癌症的形成可能藉由各種環境因素、遺傳因子所衍生而來，例如（a）化學物質：亞硝酸胺、油煙、某些染料等等。（b）輻射線：X 光射線、核爆炸等。（c）其他：日光中的紫外線可能和皮膚癌的形成有關。以上種種都可能讓附近的細胞產生變化，而造成癌症(23)。

二、多發性骨髓癌

多發性骨髓癌（Multiple myeloma）是一種惡性腫瘤。主要是一種被稱為『漿細胞』(Plasma cells)的白血球癌化病變而成。

當癌病變發生在漿細胞，身體會一直大量複製產生許多不需要的漿細胞，它們是一群不斷增生的不正常細胞，被稱為骨髓癌細胞。骨髓癌

細胞傾向聚集在骨髓內或在骨頭外側兩端的堅硬部份，有時候只聚集在一根骨頭上，形成單一腫塊或腫瘤，被稱為漿細胞瘤(Plasmacytoma)。

大部分的患者，不論骨髓癌細胞是否聚集在許多骨頭中，通常都會形成許多發性腫瘤而造成問題，因此這種情況被稱為多發性骨髓癌(24-25)。

三、漿細胞

漿細胞和其他白血球一樣屬於免疫系統的部份，這個系統可以保護身體免於感染和疾病。所有的白血球都源生於骨髓內。骨髓是柔軟的海綿狀組織，充滿在大多數骨骼中央。形成後的白血球會離開骨髓，再到身體其他部位發展成熟。例如當免疫系統需要它們抵抗可能引起感染或疾病的外來物時，它們就會長成漿細胞。漿細胞可以產生抗體，抗體能從血流中移動出來對抗有害物質。但漿細胞的功能有其特異性，某一類的漿細胞能夠針對特定的外來物質大量產生那一類的抗體來對付它，也就是說這些特異性的抗體被產生出來後，它們會尋找出並對抗被標的的外來物質。也因此身體有許多種類的漿細胞好來應付許多不同的外來物質(26)。

四、多發性骨髓癌的成因

白血病的病因是多重的，包括：遺傳及基因突變、放射線污染的環境（如核爆）、病毒感染（如日本的 HTLV－I 病毒）、化學藥劑的刺激、免疫能力的缺陷，以及病人體質因素（癌基因的表現型）等。

目前為止，研究專家尚未明確的證據顯示何種因素是增加罹患多發性骨髓癌的危險因子。多數人發生多發性骨髓瘤並沒有明確的危險因子，這個疾病可能是由許多已知或未知的原因同時造成的(2)。

五、臨床症狀

多發性骨髓癌的症狀要視疾病的嚴重度而定，通常在疾病初期是無症狀的。由於患有多發性骨髓癌的患者體內有大量不正常的漿細胞，這些骨髓癌細胞與抗體們會導致患者出現嚴重的臨床症狀，例如：

1. 當骨髓癌細胞大量增生時會破壞正常骨頭組織，使骨質脆弱，導致疼痛或容易骨折。這種骨頭疼痛會導致患者移動困難。

2. 當骨頭受損時，骨中的鈣質會釋放到血液中導致高血鈣症 (Hypercalcemia)。高血鈣症可能造成患者失去食慾、噁心、口渴、疲倦、肌肉無力、靜坐不能和意識混淆等症狀。

3. 骨髓癌細胞會阻止骨髓生成正常漿細胞或其他身體所需的白血球，這會讓患者無法抵抗感染或疾病

4. 多發性骨髓癌患者的腎臟也可能有嚴重的問題。過多的抗體蛋白質和血鈣阻礙了腎臟平常過濾和清潔血液的功能(12, 27-28)。

六、多發性骨髓癌的治療

1. 化學治療：雖然治療效果可達 70%，但疾病緩解之後，若不繼續接受治療，復發的機率相當高。

2. 骨髓移植：可分自體骨髓移植及異體骨髓移植，自體骨髓移植是輸入自己的骨髓；而異體骨髓移植則是輸入捐贈者的骨髓。

3. 放射線療法：一般對象為急性淋巴球性白血病病人，癌細胞容易侵犯病人的中樞神經系統，因此常會安排做預防性的放射線治療(29)。

七、研究動機

z AML (Acute myelogenous leukemia) 急性髓細胞性白血病 z AML (Chronic myelogenous leukemia) 慢性髓細胞性白血病 z ALL (Acute lymphocytic leukemia) 急性淋巴球性白血病

z CLL (Chronic lymphocytic leukemia) 慢性淋巴球性白血病

CML / AML

而多發性骨髓瘤 MM (Multiple myeloma)，則是 B 淋巴球因活化而成熟為漿細胞(Plasma cells)時發生病變所產生的癌細胞，其細胞種類皆類同。

在目前文獻已有指出 SAHA 對於多發性骨髓瘤能夠抑制其生長並引發細胞凋亡(33)，而在前列腺癌等研究指出，同樣身為組蛋白抑制劑 (HDACi)的藥物— (S)-HDAC-42，比起 SAHA 具有較好的抑制癌胞生長 與引發凋亡的活性，再加上HDACi 已在 CLL 細胞中顯現出有促進凋亡的作用。根據以上種種研究結果(34-35)，我們可以合理的推測

(S)-HDAC-42 也許對於多發性骨髓瘤具有類似的效用。其假設我們將由 以下實驗證實。

第三節實驗目的與設計流程 一、實驗目的：

本實驗目的主要探討(S)-HDAC-42 在三株人類多發性骨髓癌細胞 (U266, IM-9 and RPMI-8226)之藥理活性及對細胞凋亡路徑之影響及其分子機制。

二、實驗設計流程 (Figure 2)：

Figure 2. 實驗設計流程

U266 cells

Various concentrations of SAHA / (S)-HDAC-42

Incubate for different period

Harvest cells

Assay of cell cycle arrest RPMI-8226 cells

IM-9 cells (most sensitive)

IM-9 cells

Annexin V/PI Stain TUNEL assay Morphology changes

examination by

phase-light microscope

第三章材料與方法

第一節實驗材料 一、細胞株

本研究之實驗細胞株為人類多發性骨髓癌細胞株 (Human multiple myeloma cells；U266, IM-9, RPMI-8226)三株，購自新竹食品發展工業研究所(Food Industry Research and Development Institute)。

二、實驗藥物

(S)-HDAC-42［(S)-(+)-N-hydroxy-4-(3-methyl-2-phenylbutyrylamino)- benzamide］

三、藥品試劑

1. Dimethyl sulfoxide (DMSO) ：購自 Sigma 2. RPMI medium：購自 Gibco

3. Fetal bovine serum (胎牛血清；FBS) ：購自 Gibco 4. L-Glutamine(麩胺酸；LG) ：購自 Gibco

5. Penicillium Streptomycin (PS) ：購自 Gibco 6. Trypan blue：購自 Biological Industries 7. Trypsin-EDTA：購自 Gibco

8. Ethanol：購自 ECHO

9. Formaldehyde：購自 Merck 10. Methanol：購自 ECHO

11. Agarose Ⅰ：購自 UniRegion Bio-Tech

15. High performance chemiluminecence film：購自 GE Healthcare 16. Bovine serum albumin (BSA) ：購自 Sigma

17. Sodium dodecyl sulfate (SDS) ：購自 Sigma 18. Triton X-100：購自 Sigma

19. TEMED (N,N,N,N-Tetramethyl-ethylenediamine)：購自 Sigma 20. Tris：購自 J.T.Baker

21. Tween 20：購自 J.T.Baker

22. Sodium chloride(NaCl)：購自 Riedel-de Haen 23. ECL：購自 GE Healthcare

24. Glycine：購自 J.T.Baker

25. Disodium hydrogen phosphate (Na₂HPO₄)：購自 J.T.Baker 26. Potassium dihydeogen phosphate(KH₂PO₄)：購自 J.T.Baker 27. Potassium chloride (KCl)：購自 J.T.Baker

28. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad 29. Protein marker：購自 Fermentas

30. Propidium iodide (PI)：購自 Sigma 31. MTS reagent：購自 Promega

32. PES reagent：購自 Promega 33. 顯影劑：購自 Kodak

34. 定影劑：購自 Kodak

35. 粒線體萃取試劑 (Mitochondria extraction kit)：購自 PIERCE 36. Primary antibody (1°抗體)

A. anti-β-actin：購自 Sigma B. anti-Akt：購自 Cell Signaling C. anti-Bad：購自 Cell Signaling D. anti-Bcl-2：購自 Cell Signaling

E. anti-Bcl-xL：購自 Cell Signaling F. anti-caspase 3：購自 Cell Signaling G. anti-caspase 9：購自 Cell Signaling H. anti-COX Ⅳ：購自 Cell Signaling I. anti-cytochrome c：購自 Cell Signaling J. anti-Cyclin B1：購自 Cell Signaling K. anti-Cyclin D：購自 Cell Signaling L. anti-HDAC 1：購自 Cell Signaling M. anti-HDAC 2：購自 Upsatate N. anti-HDAC 3：購自 Upsatate O. anti-HDAC 4：購自 Cell Signaling P. anti-HDAC 5：購自 Cell Signaling Q. anti-HDAC 6：購自 Santa Cruz R. anti-HDAC 7：購自 Cell Signaling S. anti-HDAC 8：購自 Upsatate T. anti-NF-Κb：購自 Cell Signaling U. anti-p16：購自 Cell Signaling V. anti-p21：購自 abcam

W. anti-p38：購自 Cell Signaling X. anti-p53：購自 Cell Signaling Y. anti-p-Akt(308) ：購自 Santa Cruz Z. anti-p-Akt(473) ：購自 Santa Cruz AA. anti-p-Bad：購自 Cell Signaling

37. Secondary antibody (2°抗體)

6. 倒立式位像差顯微鏡(phase-contrast microscopy) ：購自 ZEISS 7. 微量天秤：購自 METTER TOLEDO

8. 去離子水製造機：購自 MILLIPORE 9. 電源供應器：購自 MILLIPORE 10. 酸檢測定儀：購自 EUTECH

11. PVDF membrane：購自 MILLIPORE 12. SDS-PAGE 電泳槽套組：購自 Bio-Rad

第二節實驗方法 一、實驗藥物配置

(S)-HDAC-42［(S)-(+)-N-hydroxy-4-(3-methyl-2-phenylbutyrylamino)- benzamide］為一Phenylbutyrate衍生物，分子量313 (22)。以DMSO為溶劑，將配置成1 mg/ml 作為stock，實驗時的最終濃度為0.1、0.25、0.5、

0.75、1 μg/ml。

H N

O

O H N

OH

Figure 3. The structure of (S)-HDAC-42

二、細胞培養 RPMI medium 培養基中，其中含有 10% fetal bovine serum (U266 則是15％)、100 units/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin 與 2 mM L-glutamine，置於 37℃、5% CO2 的培養箱中培養。定期更換新鮮的培養基，當其長到七八分滿時即繼代下來做實驗。

(四) 冷凍細胞

將人類多發性骨髓癌細胞株（U266, IM-9 and RPMI-8226）大量培養後可用液態氮冷凍保存細胞，欲保存冷凍的細胞盡量是採用細胞處於生長旺盛且存活率高的細胞情況來進行冷凍。先配製保存液，用 DMSO 加入新鮮培養基中，最後濃度為5-10﹪ (用7﹪)，混合均勻，

置於室溫下待用。取少量細胞液來計數細胞。之後細胞離心後去上清液，加入事前配製好的保存液，使細胞數保持在1-5×10⁶ cells/ml，混合均勻後分裝至冷凍保存管中 (1 ml/vial)，在管外標示名稱、數目、

日期。冷凍順序冷凍管置於4℃，10 分鐘→ -20℃，30 分鐘→ -80℃，

16-18 小時→放入液態氮桶中（-196℃）長期儲存。另外取少量細胞懸浮液作污染檢測。

三、細胞存活率試驗 (MTS Assay) 原理：

MTS reagent的組成包括：MTS，一種Novel tetrazolium compound

[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophe

nyl)-2H-tetrazolium, inner salt] ，以及 PES ，一種 Electron coupling

reagent (Phenazine methosulfate) 。 MTS 經過細胞 Dehydrogenase

enzymes代謝過後會轉變成formazan產物 (Figure 4)，該產物可以溶於

medium中，並可藉由490 nm測定其吸光值，因此若吸光值越高則表

示細胞數量越多(36)。

Figure 4. MTS 經代謝轉變為 Formazan

步驟：

將實驗細胞株人類多發性骨髓癌（U266, IM-9 and RPMI-8226），

分別以 5000 cells/well (50μl) 的密度種入 96 well 的培養盤，每株各三盤，以 DMSO 為溶劑，最後加入 50 μl 不同濃度(S)-HDAC-42 (0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、0.5 μg/ml、0.75 μg/ml、1 μg/ml)，以最高濃度 DMSO 為 control 組。等待培養時間(24、48 和 72 小時)，加入配置好的 MTS reagent 20 μl，37 ℃培養 3 小時後，利用酵素免疫分析儀 (ELISA reader) 以 490 nm 波長測其吸光值。每實驗增為三重覆已增加實驗準確度。

試劑：

1. PES reagent

2. MTS reagent 配置：

加入21 ml DPBS 在 50 ml tube，將 42 mg MTS reagent powder 加入 DPBS，搖晃至粉末完全溶解，以 pH meter 測定期 pH 值維持在 6.0~6.5，以 0.2 μm 的 filter 過濾，並分裝儲存於 1 ml 避光容器，置於-20 ℃保存。

Dehydrogenas

四、流式細胞儀分析 (Flow Cytometry) 細胞凋亡檢測 (Annexin V / PI staining)

原理：

細胞在早期程序性細胞死亡 (programmed cell death)時，也就是細胞凋亡(apoptosis)，磷脂絲氨酸 phospholipid phosphatidylserine (PS)從細胞膜內層轉移至外層，此時PS暴露在細胞外可與Annexin V結合。

Annexin V大小約35~36 kDa ，為一種具鈣離子依存性的磷脂質結合蛋白，且它與PS有高度的專一性。因此，藉著使Annexin V帶有螢光物質 (如FITC)可觀察到細胞PS外翻的程度，進而以流式細胞儀偵測螢光強度，再統計分析觀察細胞凋亡的程度。且配合它種螢光染劑

在文檔中一個新穎藥物Phenylbutyrate衍生物–(S)-HDAC-42於多發性骨髓瘤細胞之抗癌活性; Antitumor Effects of a Novel Phenylbutyrate Derivative–(S)-HDAC-42 in Multiple Myeloma cells (頁 15-0)

第二章 緒論

第一節 實驗藥物：(S)-HDAC-42