一般來說混合毒性理論均以非交互作用為主要假設，這是因為混合 毒性一旦牽涉到混合毒物的交互作用，產生化學反應，情況將更為複雜，
勢必難以單純的相關係數來加以描述與代表混合毒物所產生的交互作
用。在文獻回顧中曾提及，Lin[46]這位學者利用交互作用的角度成功地解 釋為何malononitrile 與長鏈醛存在時，造成毒性增強的情形。上節中丙醛 +2-CP、丙醛+2,3-DP 及丁醛+4-CP 這三組毒性減弱的物質，我們認為有可 能混合的有機物間產生化學反應，或者是二次產物的出現，而造成了與預 測結果不符的現象。由文獻回顧中，我們曉得在化學分析時，大多數的學 者選用HPLC 及 ESI-MS 作用分析的儀器，在本研究中則選用 HPLC 作為 偵測儀器。
選用HPLC 主要是利用其定性的原理：同一種化合物，在相同的設定 條件下，波峰(peak)出現的停留時間應為一致。在本節中選取的實驗方法 為分別分析單一毒物及混合毒物的結果，觀察與預測不符的混合物質其 HPLC 結果是否出現第三個產物的 peak。圖 5.3.1-5.3.13 為偵測器 RI 之 HPLC 結果圖，由結果圖可發現 RI 有個特殊的特性，會將溶劑的 peak 同 時也顯現出來，故為了降低solvent peak 所造成的影響，一般來說針對 RI 而言，溶樣品的solvent 我們選擇使用移動相(乙腈+水= 40%:60%)。首先，
必須先了解solvent 的出現時間，並在分析樣品時將 solvent peak 當成背景 脈衝。由圖5.3.1 及 5.3.2 的結果可知 solvent 出現的時間約在 2 分鐘及 4 分鐘左右，故當sample 的結果出現在此時即可將之視為背景 peak 而忽略 之。在HPLC 的分析中，理論上醛類與氯酚的分析濃度應比照實驗濃度 (TU=1:1)，不過在 RI 的偵測濃度限制下，只能夠以清楚地看到波峰的最低 濃度為準，故在HPLC 的化學分析當中，將醛類的分析濃度皆定為 1000 mg/L，至於氯酚則為 200 mg/L。單一化合物的結果如圖 5.3.3-5.3.8 所示，
至於混合毒物的HPLC 則為接下來的圖 5.3.9-5.3.12。
一開始，我們以為與模式不符的三組混合毒物，應當是產生了交互作
理而言會在HPLC 結果上顯現第三個 peak，然而由圖 5.3.11-5.3.13 中並未 出現預期中的第三支Peak。儘管未發現新物質的波峰，但並不表示此三組 混合毒物無化學反應的發生，有可能因為本分析條件(如移動相、column、
流速等等)只適用於醛類及氯酚，但其實並不適合新物質，故管柱無法將新 物質分離並顯示於結果圖中；亦或者生成的新物質停留時間與原本毒物太 近，以至於波峰被原本有機物覆蓋而無法顯現於HPLC 的混合結果圖。因 此，接下來則以混合後面積的削減情形來探討丙醛+2-CP、丙醛+2,3-DP 及 丁醛+4-CP 這三組物質之間是否發生了交互作用。
表5.3.1 為毒物單獨存在及兩兩混合時其 peak 面積的減少百分比。表 中虛線上方的混合組別為2-CP +戊醛，此組實驗結果為協同反應，與 RA model 預估的結果一致；至於虛線下方則為產生毒性減弱的組別，也正是 違背模式預測的混合毒物。由表中可發現，符合模式預測的混合毒物，混 合後的面積減少量約只有1 %；與模式不符之組別面積削減量則為 10 % 左 右，明顯地與符合預測的組別相差甚遠，依質量不滅定律，2,3-DP+丙醛、
2-CP +丙醛、4-CP +丁醛這三組物質混合後面積減少的部份也許生成了新 的物質，只是在本實驗中所使用的條件下並未偵測到第三個物質的波峰，
無法直接證實此三組與模式不符的物質產生化學變化，只能夠間接地利用 面積削減量推斷毒物間可能牽涉到較複雜的交互作用。
雖然並未直接偵測到新物質的存在，不過我們仍然認為2,3-DP+丙 醛、2-CP +丙醛、4-CP +丁醛這三組物質彼此間發生了化學反應。倘若以 有機化學的角度加以解釋，則可發現醛類與氯酚產生化學反應的機率極 大。醛類為具羰基( C=O )的有機化合物，羰基在化學結構有一重要特性，
因為氧的陰電性比碳原子大，羰基雙鍵的σ及π鍵電子均較靠近氧原子，
而鄰近的碳原子電子密度稍減，亦即，C=O 鍵是極化的。此狀況可用下式
表示：
羰基碳上的正電荷特別容易接受一親核劑的攻擊。接著探討氯酚的結構，
氯酚帶有具共振結構的苯環，環上接有OH 官能基及氯原子，苯環穩定不 易發生反應，因此若氯酚與醛發生反應，較有可能是氯原子解離後去攻擊 醛，因為氯原子為一親核劑且其陰電性強，極易拉電子。故氯原子有可能 與醛進行加成反應，生成一四面體的產物。
由TU=1:1 的混合結果中，可發現丙醛與氯酚的混合結大多為相加或 拮抗作用，明顯與模式預期不合。若以有機化角度來說，對於同一類的化 合物，不論是分子間的鍵能或者焓值皆隨著分子量越大而增加。我們曉 得，分子間的鍵能代表著形成分子時所需的能量，形成的能量越強，反之，
要將其破壞所需的能量也越大，故鍵能越大代表物質結構越穩定。對於本 研究的化合物而言，若以鍵能的角度則其穩定性如下所示：甲醛<丙醛<丁 醛<戊二醛，由此可知，甲醛與丙醛最不穩定。不過甲醛具備一特殊性質，
當其溶解於水中，會與水加成形成二烴化合物(formaldehyde hydrate)。在 中性的水中，甲醛幾乎作100%的水合，且此水合物為一穩定的物質，不 易其他化合物反應。故由此得知，研究中的丙醛為一最不穩定的物質，與 其他物質發生反應的機率較高。以下為甲醛的水合反應：
除此之外，由文獻中[52] 發現氯酚的官能基(Cl-)確實會與丙醛發生反 應，其可能的化學反應式如下：
Cl + CH3CH2CHO → HCl + CH3CH2C(O) Cl + CH3CH2CHO → HCl + CH3CHCHO Cl + CH3CH2CHO → HCl + CH2CH2CHO
此三個化學反應式皆在室溫(25℃)下即會進行，在 Microtox 的 15 分 鐘試驗中，溫度僅有15℃，照理來說，在這麼低的溫度下發生化學反應的 機率不高。不過由文獻中我們已知氯原子確實會與丙醛發生反應，極有可 能螢光菌(Vibrio fisheri)中的某些酵素加速了上述反應的發生，以至於混合 後的結果與預測不符，不過這一部分仍需未來作更進一步的研究與探討。
在文獻回顧中曾提及，Lin 在 2003 年利用 HPLC 成功地偵測到當 malononitrile 與醛類混合時，有新物質 peak 的生成，然而觀察到新物質的 前提為兩毒物須作前處理。Lin 選用了 Shinkai 的方法當作前處理：將 malononitrile、aldehyde 及 CTMAB(膠體粒子,用以促進兩物質的碰撞機會) 混合於30℃的水浴下，並搖晃 24 h。作者同時發現，當兩化合物未作前處 理時，HPLC 無法偵測到新物質的蹤影。
由此文獻推及到本研究結果，在HPLC 分析時，我們並未有複雜的前 處理動作，只是單純的將兩化合物混合搖晃約10 分鐘，因此若生成物的 濃度十分稀少時，在此實驗條件下觀察不到新物質可說是十分合乎常理 的。儘管由文獻中了解氯原子確實會與丙醛發生反應，但在本實驗中缺少 ㄧ適當的前處理，以至於無法在HPLC 上觀察到新物質的 peak，這一部份
有待未來更進一步地研究探討。總而言之，儘管本研究無法成功地使用 HPLC 偵測到第三個物質的生成，然而由 2,3-DP+丙醛、2-CP +丙醛、4-CP +丁醛混合後面積大為減少的情形以及化學分析的文獻，我們推論面積減 少的部份也許是生成了毒性較弱的化合物，以致於實驗結果為毒性減弱而 非模式預測的毒性增強。
圖5.3.1 乙腈的 HPLC 結果圖
圖5.3.2 (乙腈+水)的 HPLC 結果圖
圖5.3.3 (乙腈+水)的 HPLC 結果圖
圖5.3.4 2-CP (DT=7.507)的 HPLC 結果圖
圖5.3.5 戊醛(DT=2.507)的 HPLC 結果圖
5.3.6 戊醛(DT=2.47)混 2-CP (DT=7.394)的 HPLC 結果圖
圖5.3.7 丙醛(DT=2.73)的 HPLC 結果圖
圖5.3.8 2,3-DP(DT=14.56)的 HPLC 結果圖
圖5.3.9 丙醛(DT=2.73)混 2,3-DP(DT=13.97)的 HPLC 混合結果圖
圖5.3.10 丙醛(DT=2.907)的 HPLC 單一結果圖
圖5.3.11 2-CP (DT=7.507)的 HPLC 結果圖
圖5.3.12 丙醛(DT=2.865)混 2-CP(DT=7.435)的 HPLC 混合結果圖
圖5.3.13 丁醛(DT=3.78)的 HPLC 結果圖
圖5.3.14 4-CP(DT=10.46)的 HPLC 結果圖
圖5.3.15 丁醛(DT=4.21)混 4-CP(DT=10.58)的 HPLC 結果圖
表5.3.1 HPLC 結果整理
Chemical D T (min) 面積 減少百分比 (%) 2-CP 7.507 8892681
戊醛 2.507 1088033
2-CP+戊醛 7.394 , 2.47 8814813 , 1077440 0.9 % , 1.0 % 2,3-DP 14.31 6089921
丙醛 2.729 1784090
2,3-DP+丙醛 13.97 , 2.733 5404162 , 1550222 11.2 % , 13.1 % 2-CP 7.507 8892681
丙醛 2.907 2008432
2-CP + 丙醛 7.435 , 2.865 8223176 , 1777984 7.5 % , 11.5 % 4-CP 10.464 5214389
丁醛 3.78 4201191
4-CP + 丁醛 10.58 , 4.21 4857561 , 3671397 6.8 % , 12.6 % 註：分析時醛類濃度皆為 1000 mg/L，氯酚濃度則為 200 mg/L。
第六章 結論與建議
6.1 結論
本實驗為針對工業常用之反應性醛類有機物與極性麻醉有機物進行 單一及混合毒性試驗，以下為描述本研究結論，並提出未來可進一步探討 的研究方向與建議。
1. 由四個醛類及八個氯酚對 Microtox 的單一毒性試驗，結果發現氯的毒 性大致上隨著鍵結的氯數增加而增強，以五氯酚的毒性最強EC50
=0.38 mg/L；醛類的毒性則無一定的趨勢，以丙醛的毒性最弱，EC50
值為225 mg/L。
2. 以反應性醛+麻醉性氯酚配對形式進行混合毒性實驗，發現小斜率的物 質產生毒性增強的機率極高，斜率較大的物質混合則以相加及拮抗作 用為主(丙醛+2,4,6-TP、丙醛+PCP)。這與 RA 模式預估結果ㄧ致，值 得注意的是與戊醛混合的組別，毒性增強的情形更為顯著，因此在規 範水體水質標準時須特別注意戊醛與氯酚兩類毒性物質共存時之標準 訂定。
3. 由不同模式的預測準確力比較中，可發現對於本研究的混合結果而 言，IA 模式(RA 及 RM)所預測出的結果比 CA 模式更為準確，其準確 率比較為：RA > RM > CA。
4. 由許多毒物學文獻中發現，大部分的學者認為 CA model 比起 IA model 來的保守，這是在未考慮ρ值而下的定論。因此本研究中將ρ= -1 納 入模式預測的考慮因素中，發現當ρ= -1、λ= 0 (RA , 即為 IA 模式 中的一種情形)為 IA 最為嚴重的特殊情形。並利用實驗的 isobologram 做探討，若化合物皆為小斜率，此時以IA 模式所預測的結果較為嚴
重；相反地，當物質具大斜率的劑量-反應曲線時應選擇 CA model 較 為保守。
5. 與模式不符的三組混合物：2,3-DP+丙醛、2-CP +丙醛、4-CP +丁醛，
利用HPLC 儀器分析，發現混合後面積大為減少，削減的比例約為 10-25%，推斷面積減少的部份也許是生成了較不毒的化合物，以致於
利用HPLC 儀器分析，發現混合後面積大為減少，削減的比例約為 10-25%，推斷面積減少的部份也許是生成了較不毒的化合物，以致於