過去的研究曾指出，在單核球與巨噬細胞中，LPS 對於 TNF-α之生 成是一種強效的誘發劑。而在THP-1 與 PBMCs 中，LPS 皆會誘導非 常顯著的TNF-α生成(Kumar Mangalam, 2002)。若給予 TNF-α的抗體 則會抑制MMP-9 的生成還有 TNF-α mRNA 之表現與 proMMP-9 蛋白 的釋放(Leber, 1998)。而其他學者指出，在 AML 患者中，能偵測到明 顯的TNF-α表現量(Cimino, 1991)。另外於 Ismair et al 實驗中發現，在 acute promyelocytic leukemia (APL) cell line 裡，內生性的 TNF-α能選 擇性的調節 MMP-9 之表現(Ismair, 1998)。由以上的研究顯示 TNF-α 對於MMP-9 蛋白表現之重要性，我們取得實驗之上清液(supernatant) 並使用Human TNF-α ELISA system 來測其 TNF-α之變化。首先，根 據本實驗室所做的結果，在Figure 17 中，未給予 LPS 刺激時(resting)，
以5x105 cells 為單位，便可偵測到些許程度之 TNF-α蛋白表現量(3.72
± 0.30 pg/5x105 cells)，之後分別以 LPS 濃度為 10 ng/ml、50 ng/ml 與 100 ng/ml 所誘發的 TNF-α表現量分別為 9.56 ± 0.88 pg/5x105 cells (10 ng/ml)、14.26 ± 0.79 pg/5x105 cells (50 ng/ml)與 14.46 ± 0.84 pg/5x105 cells (100 ng/ml)，由上述結果顯示，發現以 LPS 濃度為 50 ng/ml 所誘
發出來的 TNF-α表現量已達最高值，故之後之實驗均以此為刺激濃
度。由Figure 18 中可觀察到，同樣無 LPS 刺激下(resting)，以 5x105 cells 為單位，便可偵測到些許程度之 TNF-α蛋白表現量(3.72 ± 0.30 pg/5x105 cells)，隨後以 LPS 50 ng/ml 誘發 TNF-α表現 14.26 ± 0.79 pg/5x105 cells，再以不同濃度之 haloperidol (0.5, 2, 10, 20 μM)處理後，
發現均有意義地使TNF-α之蛋白表現量上升，分別為 0.5 μM，20.04 ± 0.59 pg/5x105 cells；2 μM，21.34 ± 0.81 pg/5x105 cells；10 μM，25.05 ± 0.47 pg/5x105 cells；20 μM，22.49 ± 1.35 pg/5x105 cells。根據以上結果 顯示，haloperidol 的藥物作用並不是因為影響內生性 TNF-α的表現而 對MMP-9 蛋白產生抑制。
Discussion
無 論 在 癌 症 或 中 樞 發 炎 疾 病 中 ， 基 質 金 屬 蛋 白 酵 素(matrix metalloproteinases，MMPs)扮演著極為重要的角色。人類癌症的進程中，
不 僅 癌 細 胞 本 身 可 釋 出MMPs 之 外 ， 腫 瘤 周 圍 的 基 質 細 胞 (stromal cells)，包括內皮細胞(endothelial cells)、纖維母細胞(fibroblasts)、肌纖維 母細胞(myofibroblasts)、發炎細胞(inflammatory cells)也會釋放MMPs (Klein et al., 2004)。在中樞神經系統方面(CNS)，所有的中樞神經細胞，
如：神經元(neurons)與神經膠質細胞(glia)皆可產生MMPs (Yong et al.,
1998)，而異常之活化MMPs可分解基底層(basal lamina)的主成份，導致 血腦障壁(blood-brain barrier，BBB)的破壞，促使神經發炎產生許多中樞 神經性發炎疾病(如：多發性硬化症、阿茲海默症與惡性神經膠質瘤等) (Rosenberg et al., 1992; Anthony et al., 1998; Asahi et al., 2001)。而其中 MMP-9與神經退化的過程息息相關，原因是因為會導致神經的髓鞘脫落 (demyelination) (Gijbels et al., 1993)引起多發性硬化症之疾病。另外，在 急性白血病患者之病理發展過程中發現與MMP-9的關係最為密切。所以 MMP-9無論在神經發炎性疾病或白血病當中所扮演之角色需要被更加 重視。
MMP-9(屬於type IV collagenase，又稱為gelatin B，分子量為92 kD) 可 在 許 多 種 類 的 單 核 球 細 胞 中 被 發 現 ， 包 括 ： 周 邊 血 液 的 單 核 球 (peripheral blood monocytes)、組織中的巨噬細胞(microphages)、Kupffer cells與蝕骨細胞(osteoclasts)等皆可發現MMP-9的表現(Welgus et al., 1990; Masure et al., 1993; Winwood et al., 1995; Swallow et al., 1996)。另外 在一些leukemic cell lines中，包括：HL-60、NB4、U-937及THP-1也可釋 放MMP-9酵素(Ries et al., 1994; Ismair et al., 1998; Saarialho Kere et al., 1993; Van et al., 1991)。在一般正常生理中，成熟白血球(leukocytes)本身 就可以分泌MMP-9，利用MMP-9分解基質的能力，使白血球能從血液離 開而滲入周邊組織發炎處來發揮它們的免疫功能(Doherty et al., 1994;
Welgus et al., 1990; Leppert et al., 1995; Weiss et al., 1986)。另外，單核球 細胞若受到一些細胞激素(如：TNF-α、IL-1β、CSFs或IL-3)或細菌內毒 素(LPS)刺激時，便會使MMPs表現。有文獻指出，單核球(monocytes)若 是受到細胞激素TNF-α或IL-1β的刺激，便會誘發MMP-9的表現而不是 MMP-1 (Saren et al., 1996)。在單核球的細胞株裡，MMP-9的分泌與基因
轉錄的程度有關且可被一些細胞激素(如：TNF-α透過TNFR1)來促進調節 製造(Ries and Petrides, 1995; Ismair et al., 1998)。另外，LPS則會誘發顯 著的MMP-1與MMP-9表現(Lai et al., 2003)及許多有關發炎的細胞激素 (cytokines) (Yong et al., 1998)。而在一些神經退化性疾病中(如：阿茲海 默症與帕金森氏症)發現有些細胞激素的表現比較活躍，其中包括：
TNF-α、IL-1及TGF-β (Akiyama et al., 2000; Nagatsu et al., 2000)，而其 中，TNF-α被認為是誘發發炎的強效細胞激素(Munoz-Fernandez et al., 1998)。
而本實驗所用的實驗細胞為THP-1細胞，是從白血病(leukemia)患者 所取得的單核球(monocytes)加以分離培養而得，有些特性則與單核吞噬 細胞(mononuclear phagocytes)很相似(Combs et al., 1999; Hsu et al., 1996;
Giulian et al., 1990; Prieto et al., 1994; Tsuchiya et al., 1982; Yates et al., 2000)，且可對於一些細胞激素(如：IL-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12與 TNF-α)產生反應(Murthy et al., 2000; Szczepanik et al., 2001; Yates et al., 2000)。而許多文獻指出，在所有的神經退化性疾病中(如：阿茲海默症 及帕金森氏症等)，與microglia細胞的活化有關(Chen., 2003; Liu et al., 2003; Nakamura, 2002; Akiyama et al., 2000)，另外根據此篇學者所做出的 實 驗 中 發 現 ， THP-1 細 胞 可 模 擬 中 樞 神 經 內 的 microglia 細 胞 (microglia-like human THP-1 cells) (Klegeris et al., 2005)，所以本實驗使用 THP-1 cell lines來當作我們的實驗細胞，加入不同濃度的中樞神經用藥 haloperidol (0.5~20 μM)且加入刺激劑TNF-α (10 ng/ml)誘發MMP-9表 現，觀察藥物是否對MMP-9的活性產生影響，進而探究其中的藥理機制。
由電泳酵素分析法(gelatin zymography)之實驗結果證實，在THP-1細 胞中，haloperidol能抑制以TNF-α所誘發的MMP-9的活性表現且達到統
計上的意義，其抑制50%反應之濃度(IC50)分別為5.4 ± 0.3 μM；由此實驗 結 果 得 知 ， 在THP-1 細 胞 中 TNF-α 所 誘 發 的 MMP-9 活 性 皆 能 隨 著 haloperidol的藥物濃度升高而使得MMP-9活性表現量減少，呈現濃度效 應(concentration-dependent)之抑制作用。接下來，為了證明haloperidol 在THP-1細胞中抑制MMP-9的活性表現，並不是因為引起細胞毒性而使 細胞減少所產生的結果，所以我們利用了MTT assay得知haloperidol在濃 度40 μM以上存活率就已低於60%。故本實驗所使用的haloperidol藥物濃 度範圍內(0.5~20 μM)，細胞存活率不會有明顯減少之情形(Figure 18)，
表示本實驗所使用之藥物濃度範圍並不會明顯造成細胞毒性。另外，為 了瞭解haloperidol是否會直接影響MMP-9本身的酵素活性表現，由實驗 結果觀察到，haloperidol對於MMP-9的酵素活性不會產生影響。
由Western blot實驗方法得知，在THP-1細胞中，haloperidol可明顯且 有 意 義 地 抑 制 以TNF-α 所 誘 發 產 生 的 MMP-9 蛋 白 表 現 ， 且 隨 著 haloperidol之藥物濃度增加而逐漸減少MMP-9蛋白的表現，並且皆呈現 濃度效應(concentration-dependent)的抑制作用。發現藥物在較低濃度(0.5, 2 μM)時就可以有效地壓制MMP-9的蛋白表現，且於濃度20 μM壓制情形 更顯著。另一方面，於正常生理情況下，體內MMPs活化需獲得平衡調 節，故體內含有內生性抑制成份TIMP-1 (28.5 kD glycoprotein)。此蛋白 成分可被許多種類的細胞(包括：纖維母細胞、內皮細胞、單核球細胞或 巨噬細胞)所分泌，且可與MMP-9蛋白以1：1的方式形成複合物進而抑 制MMP-9的蛋白表現(Goldberg et al., 1992)。但在某些疾病上，特別是擁 有血液異常之患者或患有多發性硬化症之病人的腦脊髓液中皆可發現 TIMP-1之數值明顯增高(Murate et al., 1997; Őzenci et al., 1999)，而本實 驗所用的細胞株(THP-1 cells)為罹患白血症之病人身上分離而得的單核
球 細 胞 ， 利 用TNF-α 刺 激 劑 可 誘 發 TIMP-1 蛋 白 表 現 (Figure 25) ， haloperidol於較低濃度(0.5 μM)時就可抑制由TNF-α所引發的TIMP-1蛋 白表現，當haloperidol到較高濃度時(20 μM)即可有意義地壓抑TIMP-1的 蛋白表現，顯示haloperidol對於不正常生理情況下所產生的調節成分 (如：MMP-9與TIMP-1)可能可以壓制其表現，對於某些疾病似乎可以提 供一個不錯的治療方針。接下來，我們推測haloperidol可能抑制的機轉 在MMPs蛋白質轉譯(translation)之上游部分(upstream)。
一般而言，基因訊息DNA會經由特定轉錄(transcription)解碼而形成 mRNA，之後mRNA再經由轉譯(translation)製造出特定蛋白質。故我們 利用RT-PCR之實驗方法觀察haloperidol是否可以抑制MMP-9 mRNA的 產生。由實驗結果發現haloperidol確實隨著濃度升高而可以抑制MMP-9 的mRNA表現(Figure 24)且藥物濃度於10 μM以上則可以有意義地壓制 MMP-9之mRNA表現。然而，對於藥物是否會影響已轉錄後之mRNA穩 定性(mRNA stability)，仍需進一步研究探討。因此再更深一層地探討 MMP-9基因轉錄過程的上游所受到相關之影響。
在不同細胞株裡，MMP-9的表現似乎可被許多不同的訊息傳遞路徑 或轉錄因子所調節 ，如：Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathway、Nuclear factor-κB (NF-κB) pathway (Moon et al., 2004; Bond et al., 1998)、轉錄調節因子(NF-κB與AP-1) (Sato and Seiki, 1993; Gum et al., 1996)。而TNF-α可以刺激單核球和巨噬細胞產生及釋放大量的MMPs，
其主要的路徑就是活化NF-κB (Sarén et al., 1996; Ismair et al, 1998; Li and Verma, 2002)。在神經系統內的神經膠原細胞中，NF-κB可被許多種 物質所活化，其中包括：neurotrophic factors、cytokines與neurotransmitters 而大量表現(Bhakar et al., 2002; O’Neill and Kaltschmidt, 1997; Yalcin et
al., 2003; Carter et al., 1996; Guerrini et al., 1995; Hamanoue et al., 1999;
Kaltschmidt et al., 1995)。另外，若活化NF-κB則可能造成神經死亡(Pizzi et al., 2002; Shou et al., 2002)，導致神經退化失調與發炎現象產生(Bhakar et al., 2002; Blondeau et al., 2001; Fridmacher et al., 2003; Mattson et al., 2000)。在許多文獻顯示，轉錄因子NF-κB與癌症之形成有緊密的相互關 係(Sun et al., 2003; Suh and Rabson, 2004)。而NF-κB的活化主要機轉是將 NF-κB 的 抑 制 型 蛋 白 IκB-α 磷 酸 化 後 分 解 掉 ， 促 使 NF-κB 由 核 外 translocate至核內活化，啟動各種基因表現，進而造成許多發炎性相關因 子產生(包括：MMPs與cytokines) (Li and Verma, 2002; Panwalkar et al., 2004)。故本實驗便針對NF-κB之路徑進行探討。首先，利用Western blot 之實驗方法觀察NF-κB的抑制型蛋白IκB-α之表現情形，探討haloperidol 是否經由抑制IκB-α的降解作用而降低MMP-9蛋白之表現，並藉此瞭解 haloperidol在IκB-α磷酸化的分解作用與在NF-κB的訊息傳遞路徑上所扮 演的角色。由Western blot分析結果顯示，TNF-α作用15分鐘後可明顯地 引發THP-1細胞內IκB-α之降解反應，隨著時間的增加則會漸漸地回復到 基準值。當投予不同濃度之藥物haloperidol後，在Figure 26中可發現隨著 haloperidol的濃度增高(0.5~10 μM)，以TNF-α刺激的IκB-α蛋白降解表現 量會逐漸回升，在較低濃度時(0.5, 2 μM)抑制IκB-α降解情況差不多，但 在haloperidol濃度為10 μM時抑制IκB-α降解程度較濃度為20 μM的效果 好，不過濃度20 μM時還是可以減少其降解程度，顯示haloperidol可以抑 制由TNF-α刺激所導致的IκB-α之降解作用。因此，我們推測haloperidol 可能主要是經由抑制IκB-α的降解作用，而減少由TNF-α刺激所引發的游 離態NF-κB進入細胞核與MMP-9之promoter序列結合，使得MMP-9的基 因表現減少。有文獻指出，必需磷酸化抑制型蛋白IκB-α才能使得NF-κB
活化，其中扮演著磷酸化IκB-α之上游酵素為IKK complex (Yamaoka et al., 1998; Zandi et al., 1997)，其直接作用(磷酸化)在IκB-α之Ser 32與Ser 36位置上(DiDonato et al., 1997; Lee et al., 1997; Mercurio et al., 1997;
Zandi et al., 1997; Zandi and Karin, 1999)。然而haloperidol是否作用於 IκB-α之上游酵素(如：IKK)則仍需進一步探討。
根據上述的實驗結果推論 haloperidol 可能是經由抑制 IκB-α蛋白之降 解 作 用 而 達 到 抑 制 TNF-α刺激所誘發的 MMP-9 表現。為了確認 haloperidol 對 THP-1 細胞以 TNF-α誘發釋放 MMP-9 蛋白表現的過程
中，其 NF-κB 進入細胞核內的表現情形。因此，我們萃取細胞核內的蛋
白質並利用Western blot 觀察 NF-κB (p65)在細胞核內外的表現。TNF-α 刺激 30 分鐘之後，細胞質中的 p65 表現量會降低，細胞核內 p65 所表 現的量會明顯的增加，表示 p65 由細胞質 translocate 至細胞核內。當投
白質並利用Western blot 觀察 NF-κB (p65)在細胞核內外的表現。TNF-α 刺激 30 分鐘之後，細胞質中的 p65 表現量會降低，細胞核內 p65 所表 現的量會明顯的增加，表示 p65 由細胞質 translocate 至細胞核內。當投