一、研究設計
圖5. 實驗流程（L/SD：文旦葉水蒸氣蒸餾精油；F/SD：文旦花水蒸氣蒸餾精油；P/SD：文旦果皮水蒸氣蒸餾精油；P/CP：文旦
果皮冷壓精油）。
Figure 5. Experimental procedure ( L/SD：Leaf/Steam Distillation ; F/SD：Flower/Steam Distillation ; P/SD：Peel/Steam Distillation ; P/CP：
Peel/Cold Press ).
二、實驗材料
（一）原料
本實驗材料所採用之文旦採自南投陳姓果農之果園（圖6），果樹 標定日期為民國 100 年 3 月 29 日盛花期，於盛花前 10 天採其葉片、
盛花時採集花朵、盛花後100 天採集果實。文旦葉片以清水洗淨後備 用；果實經清水漂洗後，以人工方式去除果肉及白色內皮部分，保留 其外果皮供後續實驗使用。
圖6. 採樣於台灣南投之文旦果園。
Figure 6. Wentan Pomelo (Citrus grandis (L.) Osbeck) samples were collected from a pomelo farm in Nantou, Taiwan.
(二) 藥品及試劑
1. Alcohol, 95% : 台灣菸酒股份有限公司出品。
2. Butylated hydroxyanisole (BHA) : SIGMA-ALDRICH®出品。
3. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) : SIGMA-ALDRICH®出品。
4. Dipotassium hydrogenphosphate (K2HPO4 ) : Showa Chemical Co., Ltd 出品。
5. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) : SIGMA-ALDRICH®出品。
6. Ferrozine: SIGMA-ALDRICH®出品。
7. Folin-Ciocalteu phenol reagent : 購自 Merck KGaA。
8. Gallic acid (3,4,5-Trihydroxybenzoic acid) : SIGMA ®出品。
9. Iron(II) chloride tetrahydrate, 98% : Alfa Aesar®出品。
10. Methanol 購自 Merck KGaA。
11. Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4) : Showa Chemical Co., Ltd 出 品。
12. Sodium carbonate : SIGMA-ALDRICH®出品。
13. Sodium chloride (NaCl) : Showa Chemical Co., Ltd 出品。
14. Sodium sulfate (Anhydrous ACS Reagent Grade) : USB Corporation Cleveland, OH USA 出品。
15. (±)-α-Tocopherol : SIGMA ®出品。
16. Tryptic Soy Broth (BactoTM , Soybean-Casein Digest Medium) : Becton, Dickinson and Company 出品。
17. Tea tree essential oil：以水蒸氣蒸餾法萃取而得。
(三) 培養基
1. Agar : DifcoTM, Granulated Solidifying Agent, Becton, Dickinson and Company 出品。
2. Nutrient Broth ( NB ) : DifcoTM, Becton, Dickinson and Company 出品。
3. Tryptic Soy Broth ( TSB ) : BactoTM , Soybean-Casein Digest Medium, Becton, Dickinson and Company 出品。
(四) 菌種
1. 大腸桿菌（Escherichia coli），編號 ATCC43886。
2. 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），編號 ATCC6538。
3. 綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa），編號 ATCC10145。
以上三種菌株均購自食品工業發展研究所（Food Industry Research and Development Institute, FIRDI）生物資源保存及研究中心（Bioresource Collection and Research Center, BCRC）。
三、實驗方法
(一) 新鮮樣品揮發性成分分析 1. 文旦不同部位之揮發性成分分析
本試驗於盛花（100 年 3 月 29 日）前 10 天採集文旦葉片（圖 7），
經清水漂洗後，經均質機破碎後，秤取10 g 置入 125 mL 三角錐瓶中，
以parafilm 密封 60 min 後，將 SPME 置入該密閉三角錐瓶中，固定後萃 取50 min，進行 GC 及 GC-MS 分析及鑑定並經由滯留指數比對以確認其 揮發性成分。
文旦花於盛花時採摘（圖8），秤取 10 g 置入 125 mL 三角錐瓶中，
以parafilm 密封 60 min 後，將 SPME 置入該密閉三角錐瓶中，固定後萃 取50 min，進行 GC 及 GC-MS 分析及鑑定並經由滯留指數比對以確認其 揮發性成分。
文旦於盛花後100 天採集，經清水洗淨後，去除果肉及白色內皮部 分，經由均質機破碎文旦外果皮（圖9）後秤取 10 g 置入 125 mL 三角錐 瓶中，以parafilm 密封 60 min 後，將 SPME 置入該密閉三角錐瓶中，固 定後萃取50 min，進行 GC 及 GC-MS 分析及鑑定並經由滯留指數比對以 確認其揮發性成分。
圖7. 文旦葉。
Figure 7. Wentan Pomelo leaves.
圖8. 文旦花。
Figure 8. Wentan Pomelo flowers.
圖9. 文旦果皮。
1 cm 1 cm 1 cm
2. 文旦花之細部揮發性成分分析
於盛花時摘取文旦花，分為已盛開之花朵及未盛開之花苞，並將文 旦花細分為六個部位（花瓣、花蕊、花托、子房、花柱及柱頭），如圖 10 所示，分別秤取10 g 置入 125 mL 三角錐瓶中，以 parafilm 密封 60 min 後，將SPME 置入該密閉三角錐瓶中，固定後萃取 50 min，進行 GC 及 GC-MS 分析及鑑定，並經由滯留指數比對以確認其揮發性成分。
(二) 精油之萃取
1. 水蒸氣蒸餾法萃取文旦葉、花及果皮精油
分別秤取文旦葉、花、果皮各1500 g，加入 4500 mL 蒸餾水，以果 汁機均質3 min 後，將樣品置入 10 L 的三口瓶中，利用 100℃水蒸氣為熱 源通過樣品，萃取時間為3 h，水蒸氣將精油蒸餾出，待蒸餾液依比重不 同而分離，萃取後精油添加無水硫酸鈉過濾，去除多餘水分，過濾後即為 精油樣品，於4℃下儲存備用。本試驗進行三重複實驗，並計算精油回收 率。
2. 冷壓法萃取文旦果皮精油
秤取文旦果皮1500 g，參考蔡（2007）以甘蔗壓汁機（圖11）壓榨，
使果皮的油胞破裂並將精油釋出，將擠壓出之混合精油與部分果渣之乳 濁液置入燒杯，於4℃下靜置24 h 待其油水分層，取上部油層經過高速冷 凍離心機於4℃下以轉速6000 rpm離心60 min 後，以滴管吸取最上層精油，
將剩餘樣品於同條件下再離心一次，以滴管吸取最上層精油合併為精油 樣品於4℃下儲存備用。試驗進行三重複，並計算精油回收率（黃等，
2010）。
圖10. 文旦花之不同部位。
Figure 10. Different parts of Wentan Pomelo flowers.
圖11. 甘蔗榨汁機。
Figure 11. Sugarcane juice extractor.
（大豐食品機械廠）
(三) 直接注入法與頂空固相微萃取法之比較 1.直接注入法（Direct Inject, DI）
將製備好之精油樣品以直接注入法（注射精油量為1 μL），直接注入 GC 及 GC-MS 進行精油成分分析，並比對文獻之滯留指數以鑑定其精油 成分。
2. 固相微萃取法（Solid Phase Microextraction, SPME）
秤取製備好之精油樣品1 g 置入附有 Teflon 橡膠墊之鋁蓋之圓柱型玻 璃瓶（Supelco Co. No.27343 Bellafonte. PA, U.S.A.）中，並將裝置有包覆 50/30 μm divinylbenzene/ carboxen/ PDMS 之纖維（Supelco, Bellefonte, PA, U.S.A.）插入瓶中，萃取其上部空隙 30 min 後，置於 GC 及 GC-MS 分析 及經由滯留指數比對鑑定其揮發性成分。
(四) 揮發性成分分析與鑑定 1. 氣相層析儀（GC）分析
使用儀器為Agilent 公司（CA, U.S.A.）之Model 7890 GC，分離管柱 為Agilent 公司之DB-1（60 m ×0.32 mm i.d.）；升溫條件：初溫40℃，維 持1 min，以5℃·min-1 升溫至150℃，維持1 min，以10℃·min-1 升溫至200
℃，維持11 min。注入口溫度為 250℃，檢測器溫度為300℃，以火燄離 子化檢測器（Flame Ionization Detector, FID）檢測。以氮氣為攜帶氣體，
流速為1 mL·min-1。以SPME注入時，注入口設定Splitless。以注射針注入 時，注入口設定Split，注入口的分流比例為1:100，樣品注射量為1μL。
2. 氣相層析儀（GC-MS）鑑定
使用的儀器為Agilent 公司（CA, U.S.A.）之Model 5973N 四極桿式 質譜儀（Mass Selective Detector, MSD）。GC 為Agilent Model 6890。GC 之操作條件及使用管柱與前述之GC 相同，遞送氣體為氦氣。MSD之離 子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃。質譜數據以Wiley 7n05.L之質譜 圖庫比對判定。
3. 滯留指數（Retention Index, RI）比對
本實驗之氣相層析儀滯留指數（GC-retention index）以 C5至 C25正烷 類標準品（Aldrich Chem. Co.）之混合液，於相同條件下，以 GC 之滯留 時間作為參考，依據Kováts (1958)方法計算。
滯留指數公式如下：
RI=( log(tr’)x－log(tr’)n
)+100n log(tr’)n+1－log(tr’)n
n = 正烷類之碳數
tm：甲烷在管柱滯留之時間 tr：化合物在管柱滯留之時間 x：表示未知的化合物
(五) 文旦精油抗菌活性試驗
1. 培養液與培養基及緩衝溶液配製
(1) 金黃色葡萄球菌與大腸桿菌培養液及培養基配製：
培養液之配製方法為取12 g 的 TSB（Tryptic Soy Broth）溶於 400 mL 的去離子水中，均勻攪拌至完全溶解，置於滅菌釜中滅菌40 min 後冷卻 備用。培養基配製則可直接取上述TSB 溶液中添加 1.5% Agar 即可，再 置於滅菌釜中滅菌40 min 後冷卻備用。
(2) 綠膿桿菌培養液與培養基配製：
培養液之配製方法為取3.2 g 的 NB（Ntrient Broth）溶於 400 mL 的 去離子水中，均勻攪拌至完全溶解，置於滅菌釜中滅菌40 min 後冷卻備 用。培養基配製則可直接取上述NB 溶液中添加 1.5% Agar 即可，再置於 滅菌釜中滅菌40 min 後冷卻備用。
(3) PBS（Phosphate Buffered Saline）緩衝溶液配製：
秤取K2HPO4 1.2 g、KH2PO4 3.4 g 及 NaCl 8 g，以去離子水定量至 1 L 後，調整pH 值到 7.2。
2. 菌種保存
將金黃色葡萄球菌及大腸桿菌接種至含有TSB 的螺旋試管中，綠膿 桿菌接種至含有NB 的螺旋試管中，並於 37℃下培養 24 h 後，取菌液 0.6
mL 加入已滅菌之甘油 0.3 mL 做為抗凍劑與培養液（TSB 或 NB）0.3 mL 於冷凍小管均勻混合後於 -80℃低溫冷凍冰箱中保存。
3. 菌株活化
實驗前將菌種於 -80℃凍藏櫃中取出，於室溫下回溫後，以微量可調 式滴管取100 μL 菌液加入 5 mL 培養液中活化，於 37℃下培養 24 h 後，
取出20 μL 菌液加入 5 mL 培養液中混合均勻，再次放入培養箱中培養至 菌株之對數期（Exponential or Log phase）以進行實驗。
4. 菌種生長曲線測定
取出已活化之菌液20 μL，加入 5 mL 培養液中，置於 37℃下培養，
並於每小時自混合菌液中，取出100 μL 於 550 nm 下測定其吸光值，以 培養液之吸光值做為空白組，利用吸光值對時間作圖，可得細菌之生長 曲線以確定其對數期範圍。
5. 生菌數測定
將菌株培養至對數期時，於每個時間點（每小時一次）取出100 μL 以PBS 緩衝溶液進行連續稀釋，利用倒皿法（pour plate method），取已 稀釋之菌液1 mL 與熔融狀態之培養基約 10 mL 於培養皿中混合，以八字 畫法旋轉培養皿，使微生物能均勻散布於培養皿中，靜置待其硬化後置 入37℃下培養，24 h 後可估計原菌液之菌數。將菌數與吸光值作圖，求 得迴歸曲線及方程式。其公式如下：
y = ax + b x：吸光值 y：原菌數
6. 最小抑菌濃度測定
本實驗以96 孔多孔盤測定文旦精油之最小抑菌濃度。首先將 96 孔 盤先注入100 μL 液態培養基到每個孔洞中，將配製好的最高濃度樣品
（500 μL/mL）注入第一孔中，使最終濃度成為 250 μL/mL，以微量可調 式滴管自250 μL/mL 往下進行連續稀釋，使成為 250～0.125μL/mL 之精
8. 精油之時間殺菌效力評估試驗（Time kill assay）
參考Fu 等（2007）之試驗方法，將活化後之菌液取 20 μL，加入 5 mL 培養液中，於37℃下培養至對數期，先取 100 μL 菌液於 550 nm 下測其 吸光值，代入菌數與吸光值作圖之迴歸線方程式求出生菌數。將此菌液 經由10000 g 離心 10 min 後，去除上清液，加入等體積磷酸鹽緩衝溶液
（PBS）均勻回溶後，作為儲備菌液溶液。以液態培養基稀釋此儲備菌液 至菌濃度為1x108 CFU/mL 進行實驗。
取精油於IC50之濃度，以磷酸鹽緩衝溶液（PBS）配製成 15 mL 之 試樣，並加入150 μL 之儲備菌液，均勻混合後，置於 37℃下培養，並於 0、1、2、4、8 及 16 h 取樣至培養皿中，倒入熔融之固態培養基，待其 凝固後，置入培養箱於37℃下培養 24 h 後計算其菌落數。
(六) 文旦精油抗氧化活性試驗 1. 總酚含量測定
參考Singleton 等（1999）之總酚含量測定實驗方法，將精油樣品以 乙醇配置成濃度10 µL/mL，取 0.5 mL 加入 1 mL 酚類指示劑
（Folin-Ciocalteu phenol reagent），均勻混合30 sec 後，再加入 1 mL （7.5%
w/v）碳酸鈉溶液與其反應，避光靜置 30 min 後，以 6000 rpm 離心 5 min，
取上清液於765 nm 測定其吸光值。若精油樣品中含有酚類化合物，會與 酚類指示劑反應呈色，且在波長765 nm 有吸收值，以沒食子酸（Gallic acid）
作為標準品製作檢量線，檢測樣品之吸光值可利用內插法求得沒食子酸 當量（Gallic acid equivalent；GAE），以此表示精油樣品中酚類化合物之 含量。
2. DPPH 自由基清除能力測定
2. DPPH 自由基清除能力測定