反應性醛與極性麻醉氯酚之混合毒性試驗

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

反應性醛與極性麻醉氯酚之混合毒性試驗

Combined toxic effects of reactive and

polar narcotic toxicants

研 究 生: 陳 欣 妤 指 導 教 授: 陳 重 元 教授

反應性醛與極性麻醉氯酚之混合毒性試驗

學生：陳欣妤 指導教授：陳重元 摘要 本研究以反應性醛與極性麻醉物氯酚針對Microtox 進行混合毒性試 驗，並引用Christensen ＆ Chen 混合毒性理論預測其混合毒性變化。 Microtox 混合毒性實驗結果大致符合非交互作用混合理論。實驗結果發現 不同機制的物質混合，小斜率的物質產生毒性增強的機率極高，斜率較大 的物質混合則以相加及拮抗作用為主。 實驗中發現三組混合毒性不符合交互作用理論：2,3-DP+丙醛、2-CP +

丙醛、4-CP +丁醛，且丙醛的 isobologram 中更出現了 complex joint action

的現象，推測兩化合物間產生了化學反應，故利用HPLC 作進一步分析， 發現混合後面積大為減少。 許多混合毒性文獻皆指出CA 模式的預測力較 IA 佳，不過這是基於 當ρ= 0 的情形下成立，本研究特別考慮了當ρ= -1 時的 IA 模式。實驗發 現當化合物具小斜率的劑量-反應關係曲線時，以 IA 模式所預測的結果較 為嚴重；反之，若混合毒物的斜率較大時則應選擇CA 模式較為保守。

Combined Toxicity of Reactive and Polar Narcosis Toxicants to Microtox

Student: Xin Yu Chen Advisor: C. Y. Chen Abstract

The joint action of reactive aldehydes and polar narcosis chlorophenols was analyzed using the Microtox test. The experimental results were compared with the predictive model. The results of this research agree with the

non-interactive combined toxicity theory. The majority of synergistic joint actions observed were related to reactive toxicants having different

mechanisms of toxicity and flat concentration-response curves. There was three interactive multiple toxicity cases：2-CP +

propionaldehyde, 2,3-DP+ propionaldehyde, and the 4-CP+butyraldehyde. The complex joint action could be found between the propionaldehyde and the chlorophenol, indicated that interactive action happened. To study the chemical interactions, here uses the HPLC for analyze.

Many toxicologists thought that concentration addition (CA) had a higher predictive power than independent action (IA). But they just ignored the

condition of ρ= -1. In this study, we find that if the slope parameter is lower than 2, the IA model predicts a higher effect than CA. On the contrary, if the chemical has the sharp concentration-response curve, CA is more conservative than IA.

誌

謝

感謝恩師陳重元教授這兩年來悉心的指導與教誨，多虧有老師的指 引，我才能夠順利的完成研究論文，並且感謝計畫書審核與口試期間，林 志高教授、趙木榮教授及董瑞安教授委員們提供了許多實用的建議與指 教，使得本論文能夠更加完整並嚴謹。除此之外，更加感謝趙木榮教授提 供LC-MS 借我們使用，並為我們解答許多有關 HPLC 方面的疑惑。 在這兩年研究所生活當中，感謝學姊詔棻以及學長哲偉、冠良、俊竹 在學習過程中所給予的幫助，還有百珊、介華與學弟妹庭宇、心渝、聖然， 不論在生活上或是實驗上都給予我極大的幫忙，使得我能夠順利地完成我 的論文，感謝大家。除此之外，更要感謝庭宇及賴明俊幫我潤飾英文paper。 最後，更要感謝一值支持與關心我的家人們，不論我做什麼決定他們 總是無條件的支持著我；另外還有元智、肥呆、小雞、姿吟、yoan、千王、 馬路等好友，陪我逛街、陪著我打球、陪著我大吃大喝，豐富我的研究所 生活。

目

錄

第一章 前言

1.1 研究動機... 1 1.2 研究內容... 2

第二章 文獻回顧

2.1 常用的物種試驗……… 3 2.2 Microtox 毒性試驗概論……… 4 2.3 螢光反應過程……… 5 2.4 單一毒性 2.4.1 有機物毒性作用機制……… 6 2.5 混合研究之重要性 2.5.1 非交互作用(Non-interactive) 及交互作用(Interactive)…… 11 2.5.2 混合毒性研究之重要性……… 13 2.6 毒性物質—氯酚介紹 2.4.1 氯酚化合物的特性及來源……… 16 2.4.2 氯酚化合物的毒性與危害……… 17 2.5 毒性物質—醛類介紹……… 18

第三章 基本理論

3.1 QSARs 3.1.1 非反應性有機物毒性機制... ... 20 3.1.2 反應性有機物毒性機制……… 21

3.2 毒性物質劑量—反應模式 3.2.1 常用的單一毒性模式……… 21 3.3 混合毒性理論 3.3.1 Isobologram ……… 24 3.3.2 混合毒性指標……… 25 3.3.3 非交互作用混合毒性模式………26 3.3.4 交互作用混合毒性模式……… 27 3.3.5 混合毒性效應參數 ρ 和 λ 值……… 27

第四章 實驗設備與方法

4.1 實驗設備 4.1.1 基本原理……… 30 4.1.2 儀器構造……… 31 4.1.3 基本配備……… 33 4.1.4 標準分析程序……… 33 4.1.5 Microtox 毒性試驗環境因子……… 34 4.2 試驗毒物……… 35 4.2.1 有機藥品配製……… 36 4.3 實驗數據之處理... ... 37 4.4 儀器操作原理、步驟與設定條件 4.4.1 總有機碳分析儀(TOC) ………37 4.4.2 高效能液相層析儀……… 38 4.5 混合方式……… 40

第五章 結果與討論

5.1 Microtox 單一毒性實驗……… 41 5.2 混合毒性試驗結果分析 5.2.1 混合毒性單位分析……… 50 5.2.2 混合模式推估(CA、IA) ………54 5.2.3 混合毒性效應參數……… 63 5.3 化學分析……… 64

第六章 結論與建議

6.1 結論………76 6.2 建議………77

參考文獻

……… 78

附錄一

………84

附錄二

……… 93

附錄三

……… 101

表目錄

表2.6.1 氯酚化合物之物化特性………..16 表2.6.2 氯酚化合物之合成及用途……… 17 表3.3.1 基本四種混合效應定義………..29 表4.2.1 有機化學物質其基本特性……….. 35 表4.4.1 HPLC 相關規格與設定……….. 38 表4. 5.1 混合毒性濃度配製………..…. . 40 表5.1.1 :試驗毒物之 Microtox 毒性試驗數據………..…. .43 表5.2.1：反應性醛與極性麻醉物氯酚之混合毒性(TU=1:1) ………..…. 51 表5.2.2：混合結果總計………..…. . .….52 表5.2.3 基本四種混合效應定義………..…. . .…60 表5.2.4 不同模式的預測力比較………..…. . .…61 表5.2.5 不同模式的預測力整理………..…. . .…62 表5.2.6 反應性醛混麻醉性氯酚之毒性效應參數探討…………..…. . .…63 表5.3.1 HPLC 結果整理………..…. . .… 75

圖目錄

圖2.4.1 有機毒物的分類………..…. . .….7 圖 2.4.2 非特定型反應的化學品………..…. . .…. 9 圖 2.4.3 特定型反應的化學品………..…. . . 10 圖3.2.1 不同斜率的劑量反應關係………..…. . .….22 圖3.3.1 isobologram 示意圖………..…. . .…25 圖3.3.2 兩毒性物質相關度之關係圖………..…. . . 28 圖4.1.1 微毒測試儀………..…. . .…. . . . 32 圖4.1.2 Microtox 螢光快速分析儀的 32 個槽其相關位置圖…. . .…. . . . 32 圖4.4.2 本實驗中 HPLC 操作步驟及其設定………..…. . .…. . . .39 圖5.1.1 Formaldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線…………..…. . .…. . . .44 圖5.1.2 Propionaldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. . . .44 圖5.1.3 Butyraldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線…………..…. . .…. . . .45 圖5.1.4 Glutardialdehyde 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. . . 45 圖5.1.5 2-Chlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. . . 46 圖5.1.6 3-Chlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. . . 46 圖5.1.7 4-Chlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. . . 47 圖5.1.8 2,3-Dichlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .….47 圖5.1.9 2,4-Dichlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. .48 圖5.1.10 3,4-Dichlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. 48 圖5.1.11 2,4,6-Dichlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . . 49 圖5.1.12 Pentachlorophenol 之 Microtox 劑量反應曲線………..…. . .…. .49

圖5.2.1 甲醛與 2,3-DP 之 isobologram………..…. . 55 圖5.2.2 甲醛與 2,4-DP 之 isobologram………..…. . 55 圖5.2.3 丙醛與 2-CP 之 isobologram………..…. . 56 圖5.2.4 丙醛與 2,3-DP 之 isobologram………..…. . 57 圖5.2.5 丁醛與 2,3-DP 之 isobologram………..…. . 58 圖5.2.6 丁醛與 2,4-DP 之 isobologram………..…. . 58 圖5.2.7 戊醛與 2-CP 之 isobologram………..…. . 59 圖5.2.8 戊醛與 2,4-DP 之 isobologram………..…. . 59 圖5.3.1 乙腈的 HPLC 結果圖………..…. . . 70 圖5.3.2 (乙腈+水)的 HPLC 結果圖………..…. . . 70 圖5.3.3 (乙腈+水)的 HPLC 結果圖………..…. . . 70 圖5.3.4 2-CP (DT=7.507)的 HPLC 結果圖………..…. . . 71 圖5.3.5 戊醛(DT=2.507)的 HPLC 結果圖………..…. . . 71 圖5.3.6 戊醛(DT=2.47)混 2-CP (DT=7.394)的 HPLC 結果圖…………..…. . . 71 圖5.3.7 丙醛(DT=2.73)的 HPLC 結果圖………..…. . . 72 圖5.3.8 2,3-DP(DT=14.56)的 HPLC 結果圖………..…. . . 72 圖5.3.9 丙醛(DT=2.73)混 2,3-DP(DT=13.97)的 HPLC 混合結果圖……..…. . . 72 圖5.3.10 丙醛(DT=2.907)的 HPLC 單一結果圖………..…. . . 73 圖5.3.11 2-CP (DT=7.507)的 HPLC 結果圖………..…. . . 73 圖5.3.12 丙醛(DT=2.865)混 2-CP(DT=7.435)的 HPLC 混合結果圖……..…. . . 73 圖5.3.13 丁醛(DT=3.78)的 HPLC 結果圖………..…. . . 74 圖5.3.14 4-CP(DT=10.46)的 HPLC 結果圖………..…. . . 74 圖5.3.15 丁醛(DT=4.21)混 4-CP(DT=10.58)的 HPLC 結果圖…………..…. . . 74

第一章 緒論

1.1 研究動機 近年來台灣的水污染問題日益嚴重，在一般家庭污水、事業廢水、地 表水和地下水等一般水體大多含有毒性有機物質，而所含的物質種類並非 僅有一種，而是多種毒性物質的綜合體，也因此當生物暴露於其中，所遭 受到的是毒性物質危害也是綜合性的。然毒物在單一毒性上和在混合毒性 上的表現是不相同，如Wong et al. 針對乾淨水體中的藻類進行金屬混合毒 性實驗中，結果顯示當十種毒物個別存在時對藻類並不會有毒性，但是當 十種毒物以相同的濃度混合時，卻會對藻類有毒性。由上述例子可知毒性 物質在單一狀態和混合狀態所呈現的毒性效應是不同，毒性物質混合後其 毒性為何和現行只考慮單一物質的毒性的國內污染管制標準及環境品質 標準是否足夠，這兩者問題皆需由進一步的研究與確認。 毒性效應分析必須花費大量的時間與財力才可得知，這也使得毒性評 估的目標變的遙不可及，為了減少大量資源投入毒性試驗中，因此有了預 測混合毒性變化方面的研究產生，環境毒物學大多選用 Concentration

addition(CA)及 Independent action(IA)兩種模式作用預測混合毒性的工具。 本研究中也將利用此模式作為混合毒物的預估模式，並將文獻未考慮的部 份作進一步的修正。目前許多有關混合毒性的研究，皆著重在相同機制內 的混合，較少探討到不同機制的混合效應。因此本研究即選定不同機制的 有機物進行實驗，一類為具高反應性的醛類(reactive, aldehyde);另一類則為 環境中常見的污染物質—極性麻醉性氯酚(polar narcosis, chlorophenol)。

1.2 研究內容

本論文利用Microtox 來進行單一及混合毒性試驗之研究，主要內容為

以下所示:

(1) 現有多種有機物的混合毒性試驗，大多探討同種毒性機制內的混合效 應，至於不同毒性機制間的混合研究則較為少見，因此本研究選用兩 類不同機制的毒物(reactive V.S.polar narcosis)作其混合試驗 ，以探討 混合後毒性的變化情形。 (2) Christensen ＆Chen 於 1989 年所發展的預測模式，可藉由單一毒性物 質的probit 分析結果來預測兩種毒性物質混合後的毒性變化情形。因 此本研究將利用模式預測的結果與實際混合實驗的結果相比較。 (3) 若試驗結果與模式不符，則進一步藉由 HPLC 分析兩兩毒物間是否發 生化學反應或者形成中間產物。

第二章

文獻回顧

2.1 常用的物種試驗

現今各標準行生物毒性試驗方法中，所用的試驗物種眾多，以 U.S. EPA 所訂定的標準方法為例，其列舉的試驗物種就包含有植物性浮游生 物、動物性浮游生物、珊瑚、甲殼類、無脊椎動物、水體昆蟲及軟體動物 等。本研究選用Microtox 作為測試物種，以下針對各物種進行簡單地描述：

1. Microtox： 測試原理為利用螢光菌（Photobacterium phosphoreum）的 發光性遭受毒性物質的抑制來求得毒性。就目前檢驗環境樣品的十幾 種細菌性毒性分析法(bacteria toxicity assays)之中，以 Microtox 最被廣 泛使用且其已被商業化。

2. Fathead minnow[1]：本方法主要係以鰷魚為測試生物，以流動式（flow- through）生物毒性試驗方法，檢測水樣之急毒性，並以 96 小時半數 致死濃度(LC50)表示之。

3. Polytox[2]： 為 U.S.EPA 所公告的標準方法，利用十二股好氧菌(Polybac Corporation, Bethlehem Pa)搭配呼吸儀(Comput-OX Respirometer)和反 應槽 (詳細裝置可參見 Cadena et al. [3]) 來進行試驗，屬便宜的試驗 法，且常被用於測試排放水的毒性。

4. Activiated sludge[4]、Nitrosomonas、Tetrahymena pyrigorms[5] 和 Virbrio

fischer [6]：以上實驗皆屬於批次式試驗，其中亞硝化菌和梨型四膜蟲

是由活性污泥分離出來，這些方法發展的目地是為了監測活性污泥池 的入流污水的毒性。

5. Shk1[7]：由美國田納西州環境生物技術中心發展而來，於活性污泥篩

6. Spirotox[8]：利用2~3 mm 長的大型旋口蟲(Spirotomum ambiguum)來進 行急毒性實驗，藉由觀察該原生動物在毒物中的畸形(deformations)和 致死(lethanl)反應來判定毒性大小。 7. Daphnia magna：為靜水式生物毒性試驗方法，以水蚤為試驗物種，監 測水樣之急毒性，並計算48 小時之半致死濃度(LC50)。本方法適用範 圍為事業、都市放流水及其他廢污水之急毒性試驗。Kaiser et al.[9]實 驗結果認為 Daphnia 為敏感性很高的物種。

2.2 Microtox 毒性試驗概論

以上所提的水體生物均為毒性試驗的生物種類，不過在實驗的時效 性、代表性、敏感性及便利與否等方面的考量下，每種測試物種各具優缺 點。以魚類實驗為例，其具有相當高的代表性與敏感性，且是水體中最值 得保護的生物，然而魚類的實驗時間一般定在96 小時，在實驗操作上需 要大量的人力成本;至於藻類試驗，在實驗操作上比起魚類是較為簡便且不 需龐大的人力，但在時間方面，仍需兩天的試驗時間。至於其他水體的生 物一樣具有優缺點，故在選擇一適當試驗物種時仍須顧及各面。 在很多的環境汙染事件當中，時效性及經濟成本上的考量是最主要的 因素，而細菌類的毒性測試多具快速便利，培養容易，分布普及成本較低 的優點，但細菌類對毒性物質的容忍度較高，故其毒性試驗普遍有敏感度 低的缺點，70 年代開始，貝克曼公司(Beckman,Inc.)以螢光菌的發光抑制 作為毒性的測試方法，發現螢光菌是一種具高敏感物之物種，故之後常被 用做生物毒性管制的篩選試驗(screening test) ，並將此試驗稱為 「Microtox」。 Microtox 因具有細菌試驗的優點，故到 80 年代已被作為毒性的篩選 試驗方式之ㄧ，90 年帶更擴大了其運用於各種廢水及污染物質的毒性依

據。螢光菌的毒性測試能廣泛的被採用的原因之ㄧ，乃在於具有較佳的敏 感度。除此之外，就單一毒性物質而言，螢光菌與魚類的毒性數據具有高 度的相關性。螢光菌的運用上由許多的文獻可瞭解到其在環境的毒性試驗 上具有重要性，比起其他的毒性試驗具操作迅速簡單方便，高敏感度及高 再現性的優點，Microtox 被廣泛的應用在廢水毒性監測及學術研究上。除 上述特性，充足的學術研究文獻及研究成果實用的潛力，亦為本研究採用 Microtox 毒性試驗方法的重要考慮。

2.3 螢光反應過程

螢光的發光反應途徑一直是許多生物學家感到興趣的部份，藉由此可 了解其他生物發光的相似處，McElroy and Green [10]從他們的研究得到結 論，發光反應進行時，有一長鏈醛與FMNH2參與;Cormier et al.[11]則指出

此發光反應有一酵素的參與; McElroy[12]更進一步分別指出發光反應的進

行組成是被還原的FMN、一長鏈醛、氧分子以及細菌發光酶。其反應式如

下:

NAD(P)H + FMN + H+ → NAD(P)+ + FMNH2

FMNH2 + RCHO + O2 + luciferarse → FMN + H2O + RCOOH + light

上式中的FMNH2 為還原態的 flavin mononucleotide，RCHO 則為醛

類物質，故許多研究藉由長鏈醛類的加入以增加螢光的反應，FMN 為氧 化態的flavin mononucleotide，RCOOH 為低分子有機酸，luciferase 即為螢 光反應所需的酵素。由其他文獻得知，Luciferase 具備一特殊的合成調節 方法，稱為自動誘導機制(autoinduction) [13]，螢光菌會產生一個特殊物質 -autoinducer，在生長時累積在培養液中，當 autoinducer 的量達到一個 critical level，則 luciferase 的誘導即開始。有關於 Vibrio fischeri 的 autoinducer 則 被鑑定為 N-β-Ketocaproylhomeserine lactone。

2.4 單一毒性

由混合毒性文獻中，大多探討麻醉毒性物質間的毒性變化，故本研究 選許較少討論的反應性毒物與麻醉性毒物之混合毒性。在此針對有機物間 的作用機制分類作一介紹。 2.4.1 有機物毒性作用機制 在水體毒理學中針對現在的有機物性質分類出多種機制， 而大多數 的分類法是將化學物質分成可逆非特定型(reversible non-specific or general) 和不可逆特定型(irreversible specific) [29] [30]兩類型。可逆非特定型之化學物 質所造成的毒性又可分為非極性麻醉型(nonpolar narcotic)和極性麻醉型 (polar narcotic)，這類物質會以非特定的型式造成細胞膜出現孔洞，導致毒 性物質可以進入細胞膜內產生毒性反應，圖 2.4.2 為其作用示意圖，而特 定型毒性是由反應性物質(reactive compound)所造成，追究其致毒性的原因 為細胞的受體位置(receptor site)遭受毒物攻擊，該位置的官能因為化學物 質的作用而崩潰，圖2.4.3 為其作用示意圖。圖 2.4.1 是最常見的有機物分 類方式，由辛醇-水係數來進行歸類：

非極性麻醉型 (nonpolar narcotic) 非 反 應 性 有 機 物 (Non-reactive) 極性麻醉型 （polar narcotic) 親電型 （electrophilic nonelectrolytes) 前親電型（proelectrophilic nonelectrolytes) 反 應 性 有 機 物 (Reactive) 具氰基型（cyanogenic nonelectrolytes) 多機制型（multiple mechanisms) 圖2.4.1 有機毒物的分類 1. 非反應有機物(Nonreactive)毒性機制 一般又可稱為麻醉效應毒性（Narcosis Effect），本機制符合辛醇-水係 數模式，即與親脂性有關，而親脂性屬於物理作用，其描述生物暴露於某 一程度的劑量內，當毒性物質移去，生物原有抑制反應因此消失，毒性呈 現可逆反應，該現象也可稱為可逆性生理效應 (reversible physiological effect)，在 Veith et al. [31] 的 fathead minnow(鰷魚)針對屬非極性麻醉型工業 化學物質的急毒性試驗中，就觀察到這類可逆型的效應，該效應產生通常 與非共價鍵交互作用（non-covalent interactions）有關，即細胞膜內的脂質、 蛋白質或兩者間的凡得瓦爾力的交互作用（van der Waals interactions）瓦 解有關[32]。

現今工業中所使用的有機化學 物質大多是屬於麻醉型式(narcotic

z 非極性麻醉型 (Nonpolar narcotic or Narcosis I) Schultz et al.[36] 實驗結果發現，屬於這類型的化學物質所觀測到 的毒性會與 QSAR 模式之辛醇-水係數所預測到的毒性有良好的相關 性，換句話說，其毒性與辛醇與水分佈係數成正比，顯示毒性作用主 要來自親脂性，藉由覆蓋於細胞膜上造成生化通徑阻塞，或造成細胞 膜的「非極化」而形成毒性，因此我們可稱這類型有機物為「非極性 麻醉」型。此外因為這類型毒物的毒性與辛醇-水係數迴歸有較佳相關 性的毒性，且毒性較與其它類型毒物還要低，學者便將其定義成基線 毒性（baseline toxicity），而常見化學物質有烷類、醇類、醚類、苯類 或帶有鹵素取代基等製藥業、農藥和染料等工業常用的物質。Cronin[37] 由其弧菌實驗中，發現此類物質不發生生物性的反應，它們的毒性強 弱和在作用位置（site of actionor reaction site）的濃度有關。

z 極性麻醉型（Polar narcotic or Narcosis II)

Ren and Frymier[38]認為這類型的化學物質毒性會較Narcosis I 的 毒性要高一些，而常見的毒物包含了苯胺類、硝基苯類及本研究選用 的氯酚類。由於這類毒物毒性較baseline toxicity 高，原因推測可能與 其取代基的不同或是取代基的數目有關。Jawecki and Sawicki [50] 則指 出這類型毒物主要是含有可強烈釋放電子的氨基或氫氧根的芳香 族，其表現的毒性約為nonpolar narcotic compounds 的 2 倍以上，Liao

圖 2.4.2 非特定型反應的化學品[40]

2. 反應有機物(Reactive)毒性機制

這類型有機物除了具有非反應有機物毒性機制外，其官能基和生物體 內所產生之化學變化為主要之毒性來源，通常此類有機物質的毒性超過基 線毒性，比非反應有機物還要毒。Verhaar et al.[41]發現 reactive compounds 的毒性會大於baseline toxicity 有數個 order 以上。

反應性有機物其官能基具有親電性（Electrophile）能與生物體內之酵 素、反應位址之氨基及硫基產生鍵結、取代、錯合等之化學變化，促使養 分吸收、物質傳遞等新陳代謝循環之生化路徑因而受到破壞，造成生命功 能損壞。由於有機物質及生物體內之反應位址皆已產生化學變化，無法像 非反應有機物具有可逆性的效應，因此反應性有機物質是屬於「不可逆毒 性」。 Lipnick[42]將反應性有機物分為四類，分別為反應性親電型毒性

（Electrophilic toxicity）、反應性前親電型毒性（Pro-electrophilie toxicity）、 反 應 性 具 氰 基 型 毒 性 （Cyanogenic toxicity ） 和 反 應 性 多 機 制 型 毒 性 （Multiple toxicity），而這四類代表生化作用如下:

z Electrophilic toxicity：主要由於有機物擁有的親電基(Electrophilic group) 和生物體內大型分子上的硫氧基等親核部分(Nucleophilic moiety )，產 生取代或相加反應而造成毒性。 z Pro-electrophilie toxicity：由於該類有機物經由一連串生化作用，將原 來物質轉變為Electrophilie toxicity 的物質。 z Cyanogenic toxicity：由於毒物由水解或酵素活化放出氰酸離子而造成 毒性。 z Multiple toxicity：這類物質的毒性作用機制較為複推，可能是因為毒 性的產生是必須經過數階段或多重作用而形成毒性的。 圖 2.4.3 特定型反應的化學品[43]

2.5 混合毒性

2.5.1 非交互作用(Non-interactive) 及交互作用(Interactive)

Markin 曾說過混合毒性的研究只討論化學物質與生理系統間的作 用，而不討論化學物質間的作用，當只討論兩種化學物質共同導致反應的 發生，即可稱此特殊的反應為共同效應(joint effect)，而此 joint effect 可分 為二類: 非交互作用(non-interactive) 共同效應 (joint effect) 交互作用(interactive) 回顧過去大多數的生態毒理學家大多以魚類為試驗物種針對兩種或 多種以上的化學物質進行實驗，進行joint effect 的探討，而在這門領域的 先軀者為 Bliss [44]，其首先提出辨別混合毒性作用的量化方法，針對單一 毒性物質配合probit 模式(常態分布函數)得到劑量-反應曲線，依照曲線的 平行與否來判定化學物質的混合毒性，理論中將生物體對於毒性物質的容 忍度相關性定義在0 至 1 之間(ρ= 0 ~ 1)，當 ρ= 1 時表示兩毒物具有平行的 劑量-反應曲線及呈現完全正相關的毒性容忍度，而當 ρ= 0 則指反應獨立 和零相關。此外Bliss 將毒性作用分成二種:

1. 簡單相似作用(Simple similar action, simple joint action or concentration/ dose addition)：用來描述非交互作用(Non-interactive)的狀況，混合過 程中化學物質間不會交互影響，且各化學物質各會提供等比例的毒性 單位，可用於了解同分異構物(isomer)和結構相似物(analogue)。 2. 簡單非相似作用(Simple dissimilar action, simple independent action or

response addition)：指化學物質間不會影響彼此的在生物反應位置 (reaction site)產生的反應，活體動物所受的毒性是各混合物的總和，而 反應相加(response addition)指生物產生的毒性反應必須等到毒物的劑 量大於生物容忍度才會顯現出來。

Plackett and Hewltt (1952)[45]提出的理論為擴充Bliss 毒性容忍度至負 值，並使用二維的常態分布函數計算，其明確的定義出四種反應作用的型 式: 1. 以兩化學品首要反應的作用位置和型式的相同和不同可分為相似 (similar)和不相似(dissimilar) 2. 在兩化學品前提下，其中一個化學品是否會或者不會去干擾另一化學 品所引發的生化反應，而可分為交互作用(interactive) 和非交互作用 (Non-interactive) 一 般 而 言 ， 研 究 混 合 毒 性 的 基 本 假 設 皆 為 非 交 互 作 用 (Non-interactive)，這是因為交互作用牽涉到化學反應及生化反應太過複 雜，故較少探討。然而從最近文獻中，發現有越來越多研究專門從化學及 生化反應方面解釋混合毒性的變化情形。Chen[19]研究發現malononitrile 與 反應性醛混合時，會產生明顯的協同情形；Lin et al.[46]將Chen 的研究結果 作進一步分析，並利用HPLC 作為偵測儀器，發現當 malononitrile 與長鏈 醛同時存在時，醛易被O2氧化形成carboxylic acids，此種生成物 pH 值極

低，造成Microtox 的抑制率上升，使得混合結果為協同現象。至於在生化

反 應 的 部 份 ，Petroutsos [47] 等學者使用 HPLC 及電噴灑游離質譜儀 (ESI-MS)，研究發現海洋性藻類 Tetraselmis marina 能夠將 4-Chlorophenol 降解成毒性較低的化學物質。由以上文獻我們了解到，混合毒性是個非常 複雜的研究，它不僅牽涉到化學物與化學物之間更包含了化學物與環境間 的反應，故預測混合毒性的變化情形需考慮多方面的因素。

2.5.2 混合毒性研究之重要性 許多環境法規對於水質標準的規範，係根據單一毒性物質對於水中生 物做毒性試驗後而訂定。然後在真實水體環境中，通常承受不同污染源所 排放的多種毒性物質，毒性物質彼此間可能產生交互作用，導致混合後的 毒性產生變化。因此，以單一毒性試驗結果作為法規訂定的標準是不足夠 的。Wong(1982) 研究顯示，在管制標準內的十種毒性物質，當各別存在 水體時，並不會造成任何毒害作用。但是當十種毒物同時存在，則明顯對 四種主要藻類造成抑制作用。基於上述情形，有必要針對毒性物質混合 後，其毒性的變化作一深入研究，以制定更完善的水體水質標準，確實達 到保護水中生物之目的。 水體混合毒性對生態造成的影響已有幾十年的研究歷史[14] [15]，目前採 用的混合毒性理論源自於藥理學，此兩個基礎理論為:

1. Concentration addition (CA) - 混合的毒物機制相同，作用位置一樣，CA

的觀念可用數學式子表示： 1 1 =

∑

= n i xi i EC c 。

2. Independent action (IA) - 相互混合的毒物機制不同且作用位置不一 樣，其若以數學式子表示則為：Emix=1-Π [1-E (cι)]。

在預測有機物的混合毒性這領域上，許多學者認為Concentration

addition(CA)模式擁有較高的預測能力，至於 IA model 則往往會低估混合 毒性。尤其對於劑量-反應關係中曲線斜率大於 1.25 的毒物，在風險評估 上，利用CA 模式來預測其混合毒性較為保守[16]。

Broderius et al.[20]以fathead minnoe 作為混合毒性試驗物種，並以混合

結果為依據，比較CA 與 IA model 的預測能力。結果發現當反應物質與其

他作用機制毒物混合時，CA 預測出的抑制率較符合實際實驗的結果，此 CA 是個較恰當的預測模式。此外作者

亦發現當混合毒物的數量越多，IA 的預測能力也大為提升，幾乎與 CA ㄧ 致。Backhaus et al.[48]針對除草劑作ㄧ系列混合毒性試驗，發覺當毒物的單 一劑量-反應曲線(Weibull model)斜率落在 2.3 左右時，IA 的預測能力幾乎 與CA 一模一樣，這是因為自然對數 10 正等於 2.3 (ln10 = 2.3)，此例為數 學上的特例，與混合毒物機制沒有一定的關聯。Cedergreen et al.[49]利用殺 真菌劑 (Fungicide) 與殺蟲劑 (insecticide)的混合毒性結果，評估 CA 及 IA model 的預測能力。與其他文獻不同的是，Cedergreen[49]多考慮了相似係數 (λ)，其比較結果發現，當毒物的劑量-反應關係曲線斜率落在 1.25(sigmoid log-logisitic dose-response curve)時 IA 與 CA 的預測能力幾乎相同；若斜率

小於1.25，IA 預測力較佳，反之，CA 則為較適當的預測模式。

早期的研究者多選用相同機制的毒物作為混合毒性實驗。1997 年 XU 與 Nirmalakhandan[17]兩位學者選擇66 種非反應性有機物質，分別取六 個、八個以及十個毒物混合，結果大致呈現毒性相加(additive)。故在麻醉 性物質間的混合，過去早期的研究皆指出其混合毒性效應偏向毒性相加。

至於在不同機制毒物間的混合試驗，Chen and Chiou [18]對13 種非反應

性及4 種反應性有機物，以 Microtox 做混合毒性研究。其結果發現，非反

應性有機物彼此的混合，若此兩種有機物具有近似平行的劑量-反應曲線， 則發生毒性減弱的機率最大;至於以非反應性和反應性有機物混合時，由於 有機物間兩種機制毒性貢獻比重不同，毒性反應位置差別大，故其實驗結 果大致上為毒性消減作用(antagonism)。

Chen and Yeh [19]針對反應性有機物的混合情形做研究，並將反應性有 機物依毒性作用機制的不同再細分為四大類。研究結果發現，若機制相同 之反應性有機物混合時，以發生毒性相加及毒性減弱為主;若不同機制且兩 種反應有機物的劑量-反應曲線斜率甚小時，則出現毒性加強(synergism)的 機率很高，此表示對生態系統極具威脅。而當此兩種反應有機物中有一者

其劑量-反應曲線斜率為高時，易呈現毒性減弱的效應。

Broderius et al.[20]利用相同機制的毒物做混合試驗，結果與其他學者相 似，同一機制的毒物混合後，其毒性相加(addition) 的機率較大，主要因為 相同機制的毒物相互扮演著稀釋的角色，因而混合結果為個別毒物的毒性 相加。此篇研究同時也以不同機制的毒物混合，實驗結果發現產生拮抗作 用(less than additive)的機率較大。此部分的結果與 Chen and Chiou[18]的結 果相符。 綜合以上的研究結論，歸納出四個主要預測混合作用之關鍵: 1. 非反應性毒物之混合效應為毒性相加或減弱，而當兩化學物質的劑量- 反應曲線相互平行的話，往往表現出毒性相加的情形;若兩毒性物質的 劑量-反應關係斜率差別很大時，則毒性減弱的情況較明顯。 2. 相同作用機制的反應性物質混合時，通常大部分表現出毒性相加或減弱 的情形，在這類的混合中並無明顯的毒性加強效應產生。 3. 有機物質具有小斜率的劑量-反應曲線時，表現出毒性增強的機率較 多，而當斜率大時，大部分為毒性減弱。 4. 反應性有機物與麻醉性有機物的混合毒性，由於其毒性作用位址不相 同，故其主要為毒性減弱作用。 在本研究中，選取較少被探討的反應性與麻醉性物質相混合，並利用 上述預測混合毒性準則，比較實驗結果是否吻合。於反應性物質中選用反 應性高、且具高比例協同作用的醛類作研究；極性麻醉物則選擇最具代表 性、環境中最常見的氯酚。

2.6 毒性物質—氯酚介紹

2.6.1 氯酚化合物的特性及來源 氯酚類化合物為含氯芳香族化合物，具毒性、不易揮發、比水重、且 具穩定化學特性之化合物，能長久存在於環境中，且其為一種難分解物 質，在環境中常藉由食物鏈形成累積，而增加其污染程度。其物化特性可 見表2.6.1，而其合成方式及用途則見表 2.6.2。 表2.6.1 氯酚化合物之物化特性 毒性物質 Log P pKa 分子量 比重 溶解度 物化特性 (g/mol) (g/L) 2-Chlorophenol 2.29 8.3 128.6 1.241 28.5 液體，微溶於水， 易溶於鹼性溶液 3-Chlorophenol 8.8 128.6 1.245 26 液體，微溶於水， 易溶於鹼性溶液 4-Chlorophenol 2.53 9.2 128.6 1.306 27.1 結晶狀固體、微溶 於水，易溶於醇、醚 2,4-Dichlorophenol 3.20 7.8 163.0 1.383 4.50 針狀晶體，難溶於水 易溶於謎、苯、醇 2,4,6-Trichlorophenol 3.67 6.0 197.5 1.49 0.80 白色粉末，難溶於水 易溶於謎、苯、醇 Pentachlorophenol 5.02 4.7 266.4 1.987 0.014 白灰色粉末，加熱有 刺激味，可溶於鹼中 不溶於水

表2.6.2 氯酚化合物之合成及用途 毒性物質 合成方式 主 要 用 途 2-Chlorophenol 酚直接氯化 有機物合成 3-Chlorophenol 酚直接氯化 有機物合成 4-Chlorophenol 酚直接氯化 製造2,4-Dichlorophenol 2,4-Dichlorophenol 酚直接氯化 作防腐劑及殺蜘蛛劑 2,4,6-Trichlorophenol 酚直接氯化 製造五氯酚 Pentachlorophenol _{酚或氯酚直接氯化 用作木材防腐劑、除草劑、殺蟲劑} 目前將近有15000 種氯酚化合物在環境中所使用，造成在淡水及海水 中時常可見到氯酚此種污染物，其污染來源主要為除草劑、殺菌劑與殺蟲 劑的噴灑，以及木廠中為了防止木頭腐蝕使用之防腐劑、紡織廠及皮革製 品中皆會釋放氯酚類有機物進入環境中。此外造紙工廠漂白製成之廢水中 也可發現其存在。另一部分的氯酚來源也可能由環境中其他化合物經生物 轉化作用而形成，例如五氯酚可由六氯苯經生物轉化而產生[21]。隨著藥劑 的生產及使用所排放出含大量氯酚類的廢水，若流入水體中將是一大汙 染。雖然水體具有基本的自淨能力，然而在氯酚類大量的使用下，早已超 出其自淨能力範圍。 2.6.2 氯酚化合物的毒性與危害 氯酚化合物對生物體造成的毒性主要由於親脂性高，易覆蓋於生物細 胞上，使得物質無法進出細胞而導致生物的死亡。除此之外，部分酚類會 和微生物體內某一特定組織產生鍵結而阻斷電子之傳送，如此，即造成微 生物生長的抑制。氯酚對不同營養階層的生物皆會造成毒性，且是種難分 解化合物，甚至某些氯酚會造成生物累積現象(bioaccumulation) 。由於以 上種種原因，環境中的氯酚一值是學者關注、研究的物質。

Boyd [22]等學者曾利用細菌P.fluorescens 對一系列之氯酚類進行生物 毒性試驗，發現氯酚類對試驗物種之毒性隨著其鍵結氯的數量增加而增 強，對酚類而言，辛醇與水係數(log P)越大其毒性也越強。此外氯酚化合 物的毒性也因氯原子的所在位置而不同，通常以 para (對位) 位置的氯酚 化合物毒性最高，其次為meta(間位)及 ortho(鄰位)。除了以上所述因素會 影響氯酚的毒性之外，環境中的pH 值也是個重要因素，若 pH 大於毒性 物質的pKa，此時氯酚會以解離態存在於環境中，通常未解離態的氯酚毒 性較強。因此為了降低pH 因素的干擾，實驗的 pH 最好皆控制在 pH=6.5 左右。 氯酚化合物主要會破壞生物體內參與新陳代謝化合物的結構以及未 鍵結磷酸酯化作用的進行，並抑制ATP 和其他許多酵素的活性，使人體產 生過量的熱，造成中樞神經失調、呼吸困難和心臟衰竭的症狀(蘇，2001) [23] 。氯酚會因吸入、皮膚接觸及誤食或經食物鏈累積進入人體，對人類健 康的危害可分成急性及慢性兩部份。在急性部份會造成皮膚的紅腫、眼睛 接觸會刺激結膜、吞食會造成口及食道組織壞死;至於在慢性的危害部份， 長期的暴露會傷害肝臟及腎臟，並產生支氣管炎。

2.7 毒性物質—醛類介紹

醛類化合物為含有-OH 官能基的碳氫化合物，本研究中選取甲醛、丙 醛、丁醛及戊醛作混合毒性試驗。醛類具毒性、易揮發、不利長久貯存等 化學特性且具有高反應性的有機毒物。醛在環境中是個普遍存在的汙染 物，使用十分地廣泛，在化學製品方面，常被用作人造樹脂的原料;也可用 在殺蟲劑、除草劑、除臭劑及滅菌劑，在木材工業方面常以醛類化合物做 黏著劑，部分醛類也被運用在照片顯影劑當中，除此之外，在橡膠合成廠 也有醛類化合物的蹤影。除了工業用途外，醛類也運用在醫療院所病理組 織切片固定及保存、醫院解剖大體的保存等。在醛類大量的使用下，若流

入水體生態將會對環境造成嚴重的傷害。 在毒性資料方面，進入人體的醛能和蛋白質的氨基結合，使蛋白質變 性，擾亂人體細胞的代謝，對細胞具有極大的破壞作用。同樣的，醛對人 體的危害也可分為急性及慢性兩部份，在急性部份，皮膚接觸醛類化合物 會刺痛、變色及產生過敏反應，眼睛碰觸時則會發痛、流淚。而長期暴露 在含有醛的空氣下則會造成慢性氣管炎，並且部分醛類(如甲醛)會傷害生 物體的DNA，並且被國際癌症研究機構(IARC,1995)確定為可疑致癌物及 致突變物。

第三章

基本理論

本研究選用的有機毒物依照QSAR 模式的分類，將有機物分成反應性

有機物與非反應有機物兩大類。而處理毒物數據的模式，一般有三種：Probit

模式、Weibull 及 Logit 模式，根據 Chen and Chiou(1995) [18]對螢光菌的毒

性分析，發現Probit 及 Logit 模式較適合螢光菌的毒性分析，因此本實驗

中數據的處理選用Probit 模式。此外，本章節並就混合毒性作一簡單介紹。

3.1 QSARs(Quantitive Structure Activity Relationship):

由於各種化學物質的大量出現，且在醫學的領域上，人工合成的藥物 更是不斷的出現，因此其對生物體的毒性為何，也相對地變的更為複雜， 而運用模式去預測毒物與生物體之間的反應為何，也因應而生。QSAR 即 為一例，其主要意義在於以化學物質的物理或化學性質，去推測其對生物 體生化活動造成干擾的程度。在毒性物質的影響大小(如毒性數據)與毒物 的物化特性(如分子鍵結與分子形態)之間，建立ㄧ定的關係，如此在具有 相似物化特性的毒物間，即可去預測其對生物的生化活性反應如何。 利用QSAR 模式來分類毒性機制，可將有機物分成兩大類，一為反應 性(reactive)有機物，另一則為非反應性(non-reactive)有機物，將其分述如 下: 3.1.1 非反應性有機物毒性機制: 非反應性有機分子進入生物體內後，並不參與生化反應，其毒性主要 來自於有機物的親脂性(lipophilicity) 。有機物的親脂性促使有機分子覆蓋 在細胞膜上而造成生化路徑的阻塞，使得細胞無法正常的代謝，而形成生 化反應的抑制。此種毒性反應類似吸附的行為，故為可逆的毒性。屬於這

類的有機物通常為一些簡單的非電解質有機物，而這類的毒性作用由於其 反應的類型又稱為「麻醉效應」(narcosis toxicity mechanism) ，一些簡單 無複雜官能基的醇類、酯類、酮類及醚類皆屬之。麻醉作用機制又可分為 極性(Polar)以及非極性(Non-Polar) ，實驗中選用的氯酚類皆屬於 Polar Narcosis。Verhaar(1992) 認為極性與非極性麻醉毒性效應的差異在於氫鍵 鍵結提供酸性的強弱不同，極性麻醉化合物通常比非極性麻醉物質活潑， 因此導致麻醉性物質的毒性比非麻醉性物質來的高。 3.1.2 反應性有機物毒性機制: 對於許多有機物，當其以辛醇與水分配係數去描述時，由於常呈現出 比所預估的毒性反應更激烈，此種有機物為模式的”outlier ”部分，其具有 超額毒性(exceed toxicity) ，此類具有超額毒性的有機物將之歸納為反應性 有機物。反應性有機物其毒性機制為化學物質直接參與生物體內之生化反 應，奪取其他物質反應的位置，藉由阻絕生化作用來造成毒性。由於生物 體內反應位址均已產生化學變化，故其毒性反應為不可逆。醛類則屬反應 性有機物。

3.2 毒性物質劑量-反應模式

3.2.1 常用的單一毒性模式 當毒性物質對受體生物發生作用時，受體生物所受影響或死亡的百分 率，隨著毒性物質濃度而有所影響。通常毒性物質劑量對於受體生物反應 劑量會呈現成S 曲線關係，稱之為劑量-反應曲線圖。若已知毒物進入生物 體內的量，則可稱為劑量反應關係，其中x 軸為有機物濃度，而 y 軸為反 應百分比。在毒性試驗過程中，受測生物受毒性影響造成50%抑制或死

亡，則稱為EC50 ( Effect Concentration 50%) 或 LC50 ( Lethal Concentration 50%)，不同的生物體對於不同的毒性物質有不同的斜率大小的劑量反應關 係如圖3.2.1 所示。

圖3.2.1 不同斜率的劑量反應關係

由於利用 S 型曲線求取 EC50（半致死濃度）並不容易。因此必需藉

由數學關係式將 S

型轉為直線型以便求取。其中最常見的毒性物質劑量-反應模式有Probit、Weibull 及 Logit 三種，Christensen 曾經對這三種模式 做比較；發現這三種模式是依據不同的假設發展而成; Weibull 模式是假設

毒性物質與受體生物間產生化學鍵結，至於 Logit 模式則為假設毒性反應

形式如同某種酵素反應。下列為常用模式之解釋:

1. Probit 模式：為最常用的劑量-反應模式，主要是由實驗所得，假設生物 對毒性物質的容忍度分布為常態分布(Log-normal distribution)，其主要 以毒性物質濃度之log 值與反應率之 NED(Normal equivalent deviation) 具有線性關係為基礎，其中反應率即測試生物對毒性物質之反應比率

（如死亡率等）。此模式將劑量-反應模式之 S 型曲線，轉換成 NED 尺

度上的一直線，原來之劑量-反應曲線 50%反應率之處對應到 NED scale 上為零。84.1%反應率之處對應為 1，而 NED scale 之座標值加 5 即為 Probit 的座標，Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下：

Y ＝ NED ＋ 5 Y ＝ a ＋ b log（Z） P ＝ 0.5 [ 1 ＋ erf

(

)

2 5 − Y ]

其中，Y 為 Probit 的概率單位；a,b 為反應曲線之截距與斜率；Z 為毒 性物質所加之劑量；P 為生物體之抑制反應率，在本研究中以抑制 50 ﹪為主；erf 為數學上之 Error Function。

2. Weibull：為機率-反應機制基礎（Mechanistic-Probability basis）模式，發 展根據毒性物質分子與受測試生物之受體分子間化學鍵關係所推演而 來，logit 模式相同皆假設毒性物質會在生物體內受體產生化反應。 3. Logit： 由人口成長研究所發展而出的另一種模式，描述毒性反應中的

某種酵素反應( Enzyme Reaction），適用於自催化( autocatalysis ) 之化 學反應。

3.3 混合毒性理論

3.3.1 Isobologram Isobologram 由 Loew [24]於1926 年所提出用以描述兩種毒性物質混合 後，毒性變化的圖形表示法。「isobole」的觀念發展主要是為了評估了解混 合毒性作用而發展，就「isobolo」字而言，起源於「isos」意謂著相等的 意思，而就「bolo」字而言，其意謂著混合效應的圖形中有向內凹（ strike） 和向外凹（bolw）的情形發生。混合毒性試驗中之兩種毒性物質取不同毒 性單位比例加以混合，在一個固定的抑制率或死亡率下（如EC50或LC50）， 按 不 同 的 混 合 比 例 畫 出 一 個 等 抑 制 率 或 死 亡 率 曲 線 ， 此 一 圖 形 稱為 Isobologram，為指標值理論的基礎。 Isobologram (見圖 3.3.1) ，圖中所有曲線均以 50% 抑制率為基準線， 若畫出之曲線為通過（1,0）及（0,1）的直線，及無論任何毒性單位比例 相混合其毒性單位均為1，則判定混合毒性效應為毒性相加(Addition) ; 若 為凹向原點之曲線，則判定為毒性加強(synergistic) ; 若曲線偏離原點，則 為毒性減弱(antagonistic)。實驗中繪製 isobologram 所選用的毒性單位為 3:1、1:1、1:3。 在繪出Isobologram 時，有時會發現所繪曲線會跳出由（1,0）及（0,1） 所界定出的正方形範圍中即跳出Isobologram 所能描述的非交互作用（non- interactive）現象中，呈現強烈的 antagonism ，該現象稱為複合式的共同 反應（complex joint action）。而 complex joint action 的主要特性如下：(1) 在任何毒性單位比例下，均呈現混合毒性減弱現象。(2)不同毒性單位比 例，有毒性效應減弱現象發生。(3)對於劑量-反應曲線斜率較大之毒性物 質，其在毒性單位較小時，對另一種毒性物質有解毒作用。

圖3.3.1 isobologram 示意圖

3.3.2 混合毒性指標

研究常用的混合毒性效應指標有有混合毒性單位（toxic unit，TU）、 加成指標（additive index, AI）、混合毒性指標(mixture toxicity index,MTI)。 而本研究僅選用混合毒性單位，其說明如下： 501 1 EC Z M = + 502 2 EC Z

其中 M : sum of toxic units 相加係數 Z1 : 毒性物質 1 的濃度

Z2 : 毒性物質 2 的濃度

Z1+Z2 : 造成 50% 的抑制

EC501 : 毒性物質 1 的 EC50 毒性容忍度

本實驗利用TU 作為混合的毒性單位，至於判別混合的結果則以 95% 信賴區間為依據。

其中M<1：混合結果為協同(greater than addictive,毒性增強)。 M=1：(95%信賴區間包含 1)毒性相加(addictive) 。

M>1：拮抗作用(less than addictive,毒性減弱) 。

3.3.3 非交互作用混合毒性模式

Hewlett ＆ Packett 於 1959 年[16]提出非交互作用混合毒性，此為2 維 模式，其限制條件為毒性物質間不能有交互作用，後經多位學者研究補 充，Christensen & Chen 於 1985 年[17]發展出可選用Probit、Logit 、Weibull 三種劑量-反應模式來分析並可考慮多種毒性、營養物質交互作用之數學模 式及預測混合毒性之應用程式(Multox) 。 毒性實驗中的存活率Q(non-response fraction)其關係式如下所示(以二 維為例): Pr( 1) 1 2 1 1 + ≤ = _δλ _δλ Q 其中 Q: 生物不反應率(non-response fraction,及為存活率)。Q 值決定於機 率分布函數內積分區間的大小。 Pr: 機率分布函數，其函數值由括弧內積分區間定義式δ₁1X+δ₂1X ≦1 決定。

λ:相似係數(similarity parameter for the action of two toxicants on two

biological systems) 。用來描述兩藥物作用位置的相似程度，且 0＜λ ＜1，λ 越接近 1，表示毒性作用位置越相似。

Zi Zi i = δ Zi：毒性物質 i 的濃度。 Zi ：單一生物體對毒性物質 i 的毒性容忍濃度。 3.3.4 交互作用混合毒性模式 非交互作用混合毒性模式只能描述毒性相加及毒性減弱作用兩種混 合毒性效應，而Hewlett 則提出交互作用混合毒性模式欲以描述混和毒性 效應的毒性增強作用，以彌補此一缺陷。交互作用與非交互作用混合毒性 模式唯一的不同之處在於相似係數λ 的範圍。在某些情形下，不同毒性物 質間的交互作用造成毒性增加，於是將非交互作用模式之λ 的限制消去， λ 可為 0 到無限大，λ 介於 0 到 1 之間為毒性減弱作用，λ 等於一為毒性相 加作用，λ 大於一則為毒性增強作用，值的大小即為這些混合毒性效應強 弱的度量。交互作用混合毒性模式積分區間定義式為: δ₁1X+δ₂1X ≦1 ，λ>1 3.3.5 混合毒性效應參數 ρ 和 λ 值 本實驗混合毒性效應的指標為相關係數（correlation coefficient , ρ）和 相似係數（similarity coefficient , λ），以下為 ρ 和 λ 兩參數的介紹: 1. Correlation Coefficient:

最早由Hewlett & Plackett (1959)提出，其假設兩毒性物質的機率分佈 函數為二維常態分佈（bivariate normal 即 Bivariate Probit）而其毒性容忍

相關係數為ρ，即描述單一生物體對毒性物質 1（EC50,1）和毒性物質2

（EC50,2）毒性容忍濃度的相關性; ρ 值範圍介於-1 至 1 之間，ρ= 1 表示兩

毒性物質容忍分布為正相關，ρ= -1 表示兩毒性物質之容忍分布為負相關，

圖3.3.2 兩毒性物質相關度之關係圖(a)正相關，ρ = 1 (b)負相關，ρ= -1 (c)不相關，ρ= 0 2. Similarity Coefficient 描述兩毒性物質作用在生物體的位置或生化系統(biological system)相 似程度的度量指標，範圍為0＜λ＜1，當 λ 越接近 1，表示毒性物質的作 用位置越相近，在λ 為 1 時，代表兩種毒性物質共同作用在同一個 biological system，在此情形的反應下可通稱為相似型式的共同作用（similar joint action）。當 λ 為 0 時，則代表兩種毒性物質作用在不同的生化系統上，在 此情形的反應下可通稱為獨立型式的共同作用（independent joint action）， 在混合效應鑑別方面，當λ 介於 0 到 1 之間時，為毒性減弱（Antagonism）， λ 等於 1 為毒性相加作用（additivity）。 3. Combine ρ with λ 將相似係數λ 與相關係數 ρ 相對配對下，混合效應模式的 action mode 主要有四種，如下所示 z 當兩種毒物反應完全相關則ρ＝1，機制完全相同反應位置一樣則 λ＝ EC50,2 EC50,1 ρ= 1 (a) EC50,1 EC50,2 ρ= -1 (b) EC50,1 EC50,2 (c) ρ _{= 0}

1，稱為濃度相加（Concentration Addition , CA)

z 當兩種毒物的反應完全相關，毒性機制完全不同，其ρ＝1 和 λ＝0，

稱為非相加（No Addition , NA)

z 當兩種毒性物質的反應完全無關，毒性機制也完全不同時，ρ＝0 和 λ

＝0，稱為多重反應（Response Multipication , RM）

z 當兩種毒物反應為負相關，且毒性機制完全不同，其ρ＝-1、λ＝0，稱

為反應相加（Response Addition , RA）

這四種不同的組合。四種不同混合效應模式的action mode 整理如表 3.3.1 所示，包含各種 action mode 的反應； 其中較特殊的情形為當相關係 數ρ＝-1（負相關）時，由理論的數學推導發現其劑量-反應曲線之斜率同 樣很小，會有毒性加強之協同效應產生。本研究當中，在預測混合毒性的 模式分析上，選擇Response addition。 表3.3.1 基本四種混合效應定義

Parameter Type of action Abbreviation Response Effect

ρ λ

1 1 Concentration

addition CA - Additive

1 0 No addition NA max (P1,P2) Antagonistic

0 0 Response multiplication

RM 1-(1-P1)(1-P2) -

第四章

實驗設備與方法

4.1 實驗設備

1. 純水製造設備 實驗中清洗容器及藥品配置用水皆為自來水依次經過過濾、離子交換、 蒸餾然後再經超過濾( Milli-Qplus ) 處理之水。 2. 微毒測試儀

實驗基本設備為 Microtox Model 500，由 Micobics 所製(圖 4.1.1)。

3. pH 測量儀 使用 Suntex 公司，型號 SP-7 之 pH 測定儀。其精確度為± 0.01。用以 測量stock solution 之 pH 值，並將之控制在中性範圍。 4. 冰箱 乾燥菌種貯存於-20℃之冰箱，至於 MOAS、稀釋水及活化液則存放於 Whirpool 之冰箱(4℃) 。 5. TOC 毒性物質濃度的分析使用廠牌為Jena 的總有機碳分析儀(TOC)。

6. 高效能液相層析儀(High Pressure Liquid Chromatography, HPLC )

使用Waters 公司，型號為 LC ModuleΙ。使用之 column 材質為 C18。 主要用以分析混合毒物中其個別濃度的消減情形，並藉此觀測兩毒物間是 否產生化學反應。

4.1.1 基本原理

Microtox 偵測毒性強弱之基本原理，在於利用一種海底發光菌( Vibrio fisheri; 學名為 Photobacterium phosphorium) 此菌本身具有自然發射螢光

的特性，一旦螢光菌受毒性物質的侵害，將會抑制螢光的發光強度。因此 藉由螢光被抑制的情形即可判斷毒性之強弱。 4.1.2 儀器構造 儀器主要由培養槽(incubator) 、控溫設備及螢光偵測裝置所組成。 (1)培養槽及控溫設備:培養槽位於儀器右上方，共有 35 個(如圖 4.1.2) ，用 以儲放試驗用小試管，左側30 個培養槽用於分析樣品時使用，其溫度皆 維持15℃以保持實驗時維持一定溫度狀態。右側標明 Reagent 培養槽則供 儲放螢光菌使用，其溫度則維持4℃以保持螢光菌最佳活性。下方 Read 培 養槽則為讀取螢光訊號時使用。 (2)螢光偵測裝置:螢光偵測裝置位於 Read 槽下方，偵測時僅需按 Read 鍵， 即可自動將上方小試管拉下加以偵測螢光訊號。

圖4.1.1 微毒測試儀

4.1.3 基本配備

Microtox 基本配備共計下面數種，均由美國原廠提供。

(1)稀釋液( Diluent solution ):稀釋液主要成分為含 2%濃度之 NaCl 無毒溶 液，功用為稀釋樣品。

(2)活化液(Reconstitution solution):活化液為經過特殊處理的無毒無菌蒸餾 水，功用在於活化冷凍乾燥狀態下的螢光菌。

(3)滲透壓調節液(Microtox Osmosis Adjustment Solution ; MOAS):其成分為

含22%NaCl 濃度之無毒無菌溶液，功能在於調整樣品的 NaCl 濃度達到 2%左右，以與螢光菌的滲透壓相等，用量多寡和取用樣品體積成下列 關係: X 毫升的樣品*0.1=所需的滲透壓調節液體積 (4)小試管(Cuvette):小試管經特殊處理以維持無毒性狀態，形狀為圓形以符 合培養槽的形狀，主要功能為盛裝樣品及螢光菌。由玻璃所製成，使用 後拋棄不重覆使用，以避免實驗誤差。 (5)螢光菌:螢光菌生長於海底，經過處理成冷凍乾燥狀態，在零下 20℃的 環境可維持一年。 (6)Micropipette: 作為實驗進行中轉移螢光菌、solution、及樣品用。 4.1.4 標準分析程序: (1) 加 1000μl 的活化液至 reagent 培養槽。緊接著自冷凍庫中取出螢光菌 並加入reagent 槽中的活化液，等待 5 分鐘。 (2) 將小試管放入 A1 至 A5、B1 至 B5，隨即加 500μl 稀釋液至 B1-B5， 並加 1000μl 稀釋液至 A1-A4。 (3) 抽取 10μl 的螢光菌分別加入 B1~B5，並以移液器將之混合均勻。 等待 15 分鐘使螢光菌發光達穩定狀態。

(4) 加 250μl 滲透壓調節液及 2500μl 樣品至 A5。以連續 2 被稀釋方式 由 A5 抽 1000μl 至 A4、A4 抽 1000μl 至 A3、 A3 抽 1000μl 至 A2。自 A2 抽取 1000μl 拋棄。 (5) 將 B1-B5 放入 read well 中讀取其儀器顯示的螢光值，此時即為 0 分中 之螢光值(I0) ，隨即以移液器將 A1-A5 中各取 500μl 加入 B1-B5，等 待5，15 分鐘並分別記錄其螢光值(I5、 I15)。 4.1.5 Microtox 毒性試驗環境因子 (1) 毒性試驗時間 螢光菌在取出冷凍庫活化後，由於生物本身的衰減，發光值減低，故 每次的試驗時間需控制在三小時以內，若試驗時間超過兩個小時，就必須 以標準毒物phenol 做校正(reference control) 。總而言之，每次的實驗約進

行12 組的毒性物質，需時兩小時至三小時，此時螢光菌正好將近用完， 此為確保生物質製劑品質，所做的時間控制。 (2) pH 值干擾 從文獻中可了解，環境中的pH 若超過 6~8 此範圍將會影響到螢光菌 的活性(ISO,11348; Microtox,1992) [27]。因此為了降低此因素的干擾，研究 試驗有機物的pH 值，皆有落在此範圍內，並不會影響毒性試驗。 (3) 吸光光譜干擾 由於Microtox 活體營光發光光譜最大波長值約 494nm，如果毒性物 質在此波長附近能吸收此光譜，則螢光讀值會較實際螢光發光值低，此時 必須進行色度校正。將研究的有機物質以450 至 500 nm 光譜掃描結果， 並無吸光現象，故無須作色度校正。

4.2 試驗毒物

本試驗所選用的有機物包含反應性及麻醉性物質,均為環境水體中常 見的污染物質,其基本的物化特性如表 4.2.1 所示。

表4.2.1 有機化學物質其基本特性

毒性作用機制 化學物質 分子式 分子量 [g/mole]

electrophile nonelectrolytes formaldehyde CH2O 30.03

propionaldehyde C3H6O 58.08

butyraldehyde CH3(CH2)2CHO 72.11

glutardialdehyde OCH(CH2)3CHO 100.1

polar narcosis effect 2-Chlorophenol C6H5ClO 128.6

3-Chlorophenol C6H5ClO 128.6 4-Chlorophenol C6H5ClO 128.6 2,3-Dichlorophenol C6H4Cl2O 163.0 2,4-Dichlorophenol C6H4Cl2O 163.0 3,4-Dichlorophenol C6H4Cl2O 163.0 2,4,6-Trichlorophenol C6H3Cl3O 197.4 Pentachlorophenol _{C6HCl5O 266.4}

表4.2.1 有機化學物質其基本特性(續) 毒性物質 Log Pa pKa 廠牌 純度 % formaldehyde 0.35 Merck 37% propionaldehyde Fluka 100% butyraldehyde 0.83 Acros 99% glutardialdehyde -0.61 Fluka 50% 2-Chlorophenol 2.29 8.3 Aldrich 99% 4-Chlorophenol 2.53 9.2 Aldrich 99% 3-Chlorophenol 2.49 Aldrich 98% 2,3-Dichlorophenol 3.26 7.6 Aldrich 98% 2,4-Dichlorophenol 3.2 7.8 Aldrich 99% 3,4-Dichlorophenol 3.17 Aldrich 99% 2,4,6-Trichlorophenol 3.67 6 Aldrich 99% Pentachlorophenol 5.02 4.7 Aldrich 99%

a: 辛醇與水分配係數(n-octanol / water partition coefficient)

4.2.1 有機藥品配製 氯酚類隨著氯含量增加，其溶解度會降低，因此2-CP、4-CP、2,3-DP 及2,4-DP 直接以去離子水配製，而三氯酚及五氯酚的配製則參考 Boyd et al.(2000)[28]，在強鹼(0.1N NaOH)下進行配製，待有機物質完全溶解後再以 酸(0.1N H3PO4)將 pH 調回中性。實驗中的濃度皆為名義濃度。 所有的藥品配製分為兩大類: (1) 儲備溶液(stoke solution):量多,濃度高,保存時間長。 錐形瓶內裝60mL 純水並加入適量有機物，蓋上瓶蓋並封緊，劇烈搖 晃30 秒而後置於恆溫震盪儀內搖晃至隔夜，以確保有機物完全溶於 水。考慮有機物的高揮發性，使用過兩次便必須重配。 (2) 測試溶液(test solution):量少，濃度低，配置後馬上進行實驗。 用pipette 取少量毒性物質至裝有純水的錐形瓶中，迅速蓋上瓶蓋封 緊，劇烈搖晃使之混合均勻，作為而後進行毒性試驗之毒性樣本。

4.3 實驗數據之處理

將螢光菌的Luminescence Test 所求得的存活率 Q (不反應分率， non-response fraction) 以下式表示 : IcTo IcTt IoTo ItTt Q= 上式中的符號表示如下 : ItTt : 實驗組在時間 t 時的螢光讀值 IoTo : 實驗組在時間 0 時的螢光讀值 IcTt : 控制組在時間 t 時的螢光讀值 IcTo : 控制組在時間 0 時的螢光讀值 螢光抑制的剩餘率以所得的0 分鐘(Io)、15 分鐘(I15)帶入上式計算， 求得Q 值後，再將濃度與反應的結果帶入 Probit model，求得螢光抑制 50% 的EC50 值。

4.4 儀器操作原理、步驟與設定條件

試驗需先進行有機物定量，所有的試驗毒物皆以總有機碳分析儀(TOC) 定量。並利用高效能液相層析儀、LS-MS 以及分光光度計分析毒物間是否 產生交互作用。以下分別就儀器的原理及實驗步驟分別描述。

4.4.1 總有機碳分析儀( Total organic carbon, TOC)

有機物的濃度以其主要元素--碳表示之，即稱為總有機碳。TOC 主要

利用高溫，將溶液中的有機物氣化燃燒，生成CO2 ，接著通過紅外線分析

儀，測定其生成的CO2 量，即可知總有機碳量，最後利用有機物的結構

4.4.2 高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromat- ography, HPLC） 1. 原理： HPLC 是利用樣品與動相、靜相介面間大小不同之作用力所造成之速 度差導致於樣品中物質之分離。不同的分析物質及Column 種類會不同的 移動相，有的物質較易和動相介面結合，其通過Column 時速度較其他物 質快，因此由於此時間差，使其較先被偵測器偵測到，隨後其他的物質再 一一被偵測到；反之較容易和靜相介面結合的物質，則較慢出現在偵測器 上。當偵測器偵測到物質時，觀測螢幕上會出現一個波峰（Peak Shape）， 依照波峰出現的時間點和標準品比較則可以得知此物質之種類，並可以計 算波峰面積之大小以得之其濃度等數據。理想中的脈衝為高斯曲線 （Gaussian Curve）。本實驗相關規格及設定的內容如表 4.4.1。 表4.4.1 HPLC 相關規格與設定 項 目 規 格 與 設 定 條 件

型號（type） Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector Waters 最新型折射率偵測器(RI) Waters 515 HPLC Pump 分離管柱（column） C18 - 4.6 × 150 mm (Type :T91971L) 迴路容量（loop volume）20 μl 沖提相（mobile phase） 組成：40％乙腈＋60％去離子水 流速：1.0 ml/min 管柱壓力（pressure） 約650 psi 偵測波長（λ） 190nm ~ 350nm

2. HPLC 操作步驟： 圖4.4.2 本實驗中 HPLC 操作步驟及其設定 裝上4.6×150mm 的 C18管柱 開機及系統診斷 40%乙腈+60%蒸餾水 配製而成之移動相 流洗設定 溫度定為室溫+5℃ RI 設定在 Purge 狀態 以0.2 ml/min 之流速 流洗3 小時 待 RI 穩定後，將流速調回 1 ml/min ，按下 inject 鍵 注射器吸取樣品注入 幫浦中，進行分析 電腦螢幕觀察脈衝之面積 以流速0.2 ml/min 流洗 1 小時後始 可關掉儀器及電腦電源

4.5 混合方式

進行兩種有機物的交叉混合的實驗的目的最主要是為了求得共同加 入系統導致50％的受測生物體產生抑制反應的毒性物質 1（Z1）和毒性物 質2 的濃度（Z2），爾後帶入M 值中進行 joint effect 的判定。 混合方式主 要是根據混合毒性單位比例而定，如下所示： TU1：TU2 ＝ 1 , 50 1 EC X ： 2 , 50 2 EC X Xi：混合試驗時，毒性物質 i 加入系統的的濃度 EC50,i：單一生物體對毒性物質 i 的毒性容忍濃度 本實驗中共進行五種混合比例的試驗，分別為1：0、3：1、1：1、1： 3 及 0：1。首先先進行 1 : 1 的混合，利用在單一毒性試驗得到之 EC50,i， 分別配置毒性物質1 及毒性物質 2 的 stock solution：4.44×EC501 以及 4.44×EC502。取毒性物質1、2 等體積混合，則螢光菌承受兩種毒性物質濃 度比例為： 1 , 50 1 EC X ： 2 , 50 2 EC X = 1 1 50 45 . 0 50 44 . 4 EC EC × 2 2 50 45 . 0 50 44 . 4 : EC EC × = 2: 2 表4. 5.1 混合毒性濃度配製 STEP 1 2 3 4 5 6 M 4 2 1 0.5 0.25 0.125 TU1 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 TU2 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 此外本實驗並以不同的TU 值 3:1、1:1、和 1:3 互相混合，將結果繪 製成Isobologram 進一步了解混合效應。

第五章

結果與討論

5.1 Microtox 單一毒性實驗

本研究為利用15 分鐘的螢光抑制 Microtox 毒性試驗方法針對不同機

制的有機物進行實驗。其中反應性物質 (reactive toxicant)包含甲醛

(Formaldehyde)、丙醛 (Propionaldehyde)、丁醛 (Butyraldehyde)及戊二醛 (Glutardialdehyde)；極性麻醉性有機物包括 2-Chlorophenol (2-CP)、 3-Chlorophenol (3-CP)、4-Chlorophenol (4-CP) 、2,3-Dichlorophenol (2,3-DP)、2,4-Dichlorophenol (2,4-DP)、3,4-Dichlorophenol (3,4-DP)、 2,4,6-Trichlorophenol (2,4,6-TP)、Pentachlorophenol (PCP)。上述有機物皆屬 揮發性，且Mcirotox 為一非密閉式的實驗環境，當有機物為高揮發性時， 任何配藥，亦或實驗操作過程中的微小差異，都可能造成每一次的實驗結 果有所差異。因此每次在從事混合毒性研究前，首要工作需先針對所欲混 合的毒性物質，求取其單一毒物的EC50值，而後才能依據EC50值以不同 比例混合作試驗。 表5.1.1 為 4 種反應性物質及 8 種麻醉毒物之單一實驗數據，經由 Probit 模式分析所得的結果，數據中包含試驗次數n、EC50 值、EC50 值的變異 係數及劑量-反應曲線之斜率。圖 5.1.1 至 5.1.12 為 12 種有機物的劑量反 應曲線。由表5.1.1 可看出氯酚類的物質其毒性大致上隨著鍵結的氯數增 加而增強，毒性最弱者為2-Chlorophenol，毒性最強則為五氯酚。 Kobayashi[51] 曾解釋因為鍵結的氯原子越多，將會增加累積在生物表面的 氯酚量，而造成毒性上升。另一方面，Kobayashi 提出當氯原子的取代基 位置在鄰位時，其氯酚的毒性較低。Boyd[22]

時，具有para (對位)位置的氯酚化合物毒性最高，其次為 meta (間位)及 ortho (鄰位)。觀察本研究的結果，當含氯數 1 時，其毒性變化情形 4-CP (para) > 3-CP (meta) > 2-CP (ortho)，至於在二氯酚部份則為：3,4-DP (para, meta) > 2,4-DP (para, ortho) > 2,3-DP (meta, ortho)。此結果與 Kobayashi 及 Boyd 的 結論ㄧ致。會有此現象的發生，主要因為當取代基為鄰位時，氯原子會搶

奪OH 官能基上的氫電子，造成電性減弱以致於毒性下降。

至於醛類的單一毒性部分則無一定的趨勢，但由表5.1.1 中可發現

Glutardialdehyde 的毒性最強，EC50 值為 3.24 mg/L;而 Propionaldehyde 的 毒性最弱，EC50 值為 225 mg/L。值得注意的是，醛類的 EC50 值變動較 大，變異係數(percent coefficient of variation)範圍約在 15-25 %，比起麻醉 性氯酚的0.6-18 %高出許多，此結果與 Chen and Chiou 在 1995 的實驗結果

一致。推測其原因，主要因為Microtox 為一開放式的毒性試驗系統，且醛 類物質的揮發性較高，造成有機物極易從水溶液中逸失，特別當有機物濃 度甚低時，任何實驗操作上的微小差異，皆會造成此現象。 由表 5.1.1 發現本研究中選用的試驗毒物其劑量-反應曲線皆屬中小斜 率，並可看到一有趣的現象，對於麻醉物質而言，所含氯原子越多之氯酚 其劑量-反應關係曲線斜率也越大(斜率大於 2 者為2,4,6-TCP及PCP)，由文 獻中得知[22] [51]含氯數越多，毒物的親脂性越大(及辛醇與水係數越大)，對 於生物體造成的毒性也越強。因此生物體對這類的化合物容忍度較小 (2,4,6-TCP及PCP)，只要濃度發生微小的變化，抑制率即大幅提升許多。 這極有可能是造成三氯酚及五氯酚擁有較大斜率的主因。

表5.1.1 :試驗毒物之 Microtox 毒性試驗數據 Classifications chemical n EC50 (mg/L) SD (mg/L) CV (%) slope reactive Formaldehyde 7 4.42 1.11 25.1% 1.48 Propionaldehyde 6 225 40.7 18.1% 1.65 Butyraldehyde 6 115 24.4 21.2% 1.41 Glutardialdehyde 7 3.24 0.48 14.8% 1.51

Polar narcosis 2-Chlorophenol 4 15.4 1.97 12.8% 1.30

4-Chlorophenol 3 1.12 7.7×10-2 6.88% 1.28 3-Chlorophenol 2 6.22 1.01 16.2% 1.18 2,3-Dichlorophenol 4 4.33 0.82 18.9% 1.29 2,4-Dichlorophenol 4 2.57 0.19 7.39% 1.52 3,4-Dichlorophenol 2 0.71 0.11 15.3% 1.32 2,4,6-Trichlorophenol 3 1.37 0.8×10-2 0.59% 2.35 Pentachlorophenol 3 0.38 3.3×10-2 8.68% 2.09

n: number of data ; SD: standard deviation of EC50 ;

CV: percent coefficient of variation of EC50

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 Formaldehyde conc. (mg/L) Inhi bi tio n r at e ( %

■ : response base on 15-min data

Probit model 圖5.1.1 Formaldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.0 0 10000. 00 Propionaldehyde conc. (mg/L) Inhi bi tion R at e ( %

▓ : response base on 15-min data

Probit

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0.00 0.10 10.00 1000.00 100000.00 Butyraldehyde conc. (mg/L) Inh ibi ti on R at e

▓ : response base on 15-min data

Probit model 圖5.1.3 Butyraldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0.00 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00 glutaraldehyde conc. (mg/L) Inhi bi ti on R at e

▓ : response base on 15-min data

Probit model