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是經常性運動健身能協助少年的腦部神經正常發展，因此探討天然食品與運動對精神 疾病最佳的治療時機，並深入了解其作用機制為目標。本研究是利用母體免疫激活引 發 子 代 產 生 類 思 覺 失 調 症 神 經 精 神 疾 病 的 動 物 模 式 ， 探 討 天 然 食 品 甜 菜 鹼 (trimethylglycine)與運動對腦的功能性及認知功能和行為異常之預防及治療效用。
參、實驗材料與方法
第一節：材料 1.1 實驗動物模式
本研究之實驗動物為 6 至 8 週母性 ICR 品系小白鼠，購自樂斯科生物科技股份有 限公司。第一天的一次交配被定義為懷孕的第 0 天（E0）。 從 E12 至 E17 連續 6 天，將懷孕小鼠腹膜內（IP）注射溶於 0.9％ NaCl 中的 Poly(i:c)（5.0 mg/kg，0.1 ml/10 g 體重）或等體積的 NaCl。子代與他們的母親在第三週之後分離，並將雄性小 鼠用於實驗並分別以 5 至 6 個群體籠養。所有小鼠之飼養條件維持 12 小時光照和 12 小時黑暗的生理狀況。室溫控制在 23±1℃，濕度維持在 60±10%，飼養期間供應充足 之飲水及標準飼料。
體能運動模式(physical exercise)：
實驗小鼠最初被籠養在標準籠子 46cm×22cm×12.5cm（長×寬×高）籠子裡。分組 後 的 小 鼠 根據 實 驗 時程 安 排 ，分 別 在 第四 十 天 和 第 七十 天 將 小鼠 飼 養 在尺 寸 為 67.0cm×30.5cm×19cm（長×寬×高）的較大型籠子中，5 – 6 隻為一籠。上方放有鐵架 利於擺設水瓶與飼料。除了基本墊料，小鼠一般食物和飲用水之外，還包含碟型運轉 盤與活動型輪球，如圖六。每 4 - 5 天動物標準水瓶中會提供的新飲用水和飼料，並且 清潔墊料與蝶型運轉盤。
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圖 6、體能運動模式 1.2 實驗藥品配置：
1.2.1 聚核糖肌苷酸 - 聚核糖酸(polyriboinosinic-polyribocytidilic acid)
聚核糖肌苷酸 - 聚核糖酸【 Poly(i:c) 】購自 Sigma-Aldrich Co. 施打之劑量以 0.9%
NaCl 溶液溶解配製成所需濃度：
Poly(i:c) 0.5 mg/ml ，以 1 ml/100g 體重方式（5 mg/kg 投藥劑量 ，腹腔注射）
1.2.2 治療藥物方式與組別
三甲基甘胺酸 N,N,N-trimethylglycine (TMG)
購自 Sigma-Aldrich Co. 施打之劑量以 0.9% NaCl 溶液溶解配製成所需濃度：
(A). TMG 10 mg/ml ， 以 1 ml/100g 體重方式（100 mg/kg 投藥劑量 ，腹腔注射）
(B). TMG 30 mg/ml ， 以 1 ml/100g 體重方式（300 mg/kg 投藥劑量 ，腹腔注射）
1.3 周邊血液免疫測試溶液配置：
1.3.1 ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) (1L)
(a) Na4Cl-8.02 g, (b) KHCO3-1 g, (c) Na2EDTA-37.2 mg, 溶於 1 L 的過濾二次水 內，攪拌均勻，PH 值調整至 7.4。
1.3.2 Flow buffer(1L)
(a) KCl-250 mg, (b) KH2PO4-250 mg, (c) NaCl-10 g, (d) Na2HPO4-1.4375 g, (e) NaCl-1 g, (f) FBS 1 ml, 溶於 1 L 的過濾二次水內。
1.3.3 4% Paraformaldehyde in PBS (2 L)
(a) KCl-250 mg, (b) KH2PO4-250 mg, (c) NaCl-10 g, (d) Na2HPO4-1.4375 g, (e) Parafromaldehyde-80 g，加入 NaOH 助溶，加入過濾二次水至 2L，最後 pH
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1.4.2 4% Paraformaldehyde in PBS(2 L)
(a) KCl-250 mg, (b) KH2PO4-250 mg, (c) NaCl-10 g, (d) Na2HPO4-1.4375 g, (e) Parafromaldehyde-80 g，加入 NaOH 助溶，加入過濾二次水至 2L，最後 PH 調整至 7.4。
1.4.3 15% sucrose (1L)
(a) KCl-0.2 g, (b) KH2PO4-0.2 g, (c) NaCl-8 g, (d) Na2HPO4-1.15 g, (e) sucrose-150 g
1.4.4 30% sucrose (1L)
(a) KCl-0.2 g, (b) KH2PO4-0.2 g, (c) NaCl-8 g, (d) Na2HPO4-1.15 g, (e) sucrose-300 g
1.5 免疫組織化學染色法 (Immunohistochemistry, IHC) 1.5.1 0.1 X PBS (2L)
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP) Sigma
氯化鈉(NaCl) J.T.Baker
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聚甲醛(paraformaldehyde) MERCK
蔗糖(sucrose) MERCK
Na2HPO4 J.T.Baker
NaH2PO4 Sigma
KH2PO4 Sigma
KCl Sigma
K2HPO4 J.T.Baker
3’,3 – diaminobenzendine (DAB) Sigma
Nickel Sigma
Sodium Azide MERCK
Triton X-100 J.T.Baker
Methanol Milipore Co.
Stripping buffer Bio-East Co.
表 2、免疫組織染色抗體
廠商 抗體 一抗 一抗稀釋比例 二抗 二抗稀釋比例
MERCK Parvalbumin Mouse 1:1000 Mouse 1:1000 MERCK NMDAR1 Rabbit 1:250 Rabbit 1:1000
迴轉式搖盪機 (orbital shaker)
恆溫加熱器 (digital water bath model) 酸鹼度計 (pH meter)
流式細胞儀 (flow cytometry) 冷凍切片機 (vibratome)
螢光顯微鏡 (light microscope) CCD 照相機
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第二節：動物實驗方法與流程步驟 1. 動物行為測試
1.1 開放式空間測試(open field locomotion test)
此方法用來測量小鼠活動能力，在配有即時影像的場地（42cm 長×42cm 寬×65cm 高（SINGA Real – Time Trace System, ver. 1.17, Taipei, Taiwan）在開放室空間運動 測試之前，允許小鼠在場地中進行 30 分鐘適應。適應後自由探索 15 分鐘，每一隻小 鼠結束後將會使用 70％乙醇清潔行為箱。在該測試中，將總距離經過的小鼠用於統計 分析。分析項目包含總移動距離(total traveled distance) 、平均移動速度 、最大移動 速度(maximal speed)。
1.2 三隔間社交偏好實驗(three chamber social preference test)
本實驗用以測量老鼠的社交互動(sociability)與社交偏好(social preference)之能力，
如圖七所示(Moy et al., 2004)。實驗器材為一個區分為三個小區塊(寬 40cm x 長 60cm x 高 30.5cm)的壓克力箱，區塊間皆有一個寬為 20 公分的通道。首先在適應階 段，待測鼠可以自由探索三個區塊 5 分鐘。再來分為兩階段，第一階段，在左右區塊 隨機放待測小鼠不熟悉的一般型公鼠(陌生鼠 1)於直徑 12.5 公分高為 22 公分的圓柱體 內，並開始觀察 5 分鐘，待測鼠可以自由選擇進入有陌生鼠或是空無一物的空間，檢 測小鼠的社會活動能力。接著，於第二階段實驗中，為測量待測鼠的社交偏好能力，
在另一區塊放置一隻新的一般型公鼠(陌生鼠 2)，待測鼠可以自由選擇進入有陌生鼠 1 或是陌生鼠 2 存在的空間，測量時間也為 5 分鐘。最後分析各階段分別在不同區塊所 停留的時間。
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圖 7、三隔間社交偏好實驗(three chamber social preference test)流程圖 1.3 大理石埋藏實驗(marble burying)
此實驗為精神障礙老鼠常出現的刻板行為，例如重複的梳理和挖掘(Angoa-Pérez et al., 2013)。本實驗是以檢測重複的挖掘行為，用以(長 46cmx 寬 22cmx 高 12.5cm)籠 子鋪上乾淨，無味墊料 5 公分高，將 5 x 4 個的標準玻璃彈珠（各式各樣和顏色，直徑 15 毫米，重量 5.2 克）彈珠輕輕放在鋪墊表面上如圖八所示。接著將待測鼠小心地放 在鋪上角落盡可能遠離彈子，並將過濾頂蓋放在籠子上。在測試期間扣留食物和水。
讓老鼠保持 15 分鐘不受干擾的籠子裡。在完成測試後，再將籠中的小鼠移出，且格外 小心避免移動或移出彈珠。用 70％乙醇洗滌劑清洗彈珠，再經由去離子水中徹底沖 洗，並在每次使用前晾乾。計算方式以埋入的彈珠數量而訂，如果三分之二的表面區 域被墊料覆蓋，則將大理石掩埋評分為得 5 分計算；二分之一的表面區域被覆蓋則為 2.5 分計算，最後每隻實驗老鼠埋藏的彈珠平均得分為測驗值。
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圖 8、大理石埋藏實驗(marble burying) 1.4 束縛壓力實驗(acute restraint stress)
約束性壓力被認為是一種簡單且無痛的壓力模型，不會造成持久的損傷(Buynitsky and Mostofsky, 2009)。此被認為是一種能造成心理壓力的模型，且類似於禁閉的自然 體驗(Dhabhar and McEwen, 1996)。約束力裝置由塑料圓柱約束管（ 直徑 5 公分，
長度約 10 公分，可調整）組成，用於個別約束，固定在裝有墊料的籠子裡，尾巴和鼻 子皆有通風孔，管子的設計為防止疼痛和壓縮。每一次的老鼠約束時間為 2 小時。2 小 時 的 時 間 被 認 為 足 以 激 活 HPA 軸 ， 增 加 循 環 皮 質 酮 水 平 ， 造 成 壓 力 的 產 生 (Echeverry et al., 2004; Buynitsky and Mostofsky, 2009)。
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圖 9、束縛壓力實驗(acute restraint stress) 1.5 前脈衝抑制測試 (prepulse inhibition test , PPI)
Sensorimotor gating 失能的現象廣泛的出現於神經精神疾病中，指的是對外界刺激 的過濾能力，例如思覺失調症的病理假說是患者出現 gating deficient 的認知障礙 (Geyer et al., 1993; Mena et al., 2016)，已經有許多研究證實前脈衝抑制測試可以檢 視精神疾病狀況(Valsamis and Schmid, 2011)。驚嚇反應測試箱之長寬高分別為 38、
41、58 公分，每個箱中皆有一長 12.5 x 寬 25 公分的壓克力板，其上方放置直徑 8.2 公分透明壓克力圓筒，可將小白鼠放置其中，並由前後各ㄧ片 0.2 公分的透明壓 克力面板封閉出入口，將小白鼠固定在圓筒內，但小白鼠仍可以在其中轉身。透明壓 克力圓筒上方 24 公分放置高頻揚聲器(radio shack super tweeter)， 可經由微電腦控 制背景噪音與聽覺刺激之音量。位於壓克力板下的電壓加速度計可以接收並轉換其上 應小於百分之五。在背景噪音(background noise，65 dB)下，動物適應 5 分鐘之後開 始進行測試。給予聽覺刺激測試分為三個的階段:第一及最後階段分別僅接受單一刺激 (pulse-alone，120 dB，40 ms);中間階段測試項目有三種:a.無刺激(no stimuli)、b.單 一刺激(pulse-alone，120 dB，40 ms)、c.伴隨前脈衝的刺激(prepulse-pulse，高於背 景噪音 4 dB (69 dB)、8 dB (73 dB)、12 dB (77 dB)，20 ms，測試順序 使用偽亂 數(pseudorandom)方法排列，平均測試間隔約 15 秒。其驚嚇反應振幅的大小取第一 階段之數據，前脈衝抑制作用的數值則是取中間階段之驚嚇刺激振幅計算。該種方式 較能敏感地測得藥物對於驚嚇振幅與 PPI 的作用，而不會因對驚嚇刺激的適應性 (habituation)所干擾。以上實驗設計參考 Geyer 與 Swerdlow 編寫之實驗設計流程。
2. 流式細胞分析(flow cytometric analysis)
流式細胞技術是一門細胞量化技術，可測量懸浮細胞的各種物理及化學性質;分析 白血球的功能及性質，對免疫功能的監控具有重要的價值。本實驗使用血球樣品：在 微量離心管中先加入 10-20ul 的 0.5M EDTA，透過臉頰採血約 100-500ul，之後加入
DOI:10.6814/THE.NCCU.IN.005.2018.C05 CD45R/B220 (1:250, Biolegend) 、 CD11c (1:200, Biolegend) 、 CD11b (1:500, Biolegend)、CD86 (1:100, Biolegend)、MHC class II (1:200, Biolegend)、CD206 (MMR, 1:250, Biolegend)抗體，細胞與抗體在 4℃避光作用 1 小時後以 500 xg 離心 5 分鐘，並以 flow buffer 清洗 1 次，藉此洗去未標定的抗體，之後加入 100 ul flow buffer 以及等體積的 4% paraformaldehyde solution (PFA)固定，樣品存放在 4℃。
使用流式細胞儀(Beckman Coulter CytoFLEX)分析每個樣品，先調整 forward scatter 與 side scatter 電壓值，利用細胞大小及顆粒性選取出活細胞群，收集 10,000 細胞已進行分析。根據細胞類型不同，透過以下不同標記抗體是否表現來區分：
3. 免疫組織化學染色法(Immunohistochemistry, IHC) 3.1 腦組織的灌流製備與切片
將小鼠麻醉後，以鑷子夾住胸腔表皮，用手術剪剪開胸腔及橫隔膜，露出心臟後，
將生理食鹽水(0.9% NaCl)灌入左心室數分鐘清除血液，在灌入固定液(4%
paraformaldehyde, PFA)十分鐘，將腦組織取出浸泡在固定液中靜置 24 小時，在浸泡 於 15% sucrose 溶液中隔夜，再將腦組織換至 30% sucrose 溶液中浸泡兩天。而後將 固定好的腦組織儲存再-80℃冰箱中。腦組織切片時，利用冷凍切片機(Leica, 3050S) 以冠狀面向的方式切出厚度 10 μm 組織切片，貼覆在 coating poly-L-Lysine 處理的載
DOI:10.6814/THE.NCCU.IN.005.2018.C05 Parvalbumin antibody (1:1000, MERCK) 、 rabbit anti-NMDAR1 antibody (1:150, MERCK)。第二天先以 0.1 M PBS 洗四次，每次五分鐘，再放入二級抗體中反應 1 小 時，二級抗體、Alexa Fluor 555 goat anti-mouse (1:1000, abcam)、Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit (1:200, abcam)。反應完後以 0.1 M PBS 清洗四次，每次各五分鐘，
再放入 Hoechst 33342 Solution (1:10000, Thermo)中反應 1 小時染細胞核，反應完後 以 0.1 M PBS 清洗兩次，每次五分鐘。最後在將載玻片蓋上玻片，以 Mounting medium (Fisher)封片完後，利用顯微鏡 (Zeiss, ImagerD2) 觀察組織切片，同時利用 CCD 相機 (Hamamatsu, C10600) 拍照存檔分析。
三、實驗數據分析
實驗結果之數據以平均值 ± 標準誤差（means ± S.E.M）來表示取得資料之平均 值。在小鼠模式，統計上的差異以單向變異分析 (one way analysis of variance)來建 立，並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測，將 p<0.05 視為有統計上的顯著差 異。 降或者焦慮 (anxiety)、社交行為缺失(social deficits)的現象情形，此實驗是將懷孕母鼠 腹膜內注射 Poly(i:c)引發免疫反應。Poly(i:c)暴露後利用開放式空間測試(open field locomotion test)及社交互動行為(sociability)等，來檢測母體產生免疫反應後造成子代
實驗結果之數據以平均值 ± 標準誤差（means ± S.E.M）來表示取得資料之平均 值。在小鼠模式，統計上的差異以單向變異分析 (one way analysis of variance)來建 立，並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測，將 p<0.05 視為有統計上的顯著差 異。 降或者焦慮 (anxiety)、社交行為缺失(social deficits)的現象情形，此實驗是將懷孕母鼠 腹膜內注射 Poly(i:c)引發免疫反應。Poly(i:c)暴露後利用開放式空間測試(open field locomotion test)及社交互動行為(sociability)等，來檢測母體產生免疫反應後造成子代