4-1 小球藻多醣體的萃取與多醣含量測定
在萃取過程中將其小球藻細胞壁打破加入0.45μm的玻璃粉在研 缽中研磨達到破壁的效果來萃取胞內的多醣體，（圖十三 A）是未 處理玻璃粉的小球藻，外觀呈現綠色圓形或橢圓形；（圖十三 B）
是加入0.45μm的玻璃粉處理過後的小球藻，呈現破碎不規則的狀態，
之後在進行萃取。本實驗經由熱水萃取所得到的胞內多醣體及胞外酒 精沉澱的多醣體，將這些萃取胞內、胞外多醣體經苯酚硫酸法呈色，
顯示出橘黃色的呈色現象（圖十四）。最後，再依標準品所測得的吸 光值之線性標準曲線當做檢量線換算作為多醣體之定量方式（圖十 五）。以10公克冷凍乾燥過的藻體萃取胞內多醣體含量為1.398mg/g，
另 外 收 集6 0 0 m L 藻 類 培 養 液 用 酒 精 沉 澱 的 胞 外 多 醣 含 量 為 0.522mg/mL（表十一）。
由文獻指出每100公克綠藻約中含有15公克的碳水化合物，而一 些多醣體存在於細胞壁中，在乾重細胞中佔13.6％，其細胞壁厚度大 概有210Å，直徑是3-4μ77。由此可知小球藻細胞壁佔有很大部份，因 此必須打破其細胞壁才能有效萃取出藻體胞內的多醣體，所以本實驗 選擇加入0.45μm 的玻璃粉與小球藻混合研磨打破細胞壁來處理藻 體，再利用熱水萃取所得之胞內多醣體，而胞外多醣通常附著於細胞
表面或者分泌到胞外的培養基中，多醣體經由藻體離心過後的培養液 以95％乙醇沉澱所取得，再利用苯酚硫酸法62測量，其原理是根據醣 分子在酸性環境下（見附錄圖一），其結構式上的羥基與酚會有橘黃 色的呈色反應78，由於小球藻多醣體組成成分的分子量在未知之情況 下，因此本實驗採用中性醣類－葡萄糖作為硫酸酚法的標準品，作一 檢量線推測多醣的含量。
（A）
（B）
圖十三、萃取小球藻胞內多醣體的照片：（A）未處理；（B）小球藻 加0.45μm 玻璃粉處理
圖十四：苯酚硫酸法測定小球藻多醣體之含量其呈色現象。
圖十五：利用苯酚硫酸法所測之不同葡萄糖濃度的吸光值（波長490 nm）。迴歸線公式為y=0.0137x+0.1676，R2=0.99。呈正相關之關係
表十一：綠藻胞內、胞外多醣的萃取濃度
綠藻胞內多醣體 1.348 mg/g 綠藻胞外多醣體 0.506 mg/mL
4-2 Aniline blue螢光染色檢測 β-D-(1→3)-glucan 含量
Aniline blue螢光染色法檢測 β-D-(1→3)-glucan含量，主要是測定 單股結構（single helix）多醣體的量，而不是測定三股結構（triple helix），但因為多醣體多屬於三股結構，因此在使用此分析方法前須 先將三股結構多醣解聚成單股結構再分析之，而解聚的方法便是利用 強鹼（NaOH）將多醣解聚成單股多醣（見附錄圖二）64。當三股結 構多醣處理過NaOH形成單股結構時可經由水透析後，在一定時間下 單股結構又會恢復到三股結構。
利用fluorescence method來測定多醣體中β-D-(1→3)-glucan的含 量。其原理為aniline blue中的sodium-carbonylbis［4- (phenyleneamino) benzenesulfonate］會與β-D-(1→3)-glucan形成具有專一性的錯合物，
此錯合物於激發波長395nm照射下會於495nm放出其特徵螢光。
Laminarin（海藻多醣）為此分析物之標準品，主要以poly β-1,3-glucan 為主鏈鍵結，內部有少數β-(1→6)-glucan鍵結的分支，為一個三股螺
旋的結構，研究結果顯示，此多醣濃度和螢光強度具有良好線性關 係，可應用在β-D-(1→3)-glucan含量的快速定量上79。本實驗室是以 Laminarin當作標準品，因此萃取樣品中如含有β-D-(1→3)-glucan會與 aniline blue中sirofluor所產生的複合物經由螢光分光光度計的測量 下，在波長495nm有強吸收的性質（圖十六 A）。而小球藻胞內、胞 外多醣體所含的多醣經由螢光活性分析其在395 nm激發而在495 nm 處並無明顯螢光吸收波峰，而主要螢光吸收波峰在460 nm左右（圖十 六 B、C），在定性上實驗小球藻胞內與胞外多醣體並無明顯的 β-D-(1→3)-glucan存在。
從 一 些 文 獻 中 指 出 分 析 其 小 球 藻 胞 內 多 醣 體 成 份 以 葡 萄 糖
（glucose）、半乳糖（galactose）、木糖（xylose）、鼠李糖（rhamnose）、
甘露糖（mannose）、樹膠醛醣（arabinose）還有岩藻糖（fucose）及 核糖（ribose）等糖類所構成80, 81，而 β-D-(1→3)-glucan 是以葡萄糖 為單位鍵結的結構，因此有可能在胞內及胞外多醣中並無 β-D-(1→3) -glucan的存在，或者醣鍵結並不是以葡萄糖與葡萄糖的方式鍵結而 成，另外也有可能其β-D-(1→3)-glucan含量極微量導致無法偵測。
圖十六、Aniline blue 螢光染色檢測 β-D-(1→3)-glucan
（A）標準品 Laminarin；（B）胞內多醣；（C）胞外多醣
4-3 小球藻多醣體抗氧化能力之測定
4-3-1 清除1,1-二苯基-2-苦味肼基團（DPPH）自由基能力測定：
油脂在自氧化過程中會產生自由基導致油脂酸敗，且在增殖期會 形成過氧化自由基與氫過氧化物。當自由基相互結合時，連鎖反應即 終止。抗氧化劑抑制油脂之氧化，藉由提供氫來捕捉油脂之過氧化自 由 基 ， 達 到 抑 制 油 脂 自 氧 化 化 連 鎖 反 應 。 在 抗 氧 化 研 究 上 使 用 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）來檢測抗氧化劑提供氫之能力，
因DPPH甲醇溶液於517nm下具強吸光效果，抗氧化劑或與另一自由 基結合，將使吸光值降低或消失，由此判定樣品捕捉DPPH自由基之 能力。小球藻胞內多醣濃度在0.5與1mg/mL，清除DPPH自由基之能 力分別為21％與46％，當濃度調整為1.25與1.5mg/mL時，清除率提高 至56％與70％。小球藻胞外多醣濃度為0.5與1mg/mL時，清除DPPH 自由基之能力分別為10％與14％，濃度在1.25與1.5mg/mL，清除率則 為 15％與16％。而trolox（水溶性維生素E）在低濃度下清除率為85
％左右（圖十七）。整體而言小球藻胞內多醣體在低濃度下（0.5、1、
1.25 mg/mL）清除DPPH自由基之能力較低，而在濃度1.5 mg/mL下具 有較好的清除效果，隨著胞內多醣濃度增加清除DPPH自由基隨之上 升。反之，胞外多醣體濃度在0.5、1、1.25 mg/mL及1.5 mg/mL時，隨 著 胞 外 多 醣 濃 度 增 加 則 較 無 明 顯 提 升 清 除D P P H 自 由 基 能 力 。
圖十七、小球藻胞內及胞外多醣體之清除DPPH 自由基能力
4-3-2 Trolox 當量的總抗氧化能力（TEAC）
以TEAC 法測定小球藻胞內與胞外多醣體的抗氧化力，並以 trolox 當量值表示。如（圖十八）顯示，當胞內多醣體濃度在0.5 mg/mL 與1mg/mL時，相當於0.567mM與0.573mM之trolox當量，而濃度為1.25 mg/mL、1.5mg/mL時相當於0.605 mM與0.626 mM之trolox當量。在胞 外多醣體方面濃度為0.5mg/mL與1mg/mL時，相當於0.246 mM與0.264 mM之trolox當量。而胞內多醣體濃度為1.25 mg/mL 、1.5mg/mL時分
別 為 相 當 於0 . 2 7 2 m M 與 0 . 3 1 4 m M 之 t r o l o x 當 量 。 胞 內 多 醣體在低濃度下具有極佳的抗氧化能力。
圖十八、小球藻胞內及胞外多醣體之Trolox 當量總抗氧化能力
（TEAC）
4-3-3 脂質過氧化能力測定
自由基因為擁有未配對的電子，具有極強的化學反應活性，會與 磷脂質（phospholipid）上的多元不飽和脂肪酸反應，而造成脂質的 過氧化作用，而產生一系列的破壞反應，因此導致細胞模結構和功能 的損害，喪失良好的氧化平衡，可能使正常細胞的生長成為不受控制 的複製，造成疾病的產生。
因此以 Lecithin 測定脂質氧化程度，以不同濃度胞內與胞外多醣 進行測定結果，在0.5 mg/mL 時，抑制率分別為 47％與 5％，濃度 1 mg/mL 時抑制率分別為 49％與 7％，濃度在 1.25 mg/mL 時抑制率分 別為54％與 7％，而濃度 1.5 mg/mL 時抑制率分別為 63％與 10％。
而標準品trolox 在 0.05 mg/mL 濃度時，抑制率為 82％明顯具有抑制 脂質過氧化能力（圖十九），而小球藻胞內多醣在1.5mg/mL 濃度時 是具有較好的抑制效果，而胞外多醣則無明顯的抑制效果。
從以上三個抗氧化能力測定DPPH、總抗氧化能力及脂質過氧化 試 驗 測 定 評 估 小 球 藻 胞 內 與 胞 外 多 醣 體 之 抗 氧 化 效 果 ， 以 清 除 ABTS•+自由基的效果最佳，其次是清除DPPH自由基和抑制脂質過氧 化，而胞外多醣則較無明顯的效果，因此從測定結果來看胞外多醣體 具有較弱的抗氧化效果。在自由基的清除中多酚類抗氧化作用較清楚 外，目前多醣體的抗氧化作用其機制還不明確，但一些文獻研究指出
多醣體具有抗氧化能力可能是在藉由單醣或多醣上氫原子的轉移與 自由基結合來達到清除自由基的效果82（見附錄圖三）。當分子量越 大所提供的氫原子也越多，其抗氧化能力也越佳。
圖十九、胞內及胞外多醣體之脂質過氧化
4-4 保濕能力測定
一般健康皮膚角質層含水量為 15～20％，當低含水量低於 10％
以下時缺少水的皮膚容易乾燥、粗糙、脫屑而產生皺紋，對於中年以 上的人容易產生暗淡、黑斑、色素沉澱，由於水分不足皮膚防禦能力 也會下降容易產生各種皮膚炎症和皮膚過敏83。因此可補充一些保濕 產品來增強角質層的含水量。角質層含水量是顯示角質層水負荷狀態 的一個重要指標，對於健康的皮膚其含水量會比老化或缺水的皮膚來 的高，而皮膚的障壁功能也較強。因此本實驗測定以玻尿酸、甘油、
水、小球藻胞內與胞外多醣體水溶液對皮膚保濕能力的影響來進行評 估。結果顯示（如圖二十）當塗抹完0 分鐘時，水、甘油、玻尿酸、
胞內與胞外多醣體其保濕速率為 54％、65％、67％、65％與 68％，
但隨著時間增加20 分鐘後保濕速率也跟著下降，水保濕能力剩下 11
％、甘油為 28％、玻尿酸還維持在 47％、胞內多醣體 35％、胞外多 醣體為 32％。整體而言，玻尿酸是一個具有良好保濕效果，其次是 由小球藻萃取胞內與胞外多醣體。而在玻尿酸與胞內、胞外多醣這一 類的多醣體是具有大分子量親水的物質，像是分子海綿（molecular sponge）會提供大量的水合能力，以及可具有超強吸濕能力，因此可 增加皮膚的含水量來達到皮膚的保濕能力83。
圖二十、胞內與胞外多醣對皮膚的保濕能力
4-5 抗菌能力測定
4-5-1 濾紙擴散法（disc diffusion method）
目前廣泛用於抗菌的藥物大多是各種天然抗生素，其中大部分來 自放線菌（如鏈黴素、金黴素、紅黴素等）和真菌（如青黴素、灰黃 黴素等）或者是有些許副作用的藥劑，然而隨著細菌抗藥性增加，有
目前廣泛用於抗菌的藥物大多是各種天然抗生素，其中大部分來 自放線菌（如鏈黴素、金黴素、紅黴素等）和真菌（如青黴素、灰黃 黴素等）或者是有些許副作用的藥劑，然而隨著細菌抗藥性增加，有