本研究是經由實驗室培養小球藻萃取純化胞內與胞外多醣體，進 行苯酚硫酸法測定多醣體含量及以Aniline blue 螢光染色法檢測 1,3-β -D-glucan 測定，再進行其功能評估，包括抗氧化能力測定、保濕能 力測定、抗菌能力測定、抗老化能力測定、抗發炎能力測定。
表九、實驗藥品表
15 ABTS 2,2-azinobis-(3-ethylbenzoth iazoline-6-sulfonic acid ammonium salt)
C18H24N6O6S4 20 鹽酸 12N、1N Hydrochloric acid HCl Ried-deHaën 21 硫代巴比妥酸 Thiobarbituric acid C4H4N2O2S Merck 22 甘油 Glycerin 99% C3H8O3 Ried-deHaën 23 玻尿酸 Hyaluronic acid 科友
24 5-脂氧合酶 5-Liopxygenase Sigma 25 亞麻油酸 Lionleic acid 95% C H O Sigma
26 Tris base Tris(Hydroxymethyl)
aminomethane C4H11NO3 J.T.Baker
27 甜沒藥 Alpha-bisabolol 香林 40 Bisacryamide N,N’-methylenebisacrylamid
e
CH2(NHCOCH:C
H2)2 J.T.Baker
實驗儀器與設備：
1. 藻類培養玻璃管：三美玻璃儀器行
2. 高壓滅菌鍋（Autoclave）：TOMIN TM-327 3. 高速離心機：Hitachi CF 15 R
4. 減壓濃縮：泛群科技有限公司
5. 透析膜：15 cm × 1.9cm Cellu Sep T1, Nominal MWCO: 3500 6. 真空冷凍乾燥機（Freeze Dryer）：Kingmech
7. －80℃冰箱：Ultralow Freezer NU-6511 8. 倒立式顯微鏡：Nilon COOLPLX 990
9. 紫外線/可見光分光光譜儀：Hitachi U-2001 spectrophotometer 10. 螢光光度計：SHIMADZU RF-1501 spectrofluorophotometer 11. ELISA Reader：Multiskan EX 酵素免疫分析儀
12. 超音波震盪器：ULTRASONC CLEANER DC400H 13. 水浴槽：YIH DER WATER BATH
14. 三合一膚質分析儀：Corneometer CM825/Sebumeter Sm810/Skin-pH-meter pH900
15. 無菌操作台：HIGH TEN CLEAN BENCH
16. 恆溫培養箱：YIH DER（TEMP ORBITAL SHKER INCOBATOR）
17. 圓型濾紙片：Toyo Roshi Kaishi, Ltd，直徑 8mm
19. 酸鹼測定儀（pH Meter）：SUNTEX PH/mV/TEMP METER SP-701
20. 磁石加熱攪拌器：IKA RH digital KI/C
21. 去離子水製造機：Millipore Milli-Q Biocel 超純水 22. 震盪器：FINE RTEX
23. 電子天平：Precisa X4250C 24. 蛋白質電泳：Biosciences 25. 0.22μm Minipore：Sartorius 26. 96 well plate：Costor
3-1 藻類的培養與觀察
3-1-1 實驗藻體：
本實驗所使用的小球藻（Chlorella pyrenoidosa 211-8b）培養基之 配方（附錄表一），先於配置完成後於高壓滅菌鍋中（121℃、1.2kg/
cm2）下滅菌20分鐘並冷卻後備用。 3-1-2 小球藻之培養：
培養的玻璃管經高壓滅菌鍋滅菌20 分鐘，並冷卻後，加入 3 0 0
~ 4 0 0 mL的培養液以接種環自斜面培養上取適量藻體接種，進行預 培養；於 32℃、日夜循環照光 14 小時；黑暗 10 小時，再接上空氣 與CO2 （0.5 L/min）以 1：1 的比例混合下培養至深綠色後，以 7000 rpm、4℃離心 10 分鐘去除上清液，收集藻體進行冷凍乾燥後，儲存 於－20℃的冰箱中備用。
3-2 小球藻多醣體的萃取：
3-2-1 胞內多醣萃取：
實驗方法參考Shi et al., 等人60, 61，首先秤取10 公克冷凍乾燥的 藻體再加上 0.45μm的玻璃粉研磨（藻體：玻璃粉＝1：6）混合均勻 打破細胞壁。在高壓滅菌鍋中以 300 mL的去離子水萃取 20 分鐘
（121℃、1.2kg/cm2）。上述步驟重覆三次。冷卻後，將液體置於離心 管轉速設定7000 rpm離心 10 分鐘、4℃，移除大多數的藻體及雜質。
取上清液先減壓濃縮，將這些小球藻水溶液萃取物加入 10 mL的 10%
三氯醋酸（trichloroacetic acid；TCA）於 30 mL離心管中，置於 4℃
冰箱，1 小時後，再將其以超高速離心機，轉速 12000 rpm，離心 15 分 鐘，以去除大部份蛋白質顆粒。取上清液，注入透析膜內，置於含有 3 公升的去離子水的燒杯中，在 4℃下透析 24 小時。取上清液加入絕 對酒精（上清液：絕對酒精 1：3.5 比例）於－20℃沉澱一天，，以 12000rpm、4℃、離心 20 分鐘。最後將沉澱的多醣置於－80℃冰箱一 晚，再放置到冷凍乾燥機，最後以獲得胞內多醣體粉末，儲存於－20℃
冰箱備用。
3-2-2 胞外多醣的萃取：
本方法参考2004 年文獻35，取已經離心過後藻類培養液（上清液）
600 mL，經減壓繷縮縮小體積加入 95%的乙醇（上清液：95％乙醇 1：
3 比例）在－20℃沉澱一天，離心 12000rpm、4℃、30 分鐘，最後將 沉澱的多醣置於－80℃冰箱一液，再放置到冷凍乾燥機，最後 獲得多醣體粉末，儲存於－20℃冰箱備用。
3-2-3 小球藻外部型態的觀察：
使 用 倒 立 式 顯 微 鏡 裝 置 有 數 位 相 機 的 顯 微 鏡 觀 察 小 球 藻 加 0.45μm 玻璃粉處理前後的改變，觀察是否有效打破藻體細胞壁，並 照像紀錄之。
3-3 總多醣體含量之測定（粗多醣分析）：
多醣體濃度的測定是使用苯酚硫酸法（phenol-sulfuric acid）62,
63。當醣類經硫酸的劇烈反應裂解為單醣，結構式上的羥基與酚結合 反應，會產生橘黃色的產物，因此可用比色法（吸光值）檢測其多醣 濃度。
首先配置已知濃度葡萄糖標準濃度：0、0.025、0.05、0.075、0.1、
0.125 mg/mL。之後，各取 0.6 mL 不同濃度的葡萄糖標準溶液到試管 中，再分別加入0.3 mL 的 5% 酚，再立刻快速沖入 1.5 mL 濃硫酸，
將這些液體靜置30 分鐘，待反應完全，顏色呈現穩定的橘黃色液體，
再以紫外線/可見光分光光度計於 490 nm 波長測其吸光值，製作成標 準檢量線。同樣地，將萃取的小球藻樣品多醣體粉末加適量水回溶，
以相同方法測其吸光值，對照標準品溶液之線性迴歸公式，以推算其 樣品醣類濃度。
計算公式如下：樣品濃度乘稀釋倍數 檢量線：y＝ax＋b
a：檢量線斜率 、b：檢量線截距、 x：樣品濃度、y＝吸光值（490 nm）
3-4 Aniline Blue 螢光染色法檢測 β-D-(1→3)-glucan 分析
在此分析方法前須先將三股結構多醣解聚成單股結構再分析之，
而解聚的方法便是利用強鹼（NaOH）將多醣解聚成單股多醣15。測 定多醣體單股之結構以aniline-blue（圖八）中所含sodium-carbonylbis [4-((phenyleneamino)benzeuesulfonate)]與之β-D-(1→3)-glucan single-helix之氫鍵鍵具有專一性作用64，當aniline blue結合後產生螢光 基團物（fluorodhro）而將sirofluor fluoresce（圖九） 增加140倍，因 此可利用螢光光度計在Ex＝395nm激發後測在EM＝495nm測其吸收 值，因此可用來定量小球藻多醣。本方法除了可作小球藻多醣體之定 性外，還可作為定量小球藻多醣體濃度之用途。
本方法參考1997 Shedletzky；2004 Ko等人65, 66，標準曲線的建立，
取1.25mg的標準品laminarin溶於3mL 0.3N的NaOH中攪拌30分鐘完全 溶解，再加入1N HCl調整pH至11.5的50mM Na2HPO4--NaOH緩衝液
（含0.5 M NaCl）定容至10mL；再稀釋不同濃度的標準品（50、40、
30、20、10 μg/mL）。每個濃度各取3mL，加入0.2mL濃度為1mg/mL 的aniline blue試劑。混合均勻後避光靜置2小時；以螢光分光光度計 檢測（激發波長395 nm；放射波長495 nm）製作成迴歸曲線。樣品檢 測同樣地將樣品溶於3mL 0.3N的NaOH中，攪拌30分鐘完全水合溶 解，再加入1N HCl調整pH至11.5的50mM Na HPO - NaOH緩衝液（含
0.5 M NaCl）定容至10mL，取3mL，加入0.2mL濃度1mg/mL的aniline blue試劑。混合均勻後靜置2小時，進行螢光強度的檢測；對照標準 溶液之迴歸曲線公式，以推算β-D-(1→3)-glucan濃度。
圖八、Aniline blue 主要成分結構
3-5 抗氧化能力測定
3-5-1 清除α,α- diphenyl-β-picrylhydrazy自由基（DPPH）能力測定：
脂質在自氧化的過程中會產生自由基而導致脂質酸敗，且在增值 期會形成過氧化自由基與氫過氧化物。當自由基相互結合時，連鎖反 應即終止。常見的抗氧化物藉由提供氫（hydrogen doner）來清除脂 質過氧化物自由基（peroxyl radical），進而達到抑制氧化鏈鎖反應之 進行。抗氧化的研究上，常使用DPPH來評估抗氧化物的供氫能力。
DPPH之Methanol 溶液在517nm 下有較強的吸光值（深紫色），被 抗氧化物還原時吸光值會降低，吸光值愈低（淡黃色），表示抗氧化 物的供氫能力愈強。因此判斷樣品捕捉DPPH自由基之能力67（圖十）。
DPPH
․＋ AH → DPPH-H ＋ A
․（purple color） （yellow color）
圖十、抗氧化物藉由提供氫(hydrogen doner)能力來清除DPPH自由基68
本實驗參考2005年Liu等人69首先定量瓶中加入0.3943g DPPH
（MW=394.3），配置成10 mM DPPH之Methanol 溶液100 mL。再稀 釋成1mM溶液。在96well微量平盤中加不同濃度試驗樣品水溶液，不 足以水或甲醇代替，之後迅速加入80μL新鮮配置之1 mM DPPH 之 Methanol 溶液，使最後總體積為200μL，另外震盪混合均勻，並室 溫避光下靜置30分鐘。使用ELISA Reader檢測540nm之吸光值，吸 光值愈低表示樣品清除DPPH 自由基之能力強。計算公式如下：
※計算清除率（scavenging effects）=[1－(樣品反應後於540 nm 吸光 值/控制組於540 nm 吸光值)]×100％。為了避免誤差，樣品反應後之 吸光值再扣掉樣品反應前之吸光值。
3-5-2 Trolox當量的總抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant
capacity，TEAC）測定：
ABTS（2,2-Azino-bis-﹝3-ethylbenthiazoline sulfonic acid﹞）與 peroxidase（metmyogloloin）、H2O2反應，會產生ABTS•+陽離子自由 基。此為一相當穩定藍綠色物質，抗氧化劑的加入會抑制此顏色的產 生，因此吸光值愈低，抗氧化效果愈佳。
本實驗依據配置濃度Peroxidase 44unit/mL、H2O2 500μM、ABTS 1000μM、標準品Trolox（水溶性維生E）10mg/mL。Peroxidase、H2O2 、
後產生安定藍綠色之ABTS•+陽離子自由基。準備一個96well微量平 盤，加入不同濃度的trolox樣品20μL，再加入180μL的ABTS•+總體積 為200μL，以ELISA Reader檢測620nm之吸收值，做成trolox之檢量 線，胞內與胞外多醣體樣品的檢測同上，測得後再由trolox的檢量線，
換算其相當的濃度（mM）。TEAC愈高，代表化合物的抗氧化性愈 高。
3-5-3 脂質過氧化能力測定（Lipid peroxidation inhibitory activity）：
Liposome 系統之抗氧化試驗（Phospholipid）
多 元 不 飽 和 脂 肪 酸 可 被 F e C l3氧 化 而 產 生 氧 化 脂 質 （l i p i d peroxide）。Lipid peroxide 於加熱狀態下可被分解產生丙二醛
（malondialdehyde；MDA）過氧化脂質代謝產物。MDA在高溫下可 與thiobarbituric acid（TBA）試劑反應，形成紅色MDA—TBA 化合 物。此化學合物可在535nm可見光下測定吸光度，此吸光度的強度與 過氧化脂質的量成正比。
本實驗參考前人作法70首先配置Lecithin溶於30mL Na2HPO4－
NaH2PO4 緩衝液（10mM pH7.4），於超音波震盪器，冰浴震盪成均 勻懸浮液時間約為120～150分鐘（實驗前一天製備為佳）。TCA－TBA
－HCl reagent以15% w/v三氯醋酸、0.375% w/v 2-硫代巴比妥酸
至100 mL。之後取0.5mL Liposome（10 mg/mL）、0.5mL 400μm FeCl3、 0.5mL 400μm Ascorbic acid和0.5 mL不同濃度的樣品到試管中（扣除 樣品本身顏色造成之干擾，不加Liposome以buffer替代，其他相同），
trolox作為對照組，控制組則不添加任何樣品。震盪均勻放入37℃培 養箱中培養1小時。取出震盪均勻後，才可再加入1mL TCA－TBA－
HCl reagent。置於水浴槽（Water Bath）中煮沸15分鐘，直到澄清為 紅（TBA加熱至呈紅色）。冷卻，離心2000 rpm、10分鍾，沉澱蛋白 質，取上清液測定535 nm之吸收值。每一實驗組至少做三重複。計算 公式如下：
※計算抑制率（Inhibitory rate）=[1－(樣品反應後於 535nm 吸光值/
控制組於535 nm 吸光值)]×100％。
3-6 保濕能力測定
利用導電度來測試皮膚的保濕能力，皮膚的含水量越高其導電度 越高，反之其導電度越差。本實驗參考前人方法14, 42, 43找來五位年齡 22～30 歲女性受試者，測試前 20 分鐘以清水清洗，避免油脂及其他 物質干擾。預先配置 1%的玻尿酸（Hyaluronic acid，HA）、1%甘油
（Glycerin）、Water及胞內與胞外多醣體，再將測試樣品 30μL塗抹於 5 cm2 的前手臂上測試，之後使用CM825 三合一膚質分析儀（圖十一）
作 評 估 皮 膚 保 濕 能 力 ， 並 且 測 量 0 分 鐘 （ 剛 塗 抹 ） 及 塗 抹 後 20 分鐘作測量。計算保濕能力公式如下：
※Skin Moisturizing Rate（％）＝（塗抹後皮膚導電度－未塗抹前皮
※Skin Moisturizing Rate（％）＝（塗抹後皮膚導電度－未塗抹前皮