野生近緣種於育種之運用
為了確保在氣候暖化及變異遽增下之糧食安全，如何利用更多樣且豐富的作 物種類擴大遺傳資源背景是改良作物的關鍵之一 (Dempewolf et al. 2014)。野生 近緣種 (crop wild relatives) 為作物馴化前的野生種及親緣關係較近之物種，前人 研究發現其具有對非生物逆境的適應性、生物逆境的抗性甚至是高產的潛能，因 此 使 用 野 生 近 緣 種 作 為 雜 交 親 本 被 視 為 擴 大 栽 培 種 遺 傳 變 異 的 方 法 之 一 (Brozynska et al. 2016)，並可對於作物的生產力帶來顯著的成長 (Hajjar and Hodgkin 2007)。但種間雜交面臨雜交不親和、雜交後代不稔等困難，需透過胚拯 救、回交、染色體倍加等方式加以克服。
野生近緣種具有改善作物基因來源之潛力最早由 Vavilov 提出 (Vavilov 1926)，Maxted 和 Kelly 等人 (2009) 估計全球約有 50,000－60,000 個作物及其野 生近緣種，其中的 10,739 個物種被視為對改善糧食安全有直接之幫助 (Maxted and Kell 2009)。Tanksley and McCouch (1997) 認為分子標誌發展與基因型圖譜的 建立能夠有效增進野生種利用，且持續地對野生種源取樣能增加新基因發現之機 率。早於 19 世紀末期已有運用野生近緣種改良栽培種之紀錄：當法國面臨葡萄 根瘤蚜的危害時，是 藉 由引進 北 美對病害具有抗性的 Vitis rupestris 、Vitis berlandieri 和 Vitis riparia 三個野生近緣種重建葡萄酒產業 (Prescott-Allen and
Prescott-Allen 1987)。在野生近緣種運用於作物育種的例子中，超過 80%用來增 加栽培品種對病害及蟲害之抗性 (Hajjar and Hodgkin 2007)，如水稻抗草狀矮化 病毒 (rice grassy stunt virus, RGSV) 抗性基因之導入 (Brar and Khush 1997)；番 茄由野生種導入超過 40 個抗病基因 (Rick and Chetelat 1995)；小麥銹病與嵌紋病 毒 (wheat streak mosaic virus, WSMV) 之抗性導入 (Hoisington et al. 1999)；樹薯
嵌紋病 (mosaic virus) 與細菌性萎凋病 (bacterial wilt) 抗性之導入，使樹薯於奈 及利亞的產量上升 40% (Nweke 2004) 等實際應用之例。根據 CWR 網站 (http://www.cwrdiversity.org/) 統計，目前已有超過 25 種作物已經或正在進行野 生近緣種蒐集及應用於育種改良之研究計畫，高粱、馬鈴薯、燕麥、向日葵、鷹 嘴豆等作物均在此範疇中。
除了病蟲害抗性基因的導入外，野生近緣種對栽培種於非生物逆境的耐受性 提升也有所幫助。野生種棲地分布廣泛，在一些較極端的環境下仍可發現其蹤跡，
被認為具有較大的遺傳歧異度與環境耐受性 (Henry 2014)，因此，使用野生近緣 種能夠幫助栽培作物面對環境變遷之影響：如野生種大麥 Hordeum spontaneum 中發現提升根乾重與根長之數量性狀基因座 (quantitative trait loci, QTL) 增加栽 培種對乾旱的耐受性 (Naz et al. 2014)；運用野生小麥 Triticum dicoccoides 能提升 對乾旱及鹽害之耐受性 (Nevo and Chen 2010)；評估野生稻 Oryza officinalis、
Oryza rufipogon 耐旱相關性狀，進行如根長、地上部生物量、葉片水勢能之研究
(Feng et al. 2012)；對野生種大豆全基因體定序並定位耐鹽害之基因 (Qi et al.
2014)，其他如甘蔗、玉米、蔬果與油料作物等皆有相關研究 (Brozynska et al.
2016)。
野生稻於稻米育種之運用
稻米 (Oryza sativa L.) 為世界上最重要的糧食作物之一，亦為亞洲地區人民 主食，其發展與人類糧食問題息息相關 (Godfray et al. 2010)。隨著人口倍數成長，
糧食需求逐漸增加，為了因應氣候變遷造成的影響，現今的育種目標著重於高產 量、高營養價值、生物與非生物逆境的耐受性 (Tai et al. 2014)。長期以來稻米的 育種策略多以高產為主要育種目標，然而，單一化的稻種栽培往往帶來稻米之遺 傳背景窄化及遺傳脆弱性等問題，使得栽培稻無法適應氣候變遷所帶來的衝擊 (Dempewolf et al. 2014)。
現今稻屬下有 24 個種，包括 2 個栽培種－－亞洲栽培稻 (Oryza sativa) 及 非洲栽培稻 (Oryza glaberrima)－－和 22 個野生種。栽培種為 AA 染色體組，共 12 對染色體 (2n = 2x = 24)，野生稻可依不同的染色體組分為 AA、BB、CC、BBCC、
CCDD、EE、FF、GG、HHJJ、HHKK 等 10 種類型 (Sanchez et al. 2013)。野生 稻具高度遺傳多樣性，能適應各類自然環境，常帶有抗生物及非生物逆境之特性，
可用以擴增現有栽培稻之遺傳歧異度，作為導入有利對偶基因之育種材料，為一 珍貴遺傳資源 (Henry and Nevo 2014)。至今已有許多將野生稻基因導入栽培稻進 行育種之成功例子，如國際稻米研究所陸續從野生稻中篩選出抗稻熱病 (rice blast, BL) 及抗白葉枯病 (bacterial blight, BB) 等基因 (Brar and Khush 1997)。無 論是在生物逆境、非生物逆境之抗性、產量增加等皆有野生稻相關研究發表，如 AA 染色體組 O. rufipogon 已發現增進栽培稻產量及產量構成要素之 QTL (McCouch et al. 2007; Moncada et al. 2001; Septiningsih et al. 2003)；AA 染色體組 O. longistaminata 對白葉枯病之抗性 (Ikeda et al. 1990)；BB 染色體組 O. punctata
耐熱耐旱之特性 (Sanchez et al. 2013)；BBCC 染色體組 O. minuta 對褐飛蝨 (brown plant hopper, BPH) 之抗性 (Brar et al. 1996)；CCDD 染色體組 O. latifolia 的 BPH、BB 之抗性等 (Multani et al. 2003)。
O. nivara 與栽培稻同為 AA 染色體組，分類於第一級基因庫，為最早被應
用於將優良特性導入栽培稻之野生稻種之一，Ling 等人 (1970) 篩選 6,723 個栽 培品系及野生稻種對水稻草狀矮化病毒之感病程度，僅有屬於 O. nivara 的一個 品系具有較佳之抗性 (Ling et al. 1970)，並於 1974 年成功釋出第一批帶有抗水稻 草狀矮化病毒之品種 (Khush and Ling 1974)。此外，另有研究利用 O. nivara 與 栽培稻雜交建立導入系 (introgression line, IL)，藉以探討水稻種間雜交後代的遺 傳及育種行為；Win 等人 (2009) 將 O. nivara 與亞洲栽培稻台中 65 號，進行多 代回交，利用 SSR (single sequence repeat) 輔助建立野生稻導入系，成功定位位 於水稻第 12 條染色體短臂的 F1花粉不稔性基因 (Win et al. 2009)；Miura 等人
(2008) 利用亞洲栽培稻 Koshihikari 與 O. nivara 建立之導入系進行研究，於水稻 第 2 條染色體短臂發現可能導致水稻種間雜交後雜種衰退的 hbd1(t) 基因 (Miura et al. 2008)；Cheema 等人 (2008) 於栽培稻 O. sativa cv PR114 與 O. nivara 雜交 族群中定位出第四條染色體長臂上之抗白葉枯病基因 (Cheema et al. 2008)。
於遠緣野生種的利用上，不同染色體組間雜交後代稔實率低，且雜交種子會 有發育不完全或是退化之現象 (Bouharmont 1961)，但經由胚拯救培養通常可得 到雜交植株。Jena and Khush (1984) 經胚拯救成功得到水稻種間雜交植株，使野 生稻研究進一步產生可稔之後裔族群，以提供選拔利用。O. officinalis 為 CC 染 色體組，雖與栽培稻在染色體組間差異較大，但因在生物及非生物逆境中具有良 好特性，除了同為 AA 染色體組的野生稻外，常被應用於與栽培稻雜交，藉以導 入其優良特性；已知 O. officinalis 對於褐飛蝨、白葉枯病、稻熱病、紋枯病等有 抗性基因 (Huang et al. 2001; Jena and Khush 1990; Lakshmanan and Velusamy 1991; Tan et al. 2004)。Jena and Khush (1990) 成功建立 O. officinalis 導入系並發 現抗褐飛蝨基因，並於後續研究中分別在第 3、第 4 及第 12 條染色體上定位到 相關之抗性基因 (Hirabayashi et al. 1998; Huang et al. 2001)。在非生物逆境上，
Ishimaru 等人 (2010) 利用 O. officinalis 在清晨開花 (early-morning flowering, EMF) 特性，將此性狀導入亞洲栽培稻 Koshihikari，有助避開白天高溫 32 – 36 ℃ 造成之不稔現象 (Ishimaru et al. 2010)；Liu 等人 (2015) 則提出 O. officinalis 導 入系統在耐旱性狀之表現優於栽培稻 (Liu et al. 2015)。
高通量分子標誌的原理及應用
最 初 的 核 酸 定 序 法 (Sanger et al. 1977) 又 稱 為 鏈 終 止 定 序 法 (chain termination)，以聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 為基礎，利用 雙脫氧核糖核苷酸 (dideoxynucleotides, ddNTPs) 隨機中止反應，獲得不同長度 的 DNA 片段，隨後透過電泳結果判讀 DNA 序列。近年來隨著次世代定序 (next-generation sequencing, NGS) 的快速發展，能同時定序數百萬條 DNA 之高 通量分子技術漸趨成熟，在短時間內獲得大量定序資料，被廣泛應用於生命科學 各領域之研究，相關技術如 reduced representation libraries (RRL, Van Tassell et al.
2008)、restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq, Baird et al. 2008)、
double-digest restriction site-associated DNA sequencing (dd-RAD, Peterson et al.
2012)、genotyping-by-sequencing (GBS, Elshire et al. 2011) 都有各自的優點及特色。
其共通特點為利用限制酶進行全基因體多位點酶切及同時定序多個樣品，旨在開 發分子標誌時完成基因型分析，獲得不論是數量還是密度都較為充足之分子標誌。
在分子標誌的開發、基因滲入、遺傳演化等研究中皆有所幫助 (Egan et al. 2012)，
在育種上則增進分子輔助選種的能力且加速新品種之育成 (Edwards and Batley 2010)。
酶切系統通常利用甲基化敏感型限制酶，集中取樣基因可能表現之序列，限 制酶辨識切位數與獲得之序列個數成反比，定序深度與覆蓋度隨限制酶之選擇而 有所不同，考量待測之基因體序列及大小與研究之目的等因素後，選擇出最佳之 限制酶種類與平台。Baird 等人 (2008) 提出 RAD-seq，此方法將 DNA 樣品經酶 切後接上含有條碼 (Barcode) 的轉接子，每個 DNA 樣品連接一特定條碼，混和 多個樣品後隨機震碎，選取 300-700 bp 之序列接上 Y 型端轉接子 (Y adaptor)，
由於 PCR 擴增時無法擴增兩端皆為 Y 型轉接子之序列，可避免定序資源浪費。
後續分析利用條碼區分樣品來源，開發分子標誌同時完成基因型分析 (Baird et al.
2008)。Peterson 等人於 2012 年時針對此方法進行修改，以雙重限制酶降低基因 體複雜度，一為切位辨識鹼基較多之 rare cutter；另一為切位辨識鹼基較少之 common cutter，藉由不同的限制酶組合，基因體之複雜度與 RAD-seq 相比更加 縮減，取樣序列減少，定序深度提升進而減少缺值以獲得更可靠之判讀結果 (Peterson et al. 2012)。Elshire 等人 (2011) 提出的 GBS，則是在限制酶處理後不 經片段大小選擇，直接進行 PCR (Elshire et al. 2011)；Poland 等人 (2012) 針對 GBS 進行修改，透過不同的限制酶組合降低基因體複雜度 (Poland et al. 2012)。
次世代定序資料分析可依樣品參考序列有無，使用對應分析流程 (pipeline)，
如 TASSEL 3.0 GBS Pipeline (Bradbury et al. 2007)、TASSEL 5.0 GBSv2 Pipeline (Glaubitz et al. 2014) 與 Stacks (Catchen et al. 2013; Catchen et al. 2011) 等。主要 步驟可歸納為依照條碼分類樣品來源、比對回參考序列或定序資料自行比對、尋 找族群間之多型性與基因型分型等步驟。除了上述分析流程外，其他如 IGST (IBIS Genotyping-by-Sequencing Tool) (Sonah et al. 2013)、UNEAK (Universal Network Enabled Analysiss Kit) (Lu et al. 2013) 以及 Fast-GBS (Torkamaneh et al.
2017) 等多種流程，可依照使用者之需求選擇最適當的分析工具。
最早應用次世代分子技術於植物基因體研究為 Barbazuk 等人 (2007) 透過 Roche/454 平台定序玉米之 EST (expressed sequence tag) 並展現，尋找出約 7,000 個 SNPs，驗證前人研究中定序深度不足的序列上之基因，能夠更有效率地 利用於玉米等基因體龐大作物之研究 (Barbazuk et al. 2007)。其他次世代分子技 術之應用如透過定序 5.89 Gb 的 Koshihikari 序列發現 67,051 SNPs，利用基因型 與 haplotype blocks 幫助分析水稻各品種演化的起源與途徑 (Yamamoto et al.
2010)；透過 GBS 方法對 176 個水稻之雙親本重組自交系進行分析，建立與 SSR 相比更為完全之連鎖圖譜 (Spindel et al. 2013)；利用 RAD-seq 定序並尋找番茄晚 疫病之 QTL (Chen et al. 2014)；利用 RAD-seq 協助建立大麥高密度遺傳圖譜 (Zhou et al. 2015) 等許多相關研究紀錄。
研究目的
本研究利用兩組野生稻導入系統，以 RAD-seq 進行高通量基因型分型，定
本研究利用兩組野生稻導入系統，以 RAD-seq 進行高通量基因型分型，定