一、 探討 ox-LDL 對於活化小膠質細胞株 BV-2 細胞誘導 NO 合成之影響
本實驗首先是要探討ox-LDL 是否能活化 BV-2 細胞並產生相關發 炎介質(如一氧化氮；nitric oxide, NO)。實驗所使用的 ox-LDL 主要為 銅氧化之ox-LDL (其條件以 5 μM Cu2+在37℃下處理 24 小時)。為了 進一步了解ox-LDL 的氧化程度，利用 LPO assay 對各次所分出的 LDL 與ox-LDL 進行測定，由 Fig. 1 顯示，ox-LDL 較 LDL 的氧化程度的 確有意義明顯的增加，且統計上具顯著的差異性(LDL：3.9 ± 1.7 nmole 與ox-LDL：12.7 ± 2.0 nmole)。隨後分別以不同濃度的 ox-LDL (50 及 100 μg/ml) 處理 BV-2 細胞並培養 24 小時，取細胞上清液部分來進行 實驗，由Fig. 2 顯示，在未加刺激劑的情形下(Resting)，其上清液只 偵測到濃度為(12.3 ± 0.8 μM)的 nitrite 累積量。而以 ox-LDL (50 及 100 μg/ml)刺激 24 小時後，發現其上清液中 nitrite 累積量皆有增加，雖然 只有ox-LDL (50 μg/ml)的刺激量在統計上有顯著的差異性，但從數據 上仍可大致看出皆有高於Resting 的趨勢(50 μg/ml：16.6 ± 1.2 μM 與 100 μg/ml：16.6 ± 3.6 μM)。另一方面 LPS (100 ng/ml)作為正向對照 組，的確也能明顯刺激nitrite 累積量之生成(22.0 ± 2.1 μM)。由以上 結果得知，ox-LDL 無論在 50 及 100 μg/ml 兩個濃度上皆可活化 BV-2 細胞，並且會明顯誘發NO 的產生。
二、 探討 ox-LDL 對於 BV-2 細胞的細胞存活率之影響
本實驗利用MMT assay 測定 ox-LDL 對於細胞存活率之影響。由
實驗結果發現，雖然 ox-LDL 分別在濃度為 50 及 100 μg/ml 的刺激 下，細胞存活率皆具有統計意義的下降，但整體而言其細胞存活率皆 可維持在約70%(ox-LDL, 50 μg/ml：78.5 ± 1.8%及 100 μg/ml：68.8 ± 6.8%, n = 3)，即 ox-LDL 並不會嚴重影響細胞的存活。因此，本實驗 所使用之 ox-LDL 濃度範圍內對細胞皆不具嚴重毒性反應。另一方 面，LPS (100 ng/ml)對於細胞存活率的影響則不具統計上的差異(98.3
± 1.8%, n = 4)(Fig. 3)。
三、 探討 ox-LDL 及 A 型清除接受體制效劑(Fucoidan)對於 活化 BV-2 細胞誘導 iNOS 產生之影響
由之前的實驗結果已證實ox-LDL 的確能誘導 BV-2 細胞增加 NO 的產生，為了瞭解ox-LDL 對 NO 的促進作用是否藉由增加其細胞內 iNOS 的蛋白質表現，我們利用西方點墨法(Western blot)以分析 ox-LDL 對細胞內 iNOS 蛋白質表現的影響。
將BV-2 細胞(2 × 105 cell/ml)處理並培養 24 小時後，取其細胞內 萃取物(cell lysate)進行實驗，由 Fig. 4A 顯示，在未加刺激劑的情形 下(Resting)，其細胞萃取物只偵測到非常微量的 130 kD 之 iNOS 蛋白 表現量(Resting，1.0 ± 0.0 fold)。而以 ox-LDL (50 及 100 μg/ml)刺激 24 小時後，發現其細胞萃取物中 iNOS 蛋白表現量有顯著的增加(Fig.
4A)，並且隨著 ox-LDL 濃度的增加，iNOS 的蛋白表現量也逐漸提高，
且統計上有顯著的差異性(ox-LDL, 50 μg/ml：1.6 ± 0.2 folds 及 100 μg/ml：2.1 ± 0.2 folds, n = 3-6；Fig. 4B)。另一方面利用 LPS (100 ng/ml) 作為正向對照組，的確也能明顯刺激iNOS 之生成(3.8 ± 0.5 folds, n = 6；Fig. 4A and B)。而在 fucoidan (100 μg/ml)的刺激方面，觀察到其
細胞萃取物中iNOS 蛋白表現量並沒有顯著的增加，即代表與未刺激 組(Resting)沒有太大差異(1.0 ± 0.2 folds, n = 3；Fig. 4A and B)。我們 也發現，即使fucoidan 的濃度高達 200 μg/ml 時，細胞萃取物中 iNOS 蛋白表現量仍沒有顯著的增加(1.0 ± 0.2 folds, n=3)(data not shown)。
代表fucoidan 對於 BV-2 細胞的確無法刺激其 iNOS 的蛋白表現。
四、 探討特定訊息路徑抑制劑對於 ox-LDL 活化 BV-2 細胞 誘導 iNOS 產生之影響
由以上結果得知，ox-LDL 可以活化 BV-2 細胞增加 NO 及 iNOS 的表 現。為了進一步了解其中的刺激機制，我們使用了多種訊息抑制劑，
包括有phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor (LY 294002)、MAP kinase kinase (MEK) inhibitor (PD 98059)、p38 MAPK inhibitor (SB 203580) 及JNK inhibitor (SP 600125)，進而觀察 ox-LDL 誘發 iNOS 表現的訊 息傳遞路徑。由Fig. 5A and B 顯示，以 ox-LDL 處理後可誘發 iNOS 達8.6± 0.7 folds (n = 3)。然而各抑制劑如 LY (5 μM)、PD (5 μM)及 SP (1 μM)對於 ox-LDL 所誘發的 iNOS 表現並無明顯的影響(LY：6.7 ± 0.7 folds；PD：9.7 ± 0.1 folds 與 SP：9.0 ± 0.5 folds)。但是 SB (5 μM) 卻能明顯的抑制ox-LDL 所誘發的 iNOS 表現(3.6 ± 0.3 folds, n = 3)。
於是初步推論 ox-LDL 可能是藉由 p38 之 Mitogen-activated protein kinase (MAPKs)的訊息傳遞路徑來以增加 iNOS 在 BV-2 細胞中的表 現。
五、 探討各訊息路徑抑制劑對於 BV-2 細胞的細胞存活率之
影響
本實驗利用MMT assay 來測定對於細胞存活率之影響。由 Fig. 6 實驗結果發現，在ox-LDL 100 μg/ml 的刺激下，會稍微降低細胞存活 率(80.5 ± 2.9%)，但不會過於嚴重，而分別加入了 LY 294002 (5 μM)、
SP 600125 (5 μM)、SB 203580 (5 μM)及 PD 98059 (1 μM)後，細胞存 活率反而有些微的上升(LY：92.7 ± 3.7%；PD：95.3 ± 2.6%；SB：94.3
± 3.7%及 SP：94.3 ± 2.0%)。