Ibraheem 等人(2010)根據現有資料庫 Plant CARE、PLACE、Genomatix Matinspector professional 分析阿拉伯芥 9 個蔗糖轉運蛋白和水稻 5 個蔗糖轉 運蛋白基因的啟動子序列，分析上游-1 ~ -1500 的 cis-acting element 的可能 調控的序列。由根據National Center for Biotechnology Information(NCBI)資 料顯示，以 OsSUT4 轉譯起始點 ATG 的 A 為+1，到上個基因的轉譯終止的 TGA 的 A，中間的核甘酸長度為 848 的核甘酸，並將此長度定為 OsSTU4 的啟動子全長。而在本研究中發現外加JA、SA、ABA 和 ET 皆會促進 OsSUT4 基因表現，由資料預測結果可以看到確實有許多調控 JA、SA 和 ABA 的 cis-acting element，如 ABRE、MYC、Me-JA motif 和 GT-1(附圖二)。
本試驗啟動子 POsSUT4(-802/-11)到最短片段 POsSUT4(-248/-11)仍會有 刻傷誘導 GUS 報導基因的表現(圖十一)，由根據 Ibraheem 等人(2010)的整理 分析，發現在 OsSUT4 啟動子 848 長度中，確實有 5 個受刻傷逆境誘導的 cis- acting element－W-box，一直到本試驗 POsSUT4(-248/-11)最短片段仍含有 1 個W-box cis-acting element，因此仍須以更短片段啟動子的轉植株去做進一 步確認。而在 POsSUT4(-248/-11)長度片段中也包含一段 MeJA motif 的 cis-acting element，由前面結果顯示刻傷逆境會透由 JA 生合成去調控下游的
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OsSUT4 基因表現，因此 MeJA motif 在刻傷下的調控仍須進一步確認。
7. 結語與未來展望
本研究為了了解刻傷逆境下水稻對於 OsSUT4 促進表現的調控機制，和 不同於一般機械性傷害的褐飛蝨危害對 SUT 的影響，及可能在啟動子上調 控的區間，因此利用荷爾蒙的外加和生合成抑制劑的前處理偵測 OsSUT4 的 基因表現，並以五個不同長度片段 OsSUT4 啟動子接上 GUS 報導基因來探 討受刻傷後誘導 OsSUT4 的區間。結果顯示(圖十三): (1)機械性刻傷會促進 OsSUT4 基因表現及啟動子的活性;(2)斜紋夜盜蟲的咬食亦會提升 OsSUT4 的 表現;(3)刺吸式口器－褐飛蝨對 OsSUT4 的基因表現為一個抑制作用;(4)刻傷 主要會透由JA 路徑去調控 OsSUT4 基因表現;(4)刻傷逆境所造成 OsSUT4 促 進的現象，H2O2亦會參與其中;(5)OsSUT4 受到刻傷的促進調控的啟動子區 域在-248 仍有活性。
未來會進一步探討的問題有:(1)目前實驗室有 pOsSUT4(-194/-11) 和 POsSUT4(-139/-11)片段轉殖株，以更短片段的啟動子驅動 GUS 的轉植株，
去找出刻傷調控的啟動子序列;(2)OsSUT4 在刻傷逆境下的功能;(3)褐飛蝨對 於 OsSUT4 基因表現抑制作用的調控機制和對刺吸式昆蟲的關係;(4)刻傷誘 導 OsSUT4 表現的組織。
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圖一、水稻三葉齡幼苗第三片葉受機械性刻傷後 OsSUT4、OsCIN1 及 OsMST6 基因表現分析。以三葉齡水稻為材料，以剪刀對第三片葉身做機械性傷害。並利 用real-time RT-PCR 測定 OsSUT4 基因(A)、OsCIN1 基因(B) 及 OsMST6 基因(C) 表現。Control 組為沒有處理刻傷材料。結果為獨立生物性和技術性三重複之平 均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。MST:monosaccharide transporter;CIN cell wall invertase。
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圖二、水稻三葉齡幼苗受到機械性刻傷和夜盜蟲餵食處理之 OsSUT4 基因表現之 比較分析。以水稻三葉齡為材料餵食夜盜蟲，密度為10 隻/株，在餵食夜盜蟲 1 小時後收取材料，並利用real-time RT-PCR 測定基因表現。結果為一重複。Control:
為沒有處理;Wounding:為刻傷處理組;Insect:夜盜蟲處理組。
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圖三、水稻三葉齡幼苗莖部經褐飛蝨餵食處理後 OsSUT1、OsSUT2 及 OsSUT4 基因之個別表現分析。以三葉齡水稻為材料餵食蟲齡為二~三齡之褐飛蝨(BPH) 若蟲，密度為8 隻/株。並利用 real-time RT-PCR 測定 OsSUT1 基因(A)、OsSUT2 基因(B)及 OsSUT4 基因(C)表現。結果為三重複之平均值，誤差值以 standard error (S.E.) 表示。Control:為沒有褐飛蝨餵養處理;BPH: brown planthopper。
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圖四、三葉齡水稻幼苗黑暗48 小時總糖含量變化及黑暗 48 小時受到刻傷處理 30 分鐘後的 OsSUT4 基因表現。(A)正常光週下和黑暗處理 48 小時之後水稻第 三片葉片之葉身的總可溶性糖含量。(B)正常光週期和黑暗處理 48 小時水稻植株，
受刻傷逆境處理的 OsSUT4 基因表現。結果為三重複之平均值，誤差值以 standard error (S.E.) 表示。
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圖五、刻傷處理對Jasmoante 生合成路徑基因表現、MeJA 對 OsSUT4 的基因 和Aspirin 前處理對刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響。並利用 real-time RT-PCR 測定受到刻傷後 OsAOS1(A)和 OsAOS2(B)隨著時間的基因表現變化。(C) 100 µM MeJA 和外加刻傷對 30 分鐘後 OsSUT4 基因表現的影響、12 小時前處理 Aspirin 對刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響。Control 組為沒有刻傷和藥劑處理組。結果 為三重複之平均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。MeJA:Methyl Jasmonate；
NW:non-wounding;W:after wounding treatment;Asp:Aspirin。
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圖六、SA 對於 OsSUT4 的影響。並利用 real-time RT-PCR 測定 SA 對 OsSUT4 基 因表現的影響(A)100 μM SA 對 OsOPR1 的影響(B)。Control 組為沒有 SA 處理。
結果為三重複之平均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。SA:Salicylic acid；
NW:non-wounding;W:after wounding treatment。
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圖七、刻傷處理對ABA 生合成路徑和反應基因的表現、ABA 對 OsSUT4 的基因 影響和抑制劑前處理對刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響。利用 real-time RT-PCR 測定刻傷後 OsNCED1 (A) 和 OsNCED2 (B)基因表現變化。刻傷後 ABA 反應基 因 OsDREB1F(C)基因表現變化。ABA 對 OsSUT4 基因表現的影響(D)。ABA 對 ABA 反應基因 OsRab16A(E)的影響。前處理 Fluridon 24 小時對 OsSUT4(F)和 OsDREB1F(G)刻傷誘導基因表現之影響。(A)(B)(C) Control 組為沒有刻傷逆境處 理;(D)(E)Control 組為沒有 ABA 處理;(F)(G) Control 組為沒有前處理 Fluridon。結 果為三重複之平均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。ABA:Abscisic acid；
NW:non-wounding;W:after wounding treatment;Flu:Fluridon。
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圖八、刻傷對乙烯生合成路徑和乙烯反應基因表現、Ethephon 對 OsSUT4 的基 因影響和前處理乙烯生合成抑制劑對誘導 OsSUT4 基因表現影響。利用 real-time RT-PCR 測定刻傷後乙烯生合成基因 OsACS1(A)、OsACS2(B)、OsACO1(C)和 OsACO2(D)基因和乙烯反應基因 OsERF3(E)的表現變化。外加 ET 對 OsSUT4(F) 基因表現的影響。ET 對 OsOPR1 基因表現的影響(F)。前處理乙烯生合成抑制劑 AIB 對誘導 OsSUT4(H)和 OsERF3(I)。(A)(B)(C)(D)(E)Control 組為沒有刻傷處 理;(F)(G)Control 組為沒有 ET 處理。(H)(I) Control 組為沒有 AIB 處理。結果均為 三重複之平均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。ET: Ethephon;
NW:non-wounding; W: after wounding treatment; AIB: 2-Aminoisobutyric acid
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圖九、三葉齡水稻幼苗受刻傷時過氧化氫定性和定量及外加NADPH oxidase 產 生H2O2抑制劑-DPI 在刻傷逆境後 H2O2定量及 OsSUT4 基因表現情形。(A)收取 受到刻傷後30 分鐘的第三片葉身，浸於 DAB 溶液中反應 12 小時，在取出後以 90%酒精，80℃水浴中脫去葉綠素。(B)以四氯化鈦法測定有外加 DPI 及對照組 中受刻傷逆境後0、15 和 30 分鐘內生 H2O2變化情形。(C)DPI 處理對於 OsSUT4 基因表現受刻傷誘導的影響。結果均為獨立試驗三重複之平均值，誤差值以 standard error (S.E.) 表示。DAB: Diaminobenzidine tetrahydrochloride；DPI:
Diphenyleneiodonium chloride。
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圖十、三葉齡水稻幼苗尖端(Tip)及基部端(Base)刻傷處理 OsSUT4 基因表現量差 異，及不同片段不同Line No.尖端和基部 GUS 基因表現。(A)水稻第三片葉身 1/2 處將其分為尖端(Tip)及基部端(Base)，刻傷處理於基部端(Base)，偵測其 OsSUT4 基因表現量。(B)取 POsSUT4(-802/-11)、POsSUT4(-483/-11)、
POsSUT4(-434/-11)和 POsSUT4(-248/-11)四個片段帶有 GUS 報導基因的轉殖株，
偵測其在尖端(Tip)及基部端(Base) GUS 基因表現量。結果均為三重複之平均值，
誤差值以standard error (S.E.) 表示。
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圖十一、 OsSUT4 啟動子 5’-deletion 片段 GUS 基因受刻傷誘導表現分析。以轉 有 OsSUT4 基因不同長度啟動子 POsSUT4(-802/-11)、POsSUT4(-483/-11)、
POsSUT4(-434/-11)及 POsSUT4(-248/-11)接上 GUS 報導基因的水稻轉殖株為材料，
三葉齡時期處理刻傷逆境在葉身1/2 基部處，和尖端處基因表現的誘導倍率。結 果為三重複之平均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。
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圖十二、刻傷逆境調控 OsSUT4 基因表現示意圖。水稻葉受到刻傷後可能透由 JA 路徑和 H2O2的增加去誘導 OsSUT4 基因表現。試驗中糖類可增加刻傷誘導 OsSUT4 的表現。而斜紋夜盜蟲的啃咬和機械性刻傷會有相同誘導 OsSUT4 的基 因表現，而褐飛蝨的調控機制則相反，會去抑制 OsSUT4 的基因表現。另外也可 觀察到SA 也會誘導 OsSUT4 的基因表現，ABA 只有些微誘導。
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附表一、構築 OsSUT4 基因不同長度啟動子的引子列表。
引子名稱 Forward primer(5’→3’) Tm(℃) 限制酵素 切位 F-POsSUT4(-802)-SacI GAGCTCATACAATCCAGGTG 51.8 SacI F-POsSUT4 (-483) -SacI GAGCTCCAAACACGCATGAA 52 SacI F-POsSUT4(-248) -SacI GAGCTCCGACCAACGCATCA 55.9 SacI
引子名稱 Reverse primer(5’→3’) Tm(℃) 限制酵素 切位 R-POsSUT4(-11)-SmaI CCCGGGAGATCTGGTAGGGT 58 SmaI
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附表二、real-time RT-PCR 之專一性引子。
Gene Accession number
Forward primer(5'>3')
Tm(℃) Amplicon size(bp) Reverse primer(5'>3')
OsSUT1 D87819 CTGTGATTTTCCTGTCCCTG 58 AACACTGCTAGTGGACCAGT 58 136
OsSUT2 AB091672 AGGAGGAGAGGTCACCGATAA 58 CCAACATCCAATGTACAACAGCA 58 240
OsSUT4 AB091673 TTTGGCTGAGCAGAACACCA 58 ATGTCATTCGGGCAGAGCTT 58 249
OsCIN1 AT342319 ACCGACCCTACCAAGTCTTC 56.2 TTCTTCATTTCCCACGCTTTC 53.6 269
OsMST6 AY342322 AAGCTCGCCAACTGATGACC 53.8 ATCCCCAAGTAGAGTATCCG 51.8 228
OsAOS1 AB116527 TGGAGCTAGTAGCTAGCTCG 53.8 GCGACGCGAACGAGATGCAA 55.9 98
OsAOS2 AY310358 TTCAACCTCCGCCGTCAATC 53.8 GCCATGCAAGAATTCAGGTACG 54.8 133
OsOPR1 AB040743 ATCAGATTATCGCCGTTCG 49 CAGCCACCACCTTGTTCC 53 253
OsNCED1 AY838897 AGCCTCGGTCTTCCAATTTT 49.7 CACCCAACACAAAAGCTACG 51.8 125
OsNCED2 AY838898 TCATTCCAAAACACCTTCCA 47.7 TCCGGGGACCTCCTATGTAT 53.8 113
OsDREB1F AY785897 AGGACGCCATCTTCGACAT 51.1 GTCGAGAGATCTCCCAATCG 53.8 106
OsRab16A AK121952 CGACACACCACCACACCATG 55.9 TGTGTACATATGCACGATGA 47.7 294
OsACS1 AK071011 GATTGATTCGATCGGCTGTT 49.7 GTCGAACGACAGCTGGTTCT 53.8 235
OsACS2 AK064250 TTTTCTTGTGGGGGTCTGTC 51.8 TTCGTCGAGAGAAGGTCGAT 51.8 161
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附表二 、接續上頁
Gene Accession number
Forward primer(5'>3')
Tm(℃) Amplicon size(bp) Reverse primer(5'>3')
OsACO1 AK065039 TCGACATGAGTCTGCTCGAC 53.8 CGCTTGTAGTGGTCCTTGGT 53.8 157
OsACO2 AK058296 TGTGTGTGCATGAACTGTGG 51.8 TTGCTATGACACGGATCGAA 49.7 199
GUS ATTGATCAGCGTTGGTGGGA 51.8 CCCACACTTTGCCGTAATG 51 208
Ubiquitin D12629 CGCAAGTACAACCAGGACAA 52 TGGTTGCTGTGACCACACTT 52 101
OsERF3 AB036883.1 GGTCGCTTTCCTTTCAGAGGA 54.4 TTGTTCGCCGTAACCGCTGGA 56.3 214
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附表三、木村氏水耕液配方。(Chu and Lee, 1989)
A Stock solution (500X, 1L)
(NH4)2SO4 24.1 g
KNO3 9.25 g
MgSO4 or MgSO4．7H2O 33.0 g or 67.5 g
KH2PO4 12.4 g
B Stock solution (500X, 1L)
Fe-citrate 7.5 g (需要加熱溶解) Ca(NO3)2 or Ca(NO3)2‧4H2O 30 g or 43.1 g
12 N HCl 41.67 mL C Stock solution (1000X, 1L)
H3BO3 0.155 g
MnSO4‧H2O 0.034 g ZnSO4‧7H2O 0.058 g CuSO4‧5H2O 0.013 g H2MoO4 or MoO3 0.008 g or 0.007 g
取1 L 蒸餾水分別加入 StockA、B 和 C 的溶液 1 ml，將 pH 值調至 4.6~4.8，即 為水稻水耕培養的水耕液。
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Callus induction medium(CIM) 含量 N6 salts(含 vitamins)* 3.95 g/L
Sucrose 30 g/L CIM-CH medium 為含有 250 mg/L Cefotaxime 和50 mg/Lhygromycine
YEP medium 含量
bactopeptone 10 g/L yeast extract 10 g/L
sodium chloride 5 g/L
agar 15 g/L
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2N6-AS medium 含量
N6 salts(含 vitamins)* 3.95 g/L
Sucrose 30 g/L
Casamino acid 1 g/L
2,4-D 2 mg/L
Phytagel 3 g/L
Glucose 10 g/L
Acetosyringone 200μM pH5.2 Regeneration medium 含量
N6 salts(含 vitamins)* 3.95 g/L
Sucrose 30 g/L
Casamino acid 1 g/L
Phytagel 4 g/L
NAA 0.5 mg/L
Kinetin 5 mg/L
pH5.7 Root induction medium 含量
MS salts(含 vitamins)* 4.4 g/L
Sucrose 30 g/L
Phytagel 3 g/L
pH5.7
**N6 salts(含 vitamins)和 MS salts(含 vitamins)為 Duchefa Biochemie 出產的混合 粉末。
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附圖一、穩定性表現系統構築所使用的載體
OsSUT4 啟動子以 SacI 和 SmaI 接入 CYH10(台大農化系洪傳楊老師提供)，再以 SacI 和 HindIII 接入農桿菌轉殖的表現載體 pCambia1302 中，並利用農桿菌轉殖 方法建立不同 OsSUT4 啟動子片段接有 GUS 報導基因的轉植水稻。
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附圖二、OsSUT4 啟動子上受刻傷、ABA、JA、SA 調控的 cis-acting element Ibraheem 等人(2010)根據現有資料庫 Plant CARE、PLACE、Genomatix
Matinspector professional 分析之結果。
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附圖三、轉植株水稻啟動子活性分析刻傷處理示意圖。將第三片葉身分為尖端 (Tip)和基部(Base)(A)，刻傷處理組處理於葉身基部(B)。
A. B.
51
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