（一） 鉀含量測定
鉀含量的測定是根據Jordan-Meille 和 Pellerin (2008)之方法修改而得。取 10 片第二片葉片、10 株地上部或根部，置於 65℃烘箱烘乾兩天，並測乾重。再將材 料剪碎，於550℃灰化爐中灰化 4 天（樣品需呈灰白色）。冷卻至室溫後，再分別 加入100 μL 濃 NHO3及100 μL 35% H2O2。於70℃持續加熱至 NHO3及H2O2蒸乾。
加入2 mL 的二次蒸餾水，以原子吸收光譜儀（Z-2000 Series Atomic Absorption Spectrophotometer，Shimadzu AA680, Japan）測定鉀含量。曲線範圍為 0~2 ppm（μg mL-1） K（以 1000 ppm 之 K 標準液配置）。鉀含量之計算為以 Reading 值（ppm，
μg mL-1 ）× 稀釋倍數（2 倍）÷ 樣品乾重（g）。鉀含量之表示法為每克乾重所含 鉀之milligram 數（mg g-1 DW）。
（二） 鎘含量測定
鎘含量的測定是採用Fuhrer(1982)之方法修改而得。取 10 株地上部或根部，置 於65℃烘箱烘乾兩天，並測乾重。再將材料剪碎，於 550℃灰化爐中灰化 4 天（樣 品需呈灰白色）。冷卻至室溫後，再分別加入100 μL 濃 NHO3及100 μL 35% H2O2。 於70℃持續加熱至 NHO3及H2O2蒸乾。加入2 mL 的二次蒸餾水，以原子吸收光 譜儀（Z-2000 Series Atomic Absorption Spectrophotometer，Shimadzu AA680, Japan）
測定鎘含量。曲線範圍為0~2 ppm（μg mL-1） Cd（以 1000 ppm 之 CdCl2標準液配 置）。鎘含量之計算為以reading 值（ppm，μg mL-1 ）× 稀釋倍數（2 倍）÷ 樣品 乾重（g）。鎘含量之表示法為每克乾重所含鎘之 μgram 數（μg g-1 DW）。
（三） 葉綠素含量測定
葉綠素含量是根據Wintermans and Mots (1965) 修改而得。取 10 片第二片葉，
秤取鮮重後，以2 mL sodium phosphate buffer（50 mM，pH 6.8）將材料研磨成均 質。取40 μL 萃取液於 1.5 mL 離心管，並加入 960 μL、100％的乙醇，混合均勻，
於4℃黑暗下靜置 30 分鐘，再於 4℃以 1000 g（離心機均為 Sigma，2K-15 型）離 心15 分鐘，取上清液以分光光度計（均為 Hitachi U-2800 spectrophotometer）測定 665 nm（A665）與649 nm（A649）波長之吸光值。空白試驗以95%之乙醇取代上清 液。葉綠素濃度為[μg Chl（40 μL）-1）]依公式（6.1 × A665）＋（20.04 × A649）計 算而來。每克鮮種之葉綠素含量（mg g-1 FW）為葉綠素濃度 × 50（稀釋倍數）÷ 1000
÷ 樣品鮮種（g）。
（四） 蛋白質含量測定
蛋白質含量是根據Bradford(1976)之方法修改而得。取 10 片第二片葉，秤取鮮 重後，以2 mL sodium phosphate buffer（50 mM，pH 6.8）將材料研磨成均質。在 4
℃下以17600 g 離心 20 分鐘。離心後吸取 20 μL 之上清液加入 5 mL 之 dye solution，
震盪使其均勻後，靜置約10 分鐘，接著以分光光度計測定 595 nm 波長之吸光值
（A595）。
以牛血清蛋白（bovine serum albumin；BSA）（5 μg、10 μg、20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg），依同樣步驟作標準曲線，求得消光係數為 0.01 μg-1cm-1。可 溶性蛋白質含量是以每克鮮重（fresh weight，FW）含可溶性蛋白質之毫克數表示，
即每克鮮重之蛋白質含量（mg g-1 FW）為 A595 ÷ 0.01（消光係數）÷ 1000 ÷ 樣品 鮮重（g）。
Dye solution 之配置方法為秤取 100 mg commassie brilliant blue G-250，加入 50 mL 乙醇（95%，v/v）且加入少許二次蒸餾水攪拌至完全溶解後，再加入 100 mL phosphoric acid（85%，v/v），然後以二次蒸餾水定量至 1 L。將溶液搖混均勻後，
以Whatman NO.1 濾紙過濾，所得濾液即為 Dye solution。置於褐色瓶中，儲存於 4
℃冰箱備用。
（五） 脂質過氧化作用測定
MDA 是由於細胞膜上的脂質受到活化氧族的傷害而產生的，其含量的增加表
示細胞膜及其功能的改變，所以在本論文之試驗中，以MDA 含量增加程度作為脂
質過氧化程度的指標。MDA 含量測定，是根據 Heath 與 Packer(1968)之方法修改 而得。取20 片第二片葉，秤取鮮重後，以 4 mL trichloroacetic acid（TCA）（5%，
w/v）將材料研磨成均質。在室溫下以 10000 g 離心 5 分鐘，吸取 1 mL 之上清液注 入試管，再加入4 mL thiobarbituric acid（TBA）（0.5%，w/v，溶於 TCA[20%，w/v]
中）。混合均勻後置於95℃熱水浴 30 分鐘，然後迅速將試管插入冰中，終止反應。
約5 分鐘後取出試管震盪，去除氣泡。在室溫下以 2000 g 離心 10 分鐘後，取上清 液以分光光度計測定532 nm（A532）、600 nm（A600）波長之吸光值。空白試驗是 以1 mL 之 TCA（5%，w/v）代替萃取液。MDA 含量之計算為（A532－A600）÷ 155
（消光係數，mM-1cm-1）× 5（體積，mL）× 4（稀釋倍數）× 1000（nmol/μmol）÷
樣品鮮重（g）。MDA 含量之表示法為每克鮮重所含 MDA 之 nmol 數（nmol g-1 FW）。
（六） 過氧化氫含量之化學分析
過氧化氫含量測定，是根據Jana 與 Choudhuri(1981)之方法修改而得。取 10 片 第二片葉或10 株根部，秤取鮮重後，以 3 mL（若是根部以 11 mL 研磨）sodium phosphate buffer（50 mM，pH 6.8，內含 1 mM hydroxylamine）將材料研磨成均質。
萃取液於4℃下以 6000 g 離心 25 分鐘。吸取 2 mL 之上清液加入 1 mL titanium chloride（TiCl4[0.1%，v/v]溶於 H2SO4[20%，v/v]），震盪混合均勻，在室溫下以1000 g 離心 15 分鐘。取上清液以分光光度計測定 410 nm 波長之吸光值（A410）。空白試 驗是以2 mL 之 sodium phosphate buffer 代替萃取液。過氧化氫含量之計算為以 410 nm 之吸光值 ÷ 0.28（消光係數，μmol-1cm-1）× 1.5（稀釋倍數，根部 × 4）÷ 樣 品鮮重（g）。過氧化氫含量之表示法為每克鮮重所含過氧化氫之μmol 數（μmol g-1 FW）。
（七） ABA 含量測定
ABA 以 Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）與 Rab16A 基因表現方 法來測定。
以ELISA 分析 ABA 含量是根據 Hurng 等人(1994)之方法修改而來。取水稻第
二片葉片十片，以6 mL 甲醇[80%（v/v），含 2%冰醋酸]冰浴研磨成均質，將萃取 液靜置於黑暗4℃下至少 24 小時（可存放一週）。於室溫下以 2000 g 離心 10 分鐘 後，取1 mL 之上清液真空乾燥（SpeedVac Concentrator，Savant - SC110）。完全乾 燥後，加入0.5 mL 甲醇（100%）回溶，再加入 0.5 mL NH4H2PO4（0.2 M, pH 6.8），
震盪使其完全溶解。於4℃靜置 10 分鐘，將樣本注入 PVP column （以 waters 之 Vacuum manifold 抽氣），再以6 mL 蒸餾水流洗管柱，收集濾液後加入 100 μL 冰醋 酸，共得濾液7.1 mL。
將濾液注入C18 column（Sep-Pak® Vac C18 cartridge，Waters），同樣以 waters 之Vacuum manifold 抽氣（流量不超過 1.5 mL min-1），加入4 mL 清洗液[甲醇（20%，
v/v）、冰醋酸（2%，v/v）]流洗管柱後，濾液丟棄。樣品於注入 4 mL 萃取液[甲醇
（55%，v/v）、冰醋酸（2%，v/v）]後洗出，收集濾液進行真空乾燥（可暫存於 4
℃黑暗下，一週內分析完畢）。
以200 μL TBS buffer 回溶已乾燥之樣品。取 100 μL ABA 標準液或樣品加入 anti-ABA coated plate 之樣本槽中（Phytodetek® ABA Kit， Agdia Biofords），於每 一樣本槽加入100 μL tracer solution，以膠紙密封後，於 4℃黑暗下靜置 3 小時。倒 出樣本槽中之液體，以200 μL wash solution 清洗樣本槽三次，每次 10 分鐘。每一 樣本槽加入200 μL reaction buffer 後，立刻放入 ELISA microplate reader （ELX808 Ultra Microplate Readers，BioTek Instruments）中，每五分鐘讀取波長 405 nm 之吸 光值（A405），待標準ABA 最低濃度之 A405達1.2 以上停止。各種試劑的配置方法 見表格 3。
標準曲線係以不濃度之ABA 溶液，以上述方法讀取波長 405 nm（A405）之吸 光值後換算結合百分率（Binding %），由 ABA 濃度與 Binding % 建立標準曲線。
樣品亦可由波長405 nm（A405）之吸光值後換算成Binding %，再由標準曲線求得 ABA 含量。Binding % 依下列公式估算而得：Binding % ＝ [（標準 ABA 溶液或 樣品之A405－1000 pmol mL-1 ABA 之 A405）÷（不含 ABA 之 A405－1000 pmol mL-1 ABA 之 A405）] × 100% binding。每克鮮重之 ABA 含量（pmol g-1 FW）為 Binding % 換算之ABA 含量（pmol）÷ 樣品鮮重（g）。
表格 3. ABA 含量測定之 ELISA 反應試劑配置方法
試劑名稱 配置方法
TBS buffer 1000 mL 的溶液中含有 3.03 g 的 trizma base，5.84 g 的 NaCl，0.2 g 的 MgCl2•6 H2O，0.02 g 的 NaN3，pH 7.5。
Tracer solution 使用Phytodetek® ABA Kit 所附，1 瓶 tracer 先加 1 mL 蒸 餾水，5 分鐘後每瓶 tracer 再加 4 mL tracer diluent (kit 所附) 備用，此solution 應鮮配。
Wash solution 使用Phytodetek® ABA Kit 所附。其配方為 1000 mL 溶液中 含有8 g 的 NaCl，1.15 g 的 Sodium phosphate（dibasic，
anhydrous），0.2 g 的 Potassium phosphate（monobasic，
anhydrous)，0.2 g 的 KCl，0.5 g 的 Tween-20，0.2 g 的 NaN3， pH 7.4。
Reaction buffer 使用Phytodetek® ABA Kit 所附：一顆 PNP（p-nitrophenyl phosphate disodium salt）substrate tablet（5 mg PNP/tablet）
溶於5 mL substrate diluent。其配方為 1000 mL 溶液中含有 0.1 g 的 MgCl2，97 g 的 diethanolamine，0.2 g 的 NaN3，pH 9.8。
Rab16A 基因表現之檢測
水稻葉片RNA 之抽取與分析的步驟為：經正常與缺鉀水耕液培養之三葉齡水
稻幼苗，取40 片第二片葉片，加入 1.4 mL TRIzol® Reagent（Cat. No. 15596-018，
Invitrogen）萃取5 分鐘。於 4℃以 13,220g 離心 10 分鐘，取上清液加入 0.2 mL chloroform，混合均勻後靜置 5 分鐘。接著以 4℃，13,220g 離心 15 分鐘，取出上 清液並加入0.5 mL isopropanol，混合均勻，於-20℃靜置 1 小時。再以 4℃，13,220g
離心15 分鐘，去除上清液，分別以 75%、100%之酒精清洗沈澱物，將樣品風乾後 取60 μL 經 diethylpyrocarbonate（DEPC）處理過之蒸餾水回溶 RNA，樣本最後保 存於-80℃。RNA 樣品經 DNase I 處理移除 genomic DNA 後，取 5 μg 經 DNase I 處理過之RNA 進行反轉錄-聚合脢連鎖反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR，SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，
Invitrogen）。以水稻 OsUbiquitin基因作為控制組。所設計的各個基因引子序列與 PCR 反應條件於表格 4。
表格 4. RT-PCR 基因引子序列
Gene TIGR Locus Name Primer Sequence（5’-3’） Products
（bp）
OsUbiquitin LOC_Os03g13170.1 Ubiquitin-5'
Ubiquitin-3'
CGCAAGTACAACCAGGACAA
TGGTTGCTGTGACCACACTT
101
OsRab16A LOC_Os11g26790.1 Rab16A-5’
Rab16A-3’
CGACACACCACCACACCATG
TGTGTACATATGCACGATGA 294
（八） AsA 與 DHA 含量測定
AsA 含量是根據 Law(1983)修改而得。取 10 片第二片葉，秤取鮮重後，以 1 mL trichloroacetic acid [TCA（5%，w/v）]冰浴研磨成均質。將萃取液於 15000 g 離心 20 分鐘，取上清液，分別進行 ASC＋DHA 分析與 ASC 分析分析。
1. AsA＋DHA 含量分析
取200 μL 上清液，加入 200 μL sodium phosphate buffer（150 mM，pH 7.4），
室溫下混合均勻，加入100 μL DTT (dithiothreitol，10 mM) ，室溫下靜置 15 分鐘，
再加入100μL N-ethylmaleimide [0.5 % (w/v)]。加入 400 μL TCA [10 % (w/v)]及 400 μL phosphoric acid 44 % ，振盪均勻，再加入 400 μL 2, 2’-bipyridyl [4 % (w/v，溶於 70 % 乙醇) ，振盪均勻，加入 200 μL FeCl3[3 % (w/v)]，於 37 ℃，水浴搖晃 1 小 時，最後再以10000 g 離心 5 分鐘，以分光光度計測定 525 nm 波長之吸光值（A525）。 空白試驗是以200 μL 之 TCA [（5%，w/v）]代替萃取液。AsA＋DHA 含量之計算 為以525 nm 之吸光值 ÷ 8.092（消光係數，μmol-1cm-1）× 5（稀釋倍數）÷ 樣品鮮 重（g）。ASC＋DHA 含量之表示法為每克鮮重所含 AsA＋DHA 之 μmol 數（μmol g-1 FW）。
2. AsA 含量分析
取200 μL 上清液，加入 200 μL sodium phosphate buffer（150 mM，pH 7.4），
室溫下混合均勻，加入100 μL 二次蒸餾水 ，室溫下靜置 15 分鐘，再加入 100μL 二 次蒸餾水。後續步驟均與AsA＋DHA 含量分析相同。ASC 含量之計算為以 525 nm 之吸光值 ÷ 8.092（消光係數，μmol-1cm-1）× 5（稀釋倍數）÷ 樣品鮮重（g）。AsA 含量之表示法為每克鮮重所含AsA 之 μmol 數（μmol g-1 FW）。
3. DHA 含量分析
DHA 含量（μmol g-1 FW） ＝ （AsA＋DHA 含量）－ AsA 含量
（九） GSH 與 GSSG 含量測定
GSH 含量是根據 Smith (1985) 修改而得。取 10 片第二片葉，秤取鮮重後，以
1 mL sulfosalicylic acid [SSA（5%，w/v）] 研磨成均質。將萃取液於 15,000 g 離心 10 分鐘，取上清液，分別進行 GSH＋GSSG 分析與 GSSG 分析分析。
1. GSH＋GSSG 含量分析
取25 μL 上清液注入 8×12 個樣本槽之 microplate，以 8 爪手動微量分注吸管
（finnpipette，30-300 μL，Thermo）加入 175 μL sodium phosphate [143 mM，pH 7.5，
含6.3 mM EDTA 及 0.3 mM NADPH ]，再以 8 爪手動微量分注吸管（finnpipette，
5-50 μL，Labsystems）加入 20 μL 5,5’-Dithiobis（2-nitrobenzoic acid）[DTNB，6 mM，
溶於0.1 M，pH 7.2，含 0.1 mM EDTA 的 sodium phosphate buffer 中]，再加入 20 μL GR（25 unit mL-1，原液為168 units / mg protein，以 143 mM，pH 7.5 之 sodium phosphate buffer 稀釋），立即將 microplate 放入 ELISA microplate reader（ELX808 Ultra Microplate Readers，BioTek Instruments）測定 600 秒內波長在 412 nm 之吸光 值（A412）的變化。標準曲線以10 μL GSH 加蒸餾水配製，再以標準曲線換算出 GSH＋GSSG 之實測含量。GSH＋GSSG 含量之計算為實測含量 × 40（稀釋倍數）
÷ 1000 ÷ 樣品鮮重（g）。GSH＋GSSG 含量之表示法為每克鮮重所含 GSH＋GSSG 之nmol 數（nmol g-1 FW）。
2. GSSG 含量分析
取200 μL 上清液，加入 4 μL 2-vinylpyridine，震盪均勻，於室溫黑暗下反應一 小時。再加入6 μL triethanolamine（Tea，30 mM），震盪均勻，於室溫黑暗下反應 15 分鐘，再以 15,000 g 離心 5 分鐘。取 25 μL 上清液注入 8×12 個樣本槽之 microplate，
後續步驟均與GSH＋GSSG 含量測定相同。標準曲線以 10 μL GSSG 加蒸餾水配製，
再以標準曲線換算出GSSG 之實測含量。GSSG 含量之計算為實測含量 × 40（稀
釋倍數）÷ 1000 ÷ 樣品鮮重（g）。GSSG 含量之表示法為每克鮮重所含 GSSG 之
釋倍數）÷ 1000 ÷ 樣品鮮重（g）。GSSG 含量之表示法為每克鮮重所含 GSSG 之