國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系 碩士論文
Department of Agronomy
College of Bioresources and Agriculture
National Taiwan University Master Thesis
水稻蔗糖轉運蛋白基因OsSUT4受刻傷 誘導表現之調控機制
Regulation of mechanical wounding induced expression of sucrose transporter gene OsSUT4
戴 乃 強 Nai-Chiang Dai
指導教授：王淑珍 博士 Advisor: Shu-Jen Wang, Ph.D.
中華民國 102 年 7 月 July, 2013
i
誌謝
首先要感謝我的父母，可以穩定的幫助我不管是生活上或是精神幫助，讓我 在這碩士班的日子裡可以更專注的在研究上面。
在這些日子裡，非常感謝我的碩士班指導老師王淑珍老師，從大學畢業後，
由完全不了解學術研究，到現在可以做一個全面的思考並且找出試驗的問題所在，
能在實驗上可以有獨當一面。另外也感謝老師在做人處事態度上的分享、日常生 活的關心和在實驗低潮的時候的鼓勵，讓我可以順利的完成碩士學位。
感謝學長姐:宗孟、雲洋、懷如、惠心、鍾萍、蕭蔚和祥霖，在實驗上當我 有問題時，可以給我許多意見和經驗的分享，讓我實驗問題可很快解決並順利的 進行。
碩士班酸甜苦辣的日子裡，感謝實驗室跟我奮鬥的夥伴們，謝謝佳瑋在許多 時後可以幫助我收材料和實驗上的協助;感謝柏均在每次專討可以幫我修定英文 上嚴重的錯誤;感謝毓安在我實驗忙碌時幫我外帶飲料和餐點;也感謝薌雯能在 實驗上給我意見和能力的肯定，由於大家的協助讓我可以順利的拿到學位。也謝 謝新來的學弟妹們:靖雯、璿如、恪玄和士廷，在我忙於論文的時候能幫我處理 實驗的瑣事。
論文上，非常感謝各口試委員老師在論文上的指教和未來許多的實驗方向的 建議，也謝謝台大農化系洪傳揚老師在轉殖實驗的指導，也感謝台大昆蟲系楊恩 誠老師、中興昆蟲系戴淑美老師提供我試驗中的協助和諮詢，還有也謝謝農業試 驗所賴明信博士在水稻種子上的提供，得以讓我順利進行實驗並完成這本論文。
最後一定要謝謝曾經替我加油、打氣和給我正面想法的同學們，讓我曾經在 最低迷並一度想放棄這學位的時候，因為有了大家這麼的一句鼓勵讓我可以重拾 信心回到正軌上繼續完成學業。
ii
中文摘要
植物生長過程中會遭受到許多的生物和非生物造成之刻傷逆境。當植物遇刻 傷逆境時將會調整其生理及代謝反應以進行修補及防禦反應。糖類分子於刻傷逆 境反應中具有提供修補所需碳源及能量之功能。水稻蔗糖轉運蛋白(sucrose transporter, SUT)家族基因中之 OsSUT4 的表現量會受到機械性傷害和斜紋夜盜 蟲(Spodoptera litura)的咬食之刺激而明顯增強。在機械性傷害處理之葉部，與蔗 糖代謝相關之蔗糖水解酵素(OsCIN1)及單糖轉運蛋白(OsMST6)之表現也會受到 刻傷逆境誘導。然而當水稻莖稈受到褐飛蝨(Nilaparvata lugens)刺吸後 OsSUT4 的基因表現卻會受到抑制。進一步之試驗結果顯示，機械性刻傷處理後，茉莉酸 (JA)和乙烯生合成相關基因均有增加之現象，且此二種荷爾蒙均可促進 OsSUT4 基因表現，另以茉莉酸合成抑制劑處理水稻植株將會降低機械性刻傷誘導 OsSUT4 基因表現之反應。此外，刻傷處理將誘導 H2O2累積，且H2O2具增強刻 傷刺激誘導 OsSUT4 基因表現之功能。進而，藉由 OsSUT4 之不同長度的啟動子 接上GUS 報導基因之水稻轉殖株分析，發現調控 OsSUT4 受機械性刻傷誘導表 現之啟動子調控序列位於轉譯起始點至其上游248 個核苷酸序列間。
關鍵字:機械傷害、水稻、蔗糖轉運蛋白、啟動子
iii
Abstract
Plants are often suffered by wounding stresses caused by biotic and abiotic factors during growth and development, and they will modulate physiological and metabolic behavior to process repair and defense responses. Sugars play an important role to provide carbon and energy source for healing at wound site. The expression of OsSUT4 gene, one of rice sucrose transporter family member, was significantly enhanced by mechanical woundsing and Spodoptera litura chewing stimuli. However, when rice plants was attacked by sap-sucking pest, i.e. Nilaparvata lugens, OsSUT4 gene expression in rice culm was down-regulated. In addition to OsSUT4 expression, the transcript levels of the cell wall invertase gene (OsCIN1) and monosaccharide transporter gene (OsMST6) were also increased in mechanical wounding-treated rice plants. Expression of OsSUT4 can be promoted by exogenous jasmonate (JA) and ethylene. Furthermore, if JA biosynthesis pathway was blocked, the wound-induced OsSUT4 expression would be repressed. In addition, since NADPH oxidase inhibitor treatment can reduce the wounding effect on OsSUT4 expression, H2O2 was considered to function as a signal factor involved to the regulatory pathway of wound-regulated OsSUT4 expression. According to OsSUT4 promoter activity analysis in transgenic rice plants, it was suggested that the wounding-responsive element on OsSUT4 promoter was located at the region within 248 bp upstream of the translation start codon.
Key words: Mechanical wounding, promoter, rice (Oryza sativa L.), sucrose transporter
iv
目錄
誌謝……….……i
中文摘要………...……….…ii
Abstract……….………iii
目錄……….. iv
圖目錄……….…….vii
附表及附圖目錄………...……….……….viii
縮寫字對照………..…...ix
一、 前言………1
1. 機械性傷害逆境對碳水化合物轉運影響………..………..1
2. 糖類分子於植物刻傷反應中的角色和功能………2
3. 水稻的蔗糖轉運蛋白研究………2
4. 糖類相關轉運蛋白及代謝相關基因受機械性傷害逆境的影響………4
5. 植物受機械性傷害和昆蟲咬食所引起之異同………5
6. 刻傷逆境的訊息傳導因子………5
7. 本論文研究主題………7
二、材料與方法………..………..8
1. 植物材料………..8
2. 種子消毒和植株培養………..8
3. 水稻機械性傷害處理………..8
4. 三葉齡水稻幼苗斜紋夜盜蟲餵養處理………..8
5. 三葉齡水稻幼苗的褐飛蝨餵養處理………..………9
6. 水稻植株內生糖含量測定………..………9
6.1 測定材料……….…….…….….………….………..………9
6.2 水稻葉身可溶性糖含量測定………...9
v
7. MeJA、SA、ABA、ET 荷爾蒙藥劑處理………....………... 10
8. 荷爾蒙、過氧化氫生合成抑制劑前處理………...…...……10
9. 過氧化氫定性及定量測定……..…………..………11
9.1 刻傷逆境下過氧化氫(H2O2)定性觀察……….……11
9.2 刻傷逆境下過氧化氫(H2O2)定量測定……….………11
10. 穩定性表現系統進行啟動子活性分析………11
10.1 OsSUT4 基因啟動子-GUS 轉殖水稻 POsSUT4…………..………11
10.2 構築水稻蔗糖轉運蛋白 OsSUT4 基因啟動子穩定性表現載體………11
10.3 EHA105 農桿菌勝任細胞的製備………12
10.4 EHA105 農桿菌轉型………12
10.5 水稻癒傷組織的誘導………...…………15
10. 6 水稻農桿菌轉殖……….……… 13
10.7 轉殖水稻 GUS 活性之組織化學染色分析………..………14
11. 基因表現分析………..………14
11.1 水稻總 RNA 萃取………….………...14
11.2 TURBO DNase 處理……….………..15
11.3 RNA 電泳……….………15
11.4 即時反轉錄聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)……….…….16
三、結果………17
1. 機械性傷害對 OsSUT4、OsCIN1 及水稻單糖轉運蛋白 OsMST6 基因表現影 響………17
2. 斜紋夜盜蟲對水稻蔗糖轉運蛋白的影響………...…… 17
3. 褐飛蝨對水稻蔗糖轉運蛋白的影響………...….17
4. 水稻內生糖含量對於刻傷逆境誘導 OsSUT4 基因表現影響…………..……18
5. 探討荷爾蒙是否參與機械性傷害誘導 OsSUT4 表現的調控機制…………..18
5.1 MeJA 相關探討………. 18
vi
5.2 SA 相關探討………...………18
5.3 ABA 相關探討………...………19
5.4 乙烯相關探討………19
6. 過氧化氫(Hydrogen peroxide)在刻傷逆境中對 OsSUT4 基因表現的影響…20 7. 受刻傷逆境 OsSUT4 基因啟動子之活性探討………..20
四、討論………....22
1. OsSUT4 在植物受機械性傷害反應中可能扮演的角色………...…………...22
2. 醣分子對於刻傷誘導 OsSUT4 表現的探討……….…...22
3. 機械性傷害、斜紋夜盜蟲和褐飛蝨對 SUT 影響的探討………...……...23
4. 刻傷逆境下各荷爾蒙對 OsSUT4 表現的探討………..24
5. 刻傷逆境下 H2O2對 OsSUT4 基因表現的影響探討………25
6. 受到刻傷逆境調控的 OsSUT4 啟動子區域探討………..26
7. 結語及未來展望………....27
五、參考文獻………51
vii
圖目錄
圖一、水稻三葉齡幼苗第三片葉受機械性刻傷後 OsSUT4、OsCIN1 及 OsMST6 基因表現分析………..28 圖二、、水稻三葉齡幼苗受到機械性刻傷和夜盜蟲餵食處理之 OsSUT4 基因表現
之比較分析………..….………..………...29 圖三、水稻三葉齡幼苗莖部經褐飛蝨餵食處理後 OsSUT1、OsSUT2 及 OsSUT4
基因之個別表現分析………..………30 圖四、三葉齡水稻幼苗黑暗 48 小時總糖含量變化及黑暗 48 小時受到刻傷處理
30 分鐘後的 OsSUT4 基因表現………….………..………31 圖五、刻傷處理對Jasmonate 生合成路徑基因表現、MeJA 對 OsSUT4 的基因和
Aspirin 前處理對刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響………..……….……32 圖六、SA 對於 OsSUT4 的影響………..………..…33 圖七、刻傷處理對ABA 生合成路徑和反應基因的表現、ABA 對 OsSUT4 的基因
影響和抑制劑前處理對刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響.………..34 圖八、刻傷對乙烯生合成路徑和乙烯反應基因表現、Ethephon 對 OsSUT4 的基因
影響和前處理乙烯生合成抑制劑對誘導 OsSUT4 基因表現影響...…36 圖九、三葉齡水稻幼苗受刻傷時過氧化氫定性和定量及外加NADPH oxidase 產
生 H2O2 抑制劑-DPI 在刻傷逆境後 H2O2 定量及 OsSUT4 基因表現情 形………..38 圖十、三葉齡水稻幼苗尖端(Tip)及基部端(Base)刻傷處理 OsSUT4 基因表現量差
異，及不同片段不同Line No.尖端和基部 GUS 基因表現………....…39 圖十一、OsSUT4 啟動子 5’-deletion 片段 GUS 基因受刻傷誘導表現分析.………40 圖十二、刻傷逆境調控 OsSUT4 基因表現示意圖……….41
viii
附表及附圖目錄
附表一、構築 OsSUT4 基因不同長度啟動子的引子列表……….42
附表二、real-time RT-PCR 之專一性引子………..43
附表三、木村氏水耕液配方………..………..45
附表四、水稻轉殖相關培養基………46
附圖一、穩定性表現系統構築所使用的載體………48
附圖二、OsSUT4 啟動子上受刻傷、ABA、JA、SA 調控的 cis-acting element………49
附圖三、轉植株水稻啟動子活性分析刻傷處理示意圖………50
ix
縮寫字對照
簡 寫 全 名
ABA ACC ACO ACS
Abscisic acid
1-aminocyclopropanel-carboxylic acid ACC oxidase
ACC synthase AOC Allene oxide cyclase AOS Allene oxide synthase Asp Aspirin BA2H
CIN
Benzoic acid 2-hydroxylase Cell wall invertase
DEPC Diethyl pyrophocarbonate
DPI Diphenyleneiodonium chloride EDTA Ethylene diamietetra acetic acid
ET Ethephon Flu Fluridon GA Gibberellin GUS β-glucuronidase
HPLs Hydroperoxide lyase Ibu Ibuprofen
JA Jasmonate
JAR1 JASMONATE RESISTANT1 LOX Lipoxygenase
MeJA Methyl jasmonate MOPS
MST
3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid Monosaccharide transporter
NCED 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase
NO Nitric acid
OsSUT Oryza sativa Sucrose transporter
x
簡 寫 全 名
PR Pathogensis-related
SA Salicylic acid
Ubi Ubiquitin
X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside
1
前言
植物生長過程中，常遭受到不同程度之刻傷逆境，引起植物機械性刻傷的因 子包含強風、暴雨、冰雹、飛砂及磨擦等非生物所引起的機械性傷害，另外由生 物性引起的像是植食性昆蟲及動物取食行為，還有人為的嫁接、扦插及採收行為 均會造成機械性傷害的逆境。刻傷不僅會造成植物組織受損，亦易造成植物水分 喪失，病原菌的入侵，進而造成作物產量及品質下降。植物受到刻傷逆境後會引 起許多的生理及代謝反應的改變，由microarray 分析結果顯示機械性傷害會誘導 許多修復或是防禦機制相關的基因表現(Reymond et al., 2000)，例如在植物受到 刻傷24 小時後，可觀察到阿拉伯芥的葉片中會產生酚類化合物的累積，其可做 為合成下游相關木質素物質生合成的前驅物，以減少傷口對外界的接觸(Delessert et al., 2004)。
1. 機械性傷害逆境對碳水化合物轉運的影響
植物受到逆境時會改變其內生糖類於組織間之轉運及分配。以菸草為例，
以放射性同位素11C 追蹤植物內碳水化合物的流向，並模擬草食昆蟲咬食葉片之 行為，發現會促進碳源由地上部轉運到地下部，而後植物會再將地下部存放的碳 源再轉運至地上部並進行重新分配(Schwachtje et al., 2006)。另外在阿拉伯芥的研 究中發現，於葉片刻傷之傷口周圍，其光合作用的光系統 II 的效率會下降，而 離傷口較遠處則上升，並以14C 標定 CO2觀察碳轉運的流向之研究結果發現傷口 周圍成為一強烈的sink 組織，其有較多放射性物質累積(Quilliam et al., 2006)。
此 外 在 植 物 荷 爾 蒙 中 茉 莉 酸(Jasmonate)為一受刻傷逆境誘導表現的荷爾蒙 (Abraham and Gregg 2009) ， 在 白 楊 樹 的 實 驗 中 以 外 加 甲 基 茉 莉 酸 (Methyl jasmonate; MeJA)模擬刻傷逆境，發現 MeJA 處理組會有較高的碳源輸入(Arnold and Schultz 2002)。於菸草中發現在處理甲基茉莉酸 MeJA 後會促進二次代謝物 草莽酸代謝途徑(Shikimate pathway)的進行，並增加下游肉桂酸(Cinnamic acid) 含量，最後增加下游相關木質素的生合成(Hanik et al., 2010)。在甜菜中，根部受
2
到機械性傷害後，在受傷部位的葡萄糖、果糖和蔗糖都會隨時間而增高，並且也 伴隨著呼吸作用的上升(Rosenkranz et al., 2001)。
2. 糖類分子於植物刻傷反應中的角色和功能
糖分子不僅僅可作為能量和碳骨架的來源，也可扮演一個訊息因子的角色 (Smeekens et al., 2010)，其可調控部分刻傷反應相關基因的表現。先前研究顯示，
馬鈴薯的protease inhibitor II (Pin II)會受到機械性傷害和昆蟲的誘導，其表現也 會被 JA 和外加糖類而有誘導並增強的表現(Johnson and Ryan, 1990;Kim et al., 1991)。同樣的 Pathogensis-related (PR)和 LOX 基因也會受到糖的誘導(Sadka et al., 1994)。
3. 水稻的蔗糖轉運蛋白研究
蔗糖於細胞間的運輸可經由原生質連絡絲(plasmodesmata)亦可經由蔗糖轉 運蛋白(Sucrose transporter, SUT)進出細胞。高等植物中碳水化合物於組織及器官 間的轉運最主要以蔗糖(sucrose)為主要的糖類運輸型式，蔗糖可透由位於韌皮部 上的蔗糖轉運蛋白將蔗糖以主動運輸形式轉運到韌皮部以進行長距離的運輸 (Braun and Slewinski, 2009)。由菸草和番茄的 NtSUT1 及 StSUT1 研究中發現，當 以反義股RNA 轉殖降低其表現量，在這些轉植株中可看到葉片中有較高的可溶 性糖的累積、開花延後、果實及種子發育不良的現象(Bürkle et al., 1998;Hackel et al., 2006)，因此蔗糖轉運蛋白在 sink 組織和 source 組織的關係維持中扮演著重要 角色。
SUT 基因在大多數植物體中屬於多基因之基因家族，而其蛋白質結構，為 一個有12 個穿膜區間的膜蛋白(Shiratake 2007)，而根據目前蔗糖轉運蛋白的氨 基酸序列可以分成三種形式(Aoki et al., 2003)，TypeI 特性為
high-affinity/low-capacity，TypeII 在蛋白質的結構上有較長的 N 端及長的中心圈 環，其與酵母菌的蔗糖感應蛋白(sensor)結構相似，因此推測可能和蔗糖的感應 有關(Barker et al., 2000)。而 TypeIII 特性為 low-affinity/high-capacity。
3
水稻中有五個蔗糖轉運蛋白基因(OsSUT1~OsSUT5)(Aoki et al., 2003) ，根據 胺基酸分類 OsSUT1、3、4 和 5 歸屬於 TypeII，而 OsSUT2 屬於 TypeIII(Aoki et al., 2012)。第一個被篩選出的水稻 SUT 基因為 OsSUT1，基因表現在水稻的葉身、
葉鞘、穗和發芽中的種子中均有表現，而在根部中則沒有表現 (Hirose et al., 1997)，
在花序組織中，OsSUT1 的基因表現會隨著開花後而逐漸上升，在第七天後隨之 而下降(Aoki et al., 2003)。另外本實驗室先前的研究指出在種子浸潤期間，
OsSUT1 基因於胚部組織之表現會迅速上升，而後下降，另在葡萄糖和蔗糖處理 24 小時後，OsSUT1 基因表現被抑制，但在處理後五天 OsSUT1 的表現則明顯上 升 ， 且 葡 萄 糖 調 控 OsSUT1 基 因 的 表 現 是 經 由 hexokinase-dependent signal transduction pathway(Chen et al., 2010)。在水稻種子的胚部組織中 OsSUT1 表現亦 受荷爾蒙gibberellinic acid (GA)及 abscisic acid (ABA)調控(Chen et al., 2010)。根 據本實驗室先前研究結果，OsSUT1 於上位葉葉鞘之基因表現在抽穗後時期明顯 高於抽穗前時期，而 OsSUT1 於葉鞘的表現會受 ABA 所調控(Chen and Wang, 2008; Chen and Wang, 2012)。在 OsSUT1 的表現分析上，根據在水稻種子萌芽時 期的免疫定位和啟動子的表現分析中可得知 OsSUT1 主要位於韌皮部細胞 (Scofield et al., 2007)。以轉殖方式抑制 OsSUT1 基因表現後，發現穀粒充實百分 比和種子發芽的速率顯著降低(Scofield et al., 2002)， OsSUT1 功能下降亦會影響 花粉之正常功能(Hirose et al., 2011)。
OsSUT2, 3, 4 及 5 於發育中之穗部，於開花後一至七天的時間表現變化並沒 有明顯的差異，但是於開花後期則會顯著下降(Aoki et al., 2003; Sun et al., 2008)。
在 OsSUT2 功能性研究中，以 T-DNA 破壞 OsSUT2 的表現會延遲水稻生長、穀 粒千粒重下降及分蘖數降低，且發現於突變株的葉片中會累積較多的可溶性糖類 (Eom et al., 2011)。在 OsSUT2 次細胞定位上，本實驗室藉由 OsSUT2 和 GFP 報 導基因所產生融合蛋白進行大麥糊粉層暫時性表現分析，結果顯示 OsSUT2 位在 細胞膜上的膜蛋白(Siao et al., 2011)。水稻種子胚中的 OsSUT2 基因表現會受到胚 乳所提供的糖類分子所誘導調控，在發芽後第五天有高的表現量，研究結果指出
4
其是透由hexokinase-independent 途徑 (Siao et al., 2011)。根據本實驗室先前研究 生蕭惠心藉由 OsSUT2 和 OsSUT4 啟動子接上 GUS 報導基因轉植水稻之分析結 果，OsSUT2 及 OsSUT4 基因於根及葉部均具維管束韌皮部表現專一性；在穎花 中，OsSUT2 及 OsSUT4 抽穗前主要表現於內外穎之穎脈，隨著開花授粉後逐漸 表現下降，而轉向於雌蕊及雄蕊上的表現。而隨著花粉的成熟，OsSUT4 之基因 表現及啟動子活性表現也逐漸增加。水稻根系部分，OsSUT2 及 OsSUT4 啟動子 主要於種子根之根尖及側根形成處。而水稻根系 OsSUT2 及 OsSUT4 基因表現可 受蔗糖及葡萄糖促進 (蕭,2011)。
4. 糖類相關轉運蛋白及代謝相關基因受機械性傷害逆境的影響
植物受到刻傷逆境後，在受傷部位需要較多的碳源的供給，以做為一個訊號 分子誘導下游防禦基因表現、或是生合成相關抗蟲的蛋白以植物取食、二次代謝 物或用以產生能量、修補作用相關的二次代謝物碳骨架的來源(Ibraheem et al., 2008)，由阿拉伯芥葉片中觀察到機械性刻傷後，木質素生合成相關的基因確實 會明顯的被提升，並在傷口周圍觀察到有木質素的前驅物酚類物質的累積 (Delessert et al., 2004)。利用 real-time RT-PCR 分析發現，OsSUT2 及 OsSUT4 兩 基因在受到機械性傷害逆境後，基因表現都會有促進的現象，OsSUT2 和 OsSUT4 分別在 1 小時和 30 分鐘表現量達最高，並隨著時間而表現量下降(蕭惠心論文, 2011)。阿拉伯芥的蔗糖轉運蛋白 AtSUC3 主要表現於保衛細胞、表皮絨毛、花粉 萌發處、根尖端及發育中的種皮，其在葉部之表現受到刻傷逆境後亦可被明顯誘 導啟動子活性和基因表現(Meyer et al., 2004)。在機械性傷害逆境對單糖轉運蛋白 研究中，阿拉伯芥的單糖轉運蛋白 AtSTP4 啟動子活性和基因的表現亦會受到刻 傷逆境而誘導(Truernit et al., 1996)。Cell wall invertase (CIN)在細胞間隙扮演一個 將間隙中的蔗糖水解成葡萄糖和果糖的重要角色(Sherson et al., 2003)，前人研究 中發現當CIN 的功能下降後，在玉米會發現其對於種子的發育會受到抑制(Cheng et al., 1996)，胡蘿蔔的根生長發育亦會受到 CIN 的缺失而抑制根尖生長(Tang et al., 1999)。在阿拉伯芥、豌豆、甜菜等確實都可看到當受到機械性傷害後其 cell
5
wall invertase 的基因表現量會顯著的提升(Zhang et al., 1996; Rosenkranz et al.,
2001;Quilliam et al.,2006)。而 Singer 等人(2011)的研究亦顯示柑橘的蔗糖分解的
酵素(sucrose synthase)，啟動子也會受到機械性傷害而誘導表現。5. 植物受機械性傷害和昆蟲咬食所引起之異同
植物受到生物逆境後，會產生許多防禦機制以抵抗這些傷害，菸草在刻傷後 會增加尼古丁生合成(Baldwin et al., 1997)以減少昆蟲對其危害情形，另一方面昆 蟲為了降低植物所產生的防禦反應，而昆蟲與植物共同演化的結果而產生另一種 的適應的機制，許多咬食性昆蟲和韌皮部刺吸式昆蟲的唾液中發現 glucose oxidase (GOX)，GOX 會抑制植物在受到生物逆境後所產生尼古丁的量，昆蟲可 透由唾液中相關酵素去抑制植物的防禦表現，使昆蟲的取食可順利進行(Musser et al., 2002;Tian et al., 2012)。植物對於機械性刻傷和受到昆蟲危害時其表現機制 會有所不同，植物受到昆蟲為害時，除了受到機械性傷害外，更會伴隨唾液成份 的化學性的刺激，根據microarry 資料顯示比較一般刻傷逆境和受到昆蟲危害的 基因表現上，其都會去誘導 oxylipins pathway 上的基因表現，如 lipoxygenase (LOX) 、 12-oxo-phytodienoic acid reductase 、 allene oxide synthase (AOS) 、 hydroperoxide lyase 等基因表現，另亦會誘導脫水逆境相關的基因，如 late embryogenesis abundant-like protein (如 ER5 基因)和 dehydrin-like protein 相關的基 因(如 XERO2 基因)表現，但在昆蟲處理組中發現會受誘導的 hevein-like protein (HEL)基因，其表現並不會受單純的刻傷處理所誘導。HEL 基因為一病原微生物 的防禦基因，結果推測可能受昆蟲分泌物的刺激而誘導表現(Reymond et al., 2000)。
6. 刻傷逆境的訊息傳導因子
植物受到刻傷逆境刺激後，將經過各種訊息傳導途徑，啟動植物的防禦反應 及修補機制，以減少對植物所造成的衝擊。這些訊息傳導因子包括茉莉酸 (jasmonate)、水楊酸(salicylic acid; SA)、離層酸(abscisic acid; ABA)、乙烯(ethylene)、
一氧化氮(Nitric oxide; NO)和過氧化氫(hydrogen peroxide)等(Huang et al., 2004;
6
Erb et al., 2012)。在刻傷逆境下，植物體內訊息的傳導並非只有單因子的改變，
而是同時調控各種荷爾蒙和其內部氧化狀態，以調控下游同個基因或是不同的基 因表現(Erb et al., 2012)。
茉莉酸為一個刻傷逆境荷爾蒙(Koo and Gregg 2009)，植物受到刻傷逆境後可 觀察到茉莉酸生合成路徑上的基因會被誘導，如 LOX、AOS 和 allene oxide cyclase (AOC)
(
Ralph et al.,2006)。水稻和阿拉伯芥受到刻傷逆境後，分別在 30 分鐘和 1 小時誘導內生茉莉酸含量達最高量(Rakwal et.,al 2002; Onkokesung et al., 2010) 。 在甘藷中發現sporamin 基因會受刻傷誘導，其亦是透由茉莉酸途徑調控此誘導 反應(Wang et al., 2002)。累積的茉莉酸會和植物體內的 isoleucine 透由JASMONATE RESISTANT1(JAR1) 轉變成 JA-Ile，JA-Ile 會活化 SCFCOI1去接合 於JAZ 這 repressor，促使 26S proteasome 將結合於目標基因啟動子上的 repressor 將其分解，而促進下游基因表現的進行(Howe and Georg 2008)。
SA 為植物防禦病菌之主要機制之一(Wang et al., 2013)，前人研究發現受到 機械性傷害逆境後SA 生合成的關鍵蛋白 Phenylalanine ammonia-lyase (PAL)酵素 活性和基因表現上都會受到促進(López-Gálvez et al.,1996; Mur et al.,2002)，其不 只會受到機械性傷害誘導反應，也會參與蚜蟲、白背飛蝨等刺吸式口器的昆蟲誘 導反應，而可透由SA 路徑去誘導 nonexpresser of PR genes 和病原菌防禦相關的 pathogenesis-related protein (Walling, 2000)。在阿拉伯芥研究中發現受到刻傷後 SA 的含量會上升，若同時處理昆蟲的分泌物，其 SA 含量上升會有增強趨勢 (Schafer et al., 2011)。而 SA 亦會去抑制番茄在刻傷逆境下產生的 proteinase inhibitor (Doares et al., 1995)。
ABA 為一個缺水逆境荷爾蒙，由前人研究中知道機械性傷害會誘導部分缺 水逆境相關的基因表現，已於不同的植物均觀察到組織受傷後ABA 含量增加的 現象(Schafer et al., 2011)，且 ABA 生合成關鍵酵素基因 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED)的表現有被誘導表現的現象(Suttle et al., 2013) ，另外在馬鈴
7
薯和番茄的proteinase inhibitor II (Pin II)基因表現除了會受到刻傷逆境的誘導之 外，也會受到 ABA 的誘導，另外以 ABA 生合成的缺失的植株發現到一樣受到 刻傷逆境後無法誘導 Pin II 基因的表現量 (Pena-Cortes et al., 1989)。
乙烯為一個氣態分子的植物荷爾蒙，植物受到刻傷逆境後會有大量的乙烯產 生(Boller and Hans 1980)，生合成關鍵基因 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACS)和 Aminocyclopropanecarboxylate oxidase (ACO)亦會受刻傷刺激誘 導表現上升(Ralph et al., 2007)。
前人研究中發現受到刻傷逆境後，植物的組織會有過氧化氫 hydrogen peroxide (H2O2)產生，在馬鈴薯、玉米和豌豆等植物受到刻傷逆境後，以
diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)進行過氧化氫定性染色，可觀察到在葉 片中會有明顯的H2O2)累積(Orozco-Cárdenas and Clarence 1999)，並發現在刻傷時 會透由oxylinpins pathway 途徑誘導 NADPH oxidase 的酵素活性，進而促使 H2O2
的產生。在刻傷逆境後，番茄proteinase inhibitor I (Pin I) 和 proteinase inhibitorII (Pin II)表現會受到誘導增加，而在外加 NADPH oxidase 抑制劑後，明顯抑制刻 傷下Pin I 和 Pin II 的誘導表現(Orozco-Cárdenas et al., 2001)。
7. 本論文研究主題
本實驗室蕭惠心研究生發現 OsSUT4 的基因表現會受到機械性傷害所誘導，
本論文主題為延續探討 OsSUT4 受刻傷逆境誘導表現之訊息調控途徑。本研究內 容主要包含: (1)探討不同取食行為昆蟲對 OsSUT4 基因表現的影響;(2)OsSUT4 所 受刻傷逆境誘導表現之訊息傳導途徑;(3)探討 OsSUT4 基因啟動子上受刻傷刺激 調控之序列區域。
8
材料與方法
1. 植物材料
台農67 號水稻(Oryza sativa L. cv. Tainung 67 ; TNG67)。
2. 種子消毒和植株培養
(1) 種子以 1% (v/v) 次氯酸鈉 NaOCl 消毒 30 分鐘(每 15 分鐘換一次消毒水)，
並以清水沖洗至消毒水味道消失，最後一次用蒸餾水潤洗，平鋪於培養皿中 的濕潤擦手紙上。
(2) 於 30℃ 植物生長箱中黑暗培養三天。
(3) 第三天將有發芽的種子移至 150 ml 玻璃燒杯之鐵網架上，置於 30/ 25℃(日溫 /夜溫) 植物生長箱中，光週期為 12/12 小時，每隔三天更換一次木村氏水 耕液 (附表三)。
3. 水稻機械性傷害處理
將培養至三葉齡的TNG67 水稻幼苗，於第三片葉身處理刻傷逆境，以主 脈為界線分左右兩部分，並以剪刀各處理五刀，均勻於葉面上，處理時避開 主脈。
啟動子活性分析方面為了減少在轉殖株中，轉入不同套數、插入的位置 及同質或異質的影響，將水稻三葉齡第三片葉身一半分為尖端(Tip)和基部 (Base)，於基部處理刻傷逆境，觀察自身尖段和基部受誘導報導基因的表現 (附圖三)。
4. 三葉齡水稻幼苗斜紋夜盜蟲餵養處理
(1) 由台灣大學昆蟲系楊恩誠老師所提供斜紋夜盜蟲 Spodoptera litura。
(2) 以毛筆刷挑取斜紋夜盜幼蟲，讓蟲飢餓 4 小時。
(3) 將蟲放於第三片葉身上，餵養處理 1 小時，餵養密度為 10 隻/株。
(4) 將蟲和水稻苗分開，收取第三片葉身，以液態氮快速冷凍，保存於-80℃冰箱。
9
5. 三葉齡水稻幼苗的褐飛蝨餵養處理
(1) 由中興大學昆蟲系戴淑美老師所提供的褐飛蝨 Nilaparvata lugens (Stål)，並 以水稻苗飼養之。
(2) 以吸蟲管吸取第三、第四齡的褐飛蝨若蟲，根據行政院農業委員會動植物防 疫檢疫局的植物保護圖鑑(李, 2002)，第三齡蟲長度約為 2.0 mm，第四齡約 為2.4 mm。
(3) 以生長到三葉齡的 TNG67 水稻苗餵養褐飛蝨，處理密度為 8 隻/株，處理時 間為12、24、48 和 72 小時，收取水稻莖桿的部分，十株為一個樣品數並用 液態氮快速冷凍，保存於-80℃冰箱。
6. 水稻植株內生糖含量測定
6.1 測定材料
將生長至TNG67 三葉齡的水稻植株更換水耕液後，置放於植物生長箱中，
避光處理48 小時，對照組為在正常光照下生長。
6.2 水稻葉身可溶性糖含量測定(高, 2005) (1) 以每 10 片葉身為一重複樣品並秤重。
(2) 以液態氮將樣品研磨製粉末，加入 2 ml 80%(v/v) 乙醇於 80℃萃取 15 分鍾。
(3) 4℃、3000 x g 離心 10 分鐘。
(4) 將上清液吸取至新的微量離心管中。
(5) 重複步驟(3)~(4)兩次。
(6) 將樣品體積以 80%(v/v) 乙醇補齊至 10 ml，即為水溶性醣類溶液。
(7) 每個樣品取 100 μl 水溶性醣類溶液以真空抽氣抽至乾燥。
(8)加入50 μl chloroform 和 200 μl 二次水溶解乾燥樣品。
(9) 混勻後以 13,230 x g,4℃離心15 分鐘。
(10) 取 40 μl 上清液並加入 360 μl 二次水混合均勻，並同時配置葡萄糖標準溶 液。
10
(11) 於冰上緩慢加入 600 μl Anthrone solution(0.2 g Anthrone 溶於 100 mL 95%硫 酸)
(12) 以 100℃沸水反應 7.5 分鐘。
(13) 冷卻後於 630 nm 波長下測量其吸光值。
(14) 利用所得到的樣品吸光值代入標準曲線公式，乘上稀釋倍數 6.25，最後除 以鮮重，即得到每單位鮮重所含有的醣含量。
6.3 黑暗處理 48 小時之後，對水稻第三片葉身做刻傷處理，於刻傷處理 30 分後 收取材料偵測其 OsSUT4 的基因表現變化。
7. MeJA、SA、ABA、ET 荷爾蒙藥劑處理
將生長至三葉齡的水稻幼苗處理100 μM 的 Methyl jasmonate (MeJA) 2 小時、
Salicylic acid (SA) 和 Abscisic acid (ABA)在培養水耕杯中，處理時間為 30 分、1 小時、2 小時、6 小時和 12 小時。100 μM Ethephon (ET)處理在培養的水耕杯中，
並放置於獨立的生長箱中，處理時間為1 小時、2 小時、6 小時和 12 小時。收取 材料第三片葉身，十株為一個樣品並以液態氮快速冷凍。
8. 荷爾蒙、過氧化氫生合成抑制劑前處理
8.1 植物荷爾蒙抑制劑處理對於刻傷誘導 OsSUT4 基因表現影響
在處理機械性傷害前12 小時處理 Jasmonate 生合成抑制劑 aspirin(Asp;
Sigma-Aldrich○R) ( Pēna-Cortés et al ., 1993) 100 µM。Abscisic acid 生合成抑制劑 Fluridon(Flu; Fluka) 100 µM、Ethylene 生合成抑制劑 2-Aminoisobutyric acid(AIB;
Alfa Aesar○R)10 µM 和 100 µM 24 小時前處理後對植株做刻傷逆境，30 分鐘後收 取材料偵測 OsSUT4 基因表現情形。
8.2 NADPH oxidase 抑制劑處理
在刻傷處理前6 小時噴灑 Diphenyleneiodonium chloride(DPI; Sigma-Aldrich○R) 10 mM 於水稻地上部，以抑制植物體中 NADPH oxidase 在逆境下所產生的過氧 化氫(Orozco-Cárdenas et al., 2001)。並於刻傷處理後在噴灑 1 次 10 mM DPI 於葉
11
身刻傷處，待刻傷後 15 分、30 分收取材料分別測定內生 H2O2的量和 OsSUT4 的基因表現
9. 過氧化氫定性及定量測定
9.1 刻傷逆境下過氧化氫(H2O2)定性觀察(Orozco-Cárdenas and Clarence 1999) 利用Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB; Sigma-Aldrich○R)進行染色，
其會與H2O2產生棕色化合物，而達定性觀察目的。取三葉齡水稻幼苗第三片葉 身，以剪刀處理機械性傷害，在葉身兩側分別剪5 刀並且避開主脈，並將葉身剪 下後放於15 ml 離心管中加入 DAB 溶液(0.5 mg/mL,pH 3.8)。於 37℃生長箱反應 12 小時，換成 95%酒精以 80℃熱水浴 20 分鐘脫去葉綠素，再換成 70%酒精保 存，並做後續拍照。
9.2 刻傷逆境下過氧化氫(H2O2)定量測定(高, 2005)
(1) 收取受刻傷後的第三片葉身並秤重，每一樣品約為 45 mg~50 mg。
(2) 將樣品磨碎後加入 1.5 ml 的 Sodium phosphate buffer(50 mM，pH 6.8，內含 1 mM Hydroxylamine)。
(3) 以 4℃，6000 xg 離心 25 分鐘。
(4) 吸取 1 ml 上清液至新的離心管中。
(5) 加入 0.5 ml TiCl4(Titanium chloride(0.1%，v/v)溶於 20%(v/v)H2SO4) (6) 震盪均勻後，於室溫下以 1000 xg 離心 15 分鐘。
(7) 吸取 200 µL 上清液測定 OD410的吸光值
(8) 並帶入以 H2O2所作的標準曲線公式中，最後乘上稀釋倍數和除以鮮重，可 得到每單位鮮重下有多少量的H2O2。
10. 穩定性表現系統進行啟動子活性分析
10.1 OsSUT4 基因啟動子-GUS 轉殖水稻 POsSUT4(-434/-11)::GUS(由陳懷如博士 於本實驗室建立)。
10.2 構築水稻蔗糖轉運蛋白 OsSUT4 基因啟動子穩定性表現載體
12
由本實驗室先前研究生陳懷如博士所構築於CYH10(台大農化系洪傳揚老師 所提供載體;附圖一) OsSUT4 啟動子全片段，設計正向引子並帶有 SacI 限制酵素 切位，配合位於-11 的反向引子並帶有 SmaI 限制酵素切位(附表一)，以 Polymerase chain reaction; PCR(Phusion ○R High-Fidelity DNA polymerase) 反 應 得 到 POsSUT4(-802/-11)、(-483/-11)和(-248/-11)的三個啟動子片段，以限制酵素 SacI 和 SmaI(BioLabs lnc.)將啟動子片段切開後接入 CYH10 的載體上，確定序列正確 後再將此一構築以 SacI 和 HindIII 兩限制酵素切下後接到穩定性表現載體 pCambia1302(附圖一)上，構築好的載體以 SacI 和 SmaI 限制酵素作用，確認構 築長度正確。
10.3 EHA105 農桿菌勝任細胞的製備
(1) 從 YEP 固體培養基 (10 g Bactopeptone、10 g Yeast extract、5 g Sodium chloride、
15 g Agar 溶於 1 L 的 dH2O2中;pH 5.7)挑選 EHA105 單一菌落，培養於 3 ml YEP 液體培養基中(10 g Bactopeptone、10 g Yeast extract、5 g Sodium chloride 溶於1 L 的 dH2O2中;pH 5.7)。
(2) 於 28℃震盪培養 2 天。
(3) 取 1 ml 菌液加到 50 ml YEP 液體培養基繼續培養，每隔約 30 分以分光光度 計測定OD600的讀值，直到讀值為0.5 到 1。
(4) 將菌液到入是先預冷的離心管中，以 4℃、3829 xg 離心 7 分鐘。
(5) 倒掉上清液後加入 200 ml 預冷的無菌水，混合均勻後以 4℃、3,829 xg 離心 7 分鐘。
(6) 倒掉上清液後加入 40 ml 預冷的 10% glycerol，混合均勻以 4℃、1,378 xg 離 心20 分鐘。
(7) 倒掉上清液，加入 3ml 預冷的 10% glycerol 並混合均勻，以 40 µl 分裝於微 量離心管中，保存於-80℃備用。
10.4 EHA105 農桿菌轉型
(1) 將 EHA105 勝任細胞放置於冰上溶解，並預冷電穿孔法用的 cuvette。
13
(2) 取 100 ng 接有 POsSUT4(-248/-11)、(-483/-11)和(-802/-11)啟動子片段的 pCambia1302 質體 DNA 加到 EHA105 勝任細胞中混合均勻，並加入至預冷 的cuvette 中。
(3) 將 cuvette 放於 Electroporation Apparatus (Bio-Rad)中，選擇 Agro 模式並按下 Pulse。
(4) 將菌液重新懸浮於 1 ml 的 YEP 液體培養基，於 28℃震盪培養 60 分鐘。
(5) 將菌液塗於含有抗生素 Kanamycin 的固體 YEP 培養基上，於 28℃培養 2 天。
10.5 水稻癒傷組織的誘導(相關培養基於附表四)
(1) 以水稻 TNG67 乳熟期到糊熟期間的未成熟種子為材料，收取後存放於 4℃冰 箱備用。
(2) 將未成熟的種子去掉內外穎以消毒水(1%NaOCl 及一滴 Tween-20)消毒 30 分 鐘。
(3) 在無菌操作台內，以無菌水沖洗至完全移除消毒水。
(4) 將清洗過的種子放於 CIM 固體培養基上，以 3M 透氣膠帶封邊，放於 27℃
全光照下培養，約培養4~6 週。
(5) 挑出由胚盤長出的癒傷組織，移到新的 CIM 培養基中，經過約 2 到 3 週選 取直徑2-5 mm 的癒傷組織進行農桿菌轉殖。
10.6 水稻農桿菌轉殖(相關培養基於附表四)
(1) 取 轉 型 成 功 的 農 桿 菌 培 養 於 3 mL YEP 液 體 培 養 基 中 ( 含 50 µg/ml Kanamycine)，於 28℃震盪培養 2 天。
(2) 取 0.5 ml 菌液加到 50 ml AB 培養基中(含 50 µg/ml Kanamycin)，於 28℃震盪 培養，每隔一段時間(約 1 小時)測定其 OD600讀值，直到OD600落在 0.8-1.0 之間。
(3) 以 4℃、3,840 xg 離心 7 分鐘，去掉上清液，加入 10 ml MS 液態培養基，使 菌體懸浮於培養基中，倒入無菌的petri dish 中。
(4) 將水稻癒傷組織浸於菌液中，在取出培養於 2N6AS 的固體培養基中，在 27
14
℃黑暗中培養3 天。
(5) 收取感染的癒傷組織，以無菌水、MS 液態培養基交替清洗，最後以含有 250 µg/ml Cefotaxime MS 液態培養基清洗，並每小時洗一次。
(6) 將洗淨的癒傷組織移到含有 50 µg/ml hygromycin 和 250 µg/ml Cefotaxime 的 固態篩選培養基中，於27℃全光照下培養，約 4 週可得到轉型成功的癒傷組 織。
(7) 將繼續生長的癒傷組織移到 PM 固體培養基中，於 27℃全光照下培養約 10 天，誘導長出芽。
(8) 將長出芽的癒傷組織移到 MS 固體培養基中，可促進其發根。
(9) 3 週後可將水稻苗移出，並進行馴化後種植於土盆中。
10.7 轉殖水稻 GUS 活性之組織化學染色分析 參考 Jefferson (1987)，進行 GUS 染色分析。
(1) 將材料置入染色液 [ 0.1 M NaPO4 buffer (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide ( K5[ Fe(CN)6 ] ), 0.5 mM potassium ferrocyanide ( K4Fe(CN)6‧3H20 ), 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc), 0.1 % Triton X-100 ]中。
(2) 放於 37℃黑暗培養箱中反應 2 小時。
(3) 反應完以 70%酒精保存。
11. 基因表現分析
11.1 水稻總 RNA 的萃取
(1) 收取水稻各組織材料，以液態氮急速冷凍並保存於-80℃。
(2) 將約 0.1 g 的材料放入先以液態氮預冷的研缽中，並利用液態氮研磨成粉末。
(3) 加入 1 ml Trizol Reagent (Invitrogen)或 Azol○R (RNA Isolation reagent)混合均 勻，待研缽中的樣品恢復至液態時，吸取其萃取液至微量離心管中。
(4) 於室溫下靜置 5 分鐘。
15
(5) 以 7,830 x g, 4℃離心 5 分鐘。
(6) 吸取上清液至新的微量離心管，加入 0.2 ml chloroform，均勻混合 3 分 鐘。
(7) 以 11,270 x g, 4℃離心 15 分鐘。
(8) 吸取出上清液至新的微量離心管，加入 0.5 mL 100％ isopropanol 混合 均勻，於室溫靜置10 分鐘。
(9) 以 13,230 x g, 4℃離心 15 分鐘。
(10) 去除上清液，加入 1 ml 75％酒精清洗沉澱物。
(11) 以 13,230 x g, 4℃離心 15 分鐘。[重複步驟(10)和(11)一次]
(12) 去除酒精，以真空乾燥機抽氣 10 分鐘。
(13) 以適量含 0.1％ diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma) 的 dH2O 加入乾燥 好的RNA 中，於 37℃乾浴槽進行溶解 30 分鐘。
(14) 以 9,750 x g, 4℃離心 3 分鐘，吸取上清液。
(15) 以 Spectroohotometer (Thermo NANOdrop1000)測定 RNA 濃度。
11.2 TURBO DNase 處理
去除RNA 樣品中 genomic DNA 的干擾，使用 TURBO DNA-free TM kit (Ambion)。
(1) 取 6 μg total RNA 樣品加 DEPC 水至 35 μL，加入 4 μL 10X TURBO DNase buffer 及 1 μL (2U/μL) TURBO DNase，總反應體積為 40 μL。
(2) 37℃反應 30 分鐘。
(3) 加入 4 μL inactivation reagent 於室溫下作用 2 分鐘。
(4) 以 10,000 x g, 4℃離心 2 分鐘，取上清液至微量離心管保存於-20℃。
11.3 RNA 電泳
(1) 取 1 μg 總 RNA 於微量離心管，並加入 10 μL denature buffer (15 mL Formamide, 0.6 mL Formaldehyde, 3 mL 10X 3-N-morpholino propanesulfonic acid (MOPS) ( Amresco), ethidium bromide (Sigma))。
(2) 放於 65℃乾浴槽上 15 分鐘。
16
(3) 將樣品置於冰上 10 分鐘。
(4) 準備 RNA 膠體 (1％ agarose, 75％ formaldehyde, 10％ MOPS buffer (20 mM MOPS, 5 mM sodium acetate (Merck), 1 mM ethylene diamietetraacetic acid (EDTA) (Merck), 0.01％ DEPC (pH 7)) 及電泳溶液(1％ MOPS)。
(5) 以 50 伏特電壓進行 40 分鐘電泳。
11.4 即時反轉錄聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)
使用 TAKARA BIOINC.的One step SYBR○R PrimeScriptTM RT-PCR Kit II(Prefect real time)(Cat.#RR086A)，並以 Stratagene MX3000PTM 機器進行即 時反轉錄聚合酶連鎖反應，所得結果利用MxPro QPCR Version 3.00 軟體進 行分析。針對即時反轉錄聚合酶連鎖反應對目標基因設計專一性引子 (附 表一)，並於適當的黏合溫度下進行片段的擴增。Real-time RT-PCR 反應組 成如下表所示，反應程序為42℃5 分鐘，95℃10 秒，95℃5 秒、60℃30 秒 循環數為40 個，95℃15 秒，60℃1 分鐘，95℃15 秒。
RNase-free H2O (0.1%DEPC) 8 μL 2XSYBR QRT-PCR buffer 4 12.5 μL 5’-primer 10 μM 1 μL 3’-primer 10 μM 1 μL ROX ref. dye II 0.5 μL RNA template 100ng 1 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 1 μL
Total vol 25 μL
進行real-time RT-PCR 偵測基因表現的結果，以 Ubiquitin 基因作為 internal control，利用 Ct 值計算出相對表現量 (Relative quantitation)，計算公式如下所示：
Target gene mRNA level/ Ubiquitin mRNA level = 2 - (Ct Target gene-Ct Ubiquitin) = 2 –ΔCt
17
結果
1. 機械性傷害對 OsSUT4、OsCIN1 及水稻單糖轉運蛋白 OsMST6 基因表現影響 於水稻TNG67 三葉齡幼苗之第三片葉身以剪刀進行刻傷處理，左右各剪 5 刀，並避開主脈，於同一時間點收取材料，不同時間點做刻傷處理，分別 收取對照組(沒刻傷處理)及刻傷後 15 分鐘、30 分鐘、1 小時和 12 小時之葉 身材料偵測 OsSUT4、OsCIN1 及 monosaccharide transporter (OsMST6)基因表 現變化量。結果顯示機械性傷害可誘導 OsSUT4 基因表現，其 mRNA 量於刻 傷處理15 分鐘後即有明顯提升，而在 30 分鐘可誘導 2.7 倍，到此誘導效應 於刻傷處理 1 小時後則漸緩(圖一)，此現象與本實驗室先前研究生蕭惠心 (2011)的結果相同。另外蔗糖分解酵素 OsCIN1 基因表現亦可受到刻傷誘導，
在刻傷處理30 分鐘後可誘導到 2.6 倍。OsMST6 亦會受到機械性傷害誘導，
在一小時可達誘導最高的11 倍，且 OsCIN1 及 OsMST6 基因受機械性傷害影 響之表現形式與 OsSUT4 相似，均於較長時間(例如 12 小時)被明顯表現量下 降。
2. 斜紋夜盜蟲對水稻蔗糖轉運蛋白的影響
斜紋夜盜蟲 Spodoptera litura 為一植食性昆蟲，會於葉片以啃咬方式為害 作物。在斜紋夜盜蟲(台大昆蟲系楊恩誠老師提供)三葉齡水稻餵養實驗中，
處理斜紋夜盜蟲 1 小時後 OsSUT4 的基因表現有誘導達 1.7 倍，而刻傷處理 組的為2 倍(圖二)。
3. 褐飛蝨對水稻蔗糖轉運蛋白的影響
褐飛蝨 Nilaparvata lugens 有別於一般鱗翅目害蟲，其對於水稻之危害位 於莖稈上，以刺吸式口器吸取水稻韌皮部中物質，為了瞭解其是否有別於一 般機械性傷害對蔗糖轉運蛋白基因的影響，將褐飛蝨(中興大學昆蟲系戴淑美 老師提供)共同培養於三葉齡水稻中 12 小時、24 小時、48 小時和 72 小時，
培養密度為每株水稻8 隻褐飛蝨。實驗中可發現褐飛蝨都主要停於莖稈部分，
18
莖稈部位 OsSUT1 和 OsSUT2、OsSUT4 兩者之基因表現有相反的表現趨勢，
OsSUT1 受到褐飛蝨危害時其基因表現會受誘導表現，其在褐飛蝨置入 72 小 時可達3.55 倍的表現量，而 OsSUT2 和 OsSUT4 基因表現則會受到褐飛蝨的 抑制，與對照組比較其降低一半左右的基因表現(圖三)。
4. 水稻內生糖含量對於刻傷逆境誘導 OsSUT4 基因表現影響
為了瞭解機械性傷害誘導的 OsSUT4 基因表現是否需要糖類的參與，因 此將水稻TNG67 三葉齡幼苗於黑暗中放置 48 小時，來降低其內生所含的總 糖量。黑暗 48 小時後水稻第三片葉身的糖含量下降到對照組的十分之一(圖 四A)。在 OsSUT4 基因表現上，會受到黑暗的處理下降 1.8 倍。在刻傷誘導 倍率上，對照組受到刻傷30 分鐘後，OsSUT4 基因表現可誘導 4.1 倍，而黑 暗48 小時的處理組受到刻傷為誘導 3.3 倍(圖四 B)。
5. 探討荷爾蒙是否參與機械性傷害誘導 OsSUT4 表現的調控機制 5.1 MeJA 相關探討
在刻傷逆境後茉莉酸生合成關鍵酵素的基因 OsAOS1 和 OsAOS2 會明 顯的受誘導，其基因表現量分別於 15 分鐘和 30 分鐘處理後明顯上升 25 倍和6.9 倍，於 1 小時後基因表現而下降(圖五 A、B)。以 Aspirin (Asp;抑 制Allene oxide synthase)( Pēna-Cortés et al ., 1993)前處理 12 小時，在進行 機械性傷害 30 分鐘後，對照組 OsSUT4 基因表現誘導達 3 倍，Aspirin 處 理組誘導0.8 倍。以外加 100 µM MeJA 處理 2 小時，OsSUT4 基因表現有 誘導0.8 倍的表現(圖五 C)。而在前處理 Aspirin 12 小時和處理 MeJA 試驗 組加上刻傷處理30 分鐘後，OsSUT4 基因表現可誘導 3.7 倍 (圖五 C)。
5.2 SA 相關探討
處理Salicylic acid (SA)於水耕杯中，隨著時間會有逐漸誘導基因表現的 趨勢，在處理1 小時後相對於對照組達誘導 2.5 倍，而在 2 小時後而逐漸下 降，到6 和 12 小時回到原來和對照組相同表現(圖六 A)。另由 OsOPR1 的 基因表現上，證實SA 的處理為一個有效的處理，明顯在 1 和 2 小時有誘導
19
表現(圖六 B)。
5.3 ABA 相關探討
為了解刻傷處理，對在Abscisic acid (ABA)生合成之影響，試驗中 ABA 生合成關鍵基因 OsNCED1 和 OsNCED2 基因表現，結果顯示兩個基因會被 刻傷誘導表現，其中以 OsNCED1 在受到刻傷後 15 分鐘就會被誘導，在 30 分鐘和1 小時誘導最高的誘導倍率 4.7 倍，而 12 小時回降至原來水平(圖七 A); OsNCED2 在 15 分尚無誘導表現，在 30 分鐘達最高誘導倍率 2.6 倍，
在1 小時呈現些微下降，至 12 小時則下降至比對照組還低的表現量(圖七 B)。OsDREB1F 會受到 ABA 誘導反應基因(Wang et al., 2008)，由刻傷後的 基因表現觀察到其在30 分鐘會有誘導倍率 412 倍的表現量(圖七 C)。外加 100 µM ABA 中，OsSUT4 的基因表現會隨著處理時間而有誘導表現，在 2 小時達誘導倍率1.4 倍的誘導(圖七 D)。OsRab16A 會對 ABA 產生反應而誘 導表現的基因(Hong et al., 2009)，其在 ABA 外加處理實驗中其基因表現也 有明顯的誘導表現達1775 倍(圖七 E)。前處理 Fluridon (Flu;ABA 生合成抑 制劑) 24 小時之後，在處理刻傷逆境處理，結果顯示前處理 Flu 下，機械性 傷害會誘導 OsSUT4 基因表現達誘導倍率 3 倍，對照組為誘導倍率 2.3 倍(圖 七F);另由 ABA 反應基因 OsDREB1F 基因表現結果，對照組可誘導 475 倍，
而在Fluridon 處理組的誘導倍率則降會 227 倍(圖七 G)。
5.4 乙烯相關探討
水稻葉身受到機械性傷害後，其乙烯相關生合成基因 OsACS1 在表現上 沒有明顯的變動情形(圖八 A)，而在 OsACS2 基因表現在 30 分鐘有達到 7.1 倍的誘導倍率(圖八 B)，同樣的 OsACO2 基因表現也會受到刻傷逆境誘導，
在1 小時達 8.1 倍的誘導倍率(圖八 D)，而在 OsACO1 表現則相反，其基因 表現會受到刻傷處理而有下降的趨勢(圖八 C)。在刻傷後乙烯的反應基因 OsERF3 會受到誘導，在 15 分鐘和 30 分鐘誘導倍率有 5.5 和 4.9 倍的誘導，
1 小時後則明顯下降，到 12 小時的基因表現比未刻傷處理組要低。為了知
20
道乙烯是否會影響 OsSUT4 基因表現，以外加 100 µM (Ethephon; ET 乙烯釋 放劑)於水耕杯中，並置放於密閉的生長箱中，觀察 OsSUT4 基因表現情形，
在結果中，乙烯的處理對於 OsSUT4 基因表現在 1 小時有 1.32 倍的誘導而 下降(圖八 F)，並以 OsOPR1 做為一個 ET 處理有效的指標基因，確認處理 為一個有效的處理(圖八 G)。以處理 2-Aminoisobutyric acid (AIB；抑制 ACC oxidase 產生乙烯) 100 µM 的材料做刻傷逆境，結果顯示在 10、100 µM AIB 前處理24 小時下分別有倍率 4.5 和 4.28 倍的誘導 OsSUT4 表現量，而對照 組有5 倍的誘導表現量(圖八 H)，在乙烯反應基因 OsERF3 基因表現受刻傷 的誘導倍率在對照組和10 μM、100 μM AIB 處理組分別為 8.5、7.5 和 7.6，
而隨著濃度的提升會去抑制刻傷處理 OsERF3 的基因表現(圖八 I)。
6. 過氧化氫(Hydrogen peroxide)在刻傷逆境中對 OsSUT4 基因表現的影響 為了探討在刻傷逆境中 OsSUT4 基因表現的誘導，是否會透有刻傷逆境 下所產生的H2O2進一步去誘導 OsSUT4 的基因表現，首先以 Diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB; 會與 H2O2形成褐色化合物)染色法觀察 H2O2表現位 置，可觀察到刻傷處有H2O2明顯累積情形(圖九 A)，表示 H2O2產生於刻傷 位置處，進一步以定量方式測定葉片中H2O2的含量，可發現葉身受刻傷後內 生的H2O2會有上升的趨勢(圖九 B)。為了降低在刻傷逆境下由 NADPH oxidase 所產生的 H2O2，以前處理Diphenyleneiodonium chloride; DPI 觀察刻 傷後30 分 DAB 染色情況，在有處理 DPI 組在 DAB 染色上較對照組來的淺(圖 九A)，在 H2O2定量上，在第0 分鐘 DPI 處理組有較高的 H2O2表現量，而在 受到刻傷後而下降，對照組則呈現上升趨勢(圖九 B)。由 DPI 處理結果可顯 示其可降低在刻傷後H2O2的產生量，進一步觀察DPI 處理組和對照組在刻 傷後 OsSUT4 基因表現情形，在 0 分鐘處理 DPI 組有相對於對照組要較高的 表現量，而15 分鐘沒有顯著的差異，在 30 分鐘 DPI 處理組相對於對照組有 較低的表現量(圖九 C)。
7. 受刻傷逆境 OsSUT4 基因啟動子之活性探討
21
以未轉殖株的TNG67 為材料，將葉身分為尖端和基部處理，於基部做刻傷 處理，來比較基部受到刻傷逆境後和自身尖端所誘導基因表現的倍率(附圖三)。
結果顯示在基部受到刻傷後30 分鐘 OsSUT4 基因表現相對於未受到刻傷的尖端 會有3.8 倍的誘導，而在沒有刻傷逆境組則沒有明顯的差異(圖十 A)。
由上述結果可將含有不同 OsSUT4 啟動子片段長度接有 GUS 報導基因的轉 植株為材料，探討受刻傷誘導的啟動子調控區域。先以real time RT-PCR 偵測各 轉植株GUS 報導基因的表現量，結果顯示在所使用的轉植株都有 GUS 基因的表 現，而在TNG67 的非轉殖株中則偵測不到 GUS 基因表現。(圖十 B)，並以上述 轉植株做為後續啟動子調控試驗。
為了探討 OsSUT4 的刻傷調控誘導機制位於的啟動子片段，由四個不同 OsSUT4 長度片段的啟動子接有 GUS 報導基因的轉植株為材料，由基部除上尖 端的GUS 基因表現，結果以倍率呈現(圖十一)。本實驗結果顯示由最長的啟動 子片段 POsSUT4(-802/-11)片段在刻傷處理後，受到刻傷的基部相對於未受刻傷 的尖端會有3.45~4.49 倍的誘導，POsSUT4(-483/-11)片段為 3.83~6.06 倍的誘導、
POsSUT4(-434/-11)片段 3.73~4.03 倍和最短片段 2~5.72 倍的誘導。而在基部沒有 處理刻傷逆境的GUS 基因表現倍率上，各轉植株中其倍率從最低 0.83 倍到最高 的1.64 倍(圖十二)。
22
討論
1. OsSUT4 在植物受機械性傷害反應中可能扮演的角色
由先前 OsSUT4 啟動子接上 GUS 報導基因的轉植株分析中，結果顯示，
OsSUT4 表現於根和葉片中的維管束韌皮部有表現專一性，在根部觀察到在 側根生長處，OsSUT4 啟動子具高活性。另外在花粉成熟過程中，pOsSUT4 啟動子亦有活性增強之現象(蕭,2011)。由阿拉伯芥的放射性標定碳源的研究 中，刻傷組織為一個sink 組織(Quilliam et al., 2006)。CIN 為位於靠細胞間 隙細胞壁上酵素，可將細胞間隙中蔗糖水解成兩個單糖，在水稻中發現 OsCIN1 基因表現在 sink 和 source 組織都有表現，而以 sink 組織較高，另外 在水稻開花授粉後也可觀察到 OsCIN1 的基因表現明顯的上升(Hirose et al., 2002)。另外在植物受到寄生性的病原菌危害時會對植物造成一個強烈的 sink 組織的產生，而去誘導 CIN 和 monosaccharide transporter;MST 的基因 表現，以提供sink 組織需求的碳源供給(Fotopoulos et al., 2003)。由水稻葉身 受到機械性傷害後的材料發現 OsCIN1 和 OsMST6 的基因表現會有顯著的誘 導表現(圖一)，此一結果也可以在阿拉伯芥受到機械性傷害後 AtSUC3 和 AtSTP4 基因表現誘導上有相同情形，OsMST6 研究中為一個位於細胞膜上具 有單糖轉運功能的蛋白質(Wang et al., 2008)，因此推測當水稻組織受到機械 性刻傷後，會透由 OsSUT4 將蔗糖轉運進入傷口處的細胞間隙，在藉由位於 細胞壁間隙的invertase 將蔗糖水解變成單糖型式，最後由位於細胞膜上的 單糖轉運蛋白 OsMST6 將單醣送進需要的細胞中，以提供受傷組織所要的碳 骨架和能量來源。
2. 醣分子對於刻傷誘導 OsSUT4 表現的探討
先前研究顯示，部分會受刻傷誘導的基因，會因有醣類分子的參與而有 誘導表現增強的趨勢(例如 PinI II、PR 和 LOX 基因等)(Sadka et al., 1994; Kim et al.,1991; Johnson and Ryan,1990) 。本研究結果發現，在黑暗 48 小時後水
23
稻植株體內的可溶性糖類含量明顯下降，而黑暗下受到機械性傷害仍會誘導 OsSUT4 基因表現的結果(圖四)，因此由此結果可推測醣類分子可能不會參 與在刻傷逆境促進 OsSUT4 的基因表現，而醣類分子存在下可以促進刻傷誘 導 OsSUT4 的基因表現。不過刻傷後。組織內部糖含量是否有變動，或是透 由別的器官組織轉供給碳源，來調控刻傷後 OsSUT4 的表現情形仍須進一步 對組織刻傷後偵測其醣類的變化情形。我們過去研究發現(蕭惠心, 2011)水 稻根系在生長過程中，根的 OsSUT4 的基因表現會受到 3%的蔗糖和葡萄糖 誘導;另外在水稻葉鞘組織中，在抽穗後葉鞘內的葡萄糖和蔗糖會有上升的 趨勢，其中葡萄糖和 OsSUT4 的基因表現有類似的趨勢(Chen and Wang 2008;
陳懷如, 2009)，推測 OsSUT4 基因表現受到刻傷後會透由 CIN 和 MST 的作 用，使得刻傷處單糖含量增加進而調控 OsSUT4 的表現(圖四)。
3. 機械性傷害、斜紋夜盜蟲和褐飛蝨對 SUT 影響的探討
本研究結果發現斜紋夜盜蟲在啃食水稻葉片後，OsSUT4 基因表現和刻 傷逆境都有誘導表現。本研究中刺吸式口器的昆蟲褐飛蝨，其為一刺吸口器 的水稻害蟲，處理水稻植株中 OsSUT1 基因表現隨著時間處理而上升，
OsSUT2 和 OsSUT4 則相反會受到褐飛蝨吸食而下降(圖三)，另外透由外加 JA 生合抑制劑、JA 對 OsSUT4 的誘導和刻傷下 AOS 基因表現變化，刻傷 對 OsSUT4 的基因表現促進可能會透由 oxylipins 的路徑去調控(圖五)。本實 驗材料以TNG67 品種為試驗對象，TNG67 為一個對於褐飛蝨敏感的品種，
不耐褐飛蝨的危害(曾,等 2003)，先前研究指出，在水稻褐飛蝨的抗性和不 具抗性品種的microarry 分析結果發現，在 JA 生合成路徑上相關基因之表現，
及關鍵生合成基因 AOS 的表現都為下降，而另一生合成酵素 OPR 的基因表 現在抗褐飛蝨品種中表現量會被誘導，而在不抗品種中表現則被抑制(Zhang et al., 2004)，同樣的在阿拉伯芥植株中，當受到同為刺吸式口器昆蟲－銀葉 粉蝨(Silverleaf whitefly)危害後，發現在上游 oxylipins 生合成路徑上 Fatty acid desaturase 和下游的 JA 反應的相關基因(如: PDF1.2)會有表現量下降的
24
趨勢(Zarate et al.,2007)，因此刺吸式口器昆蟲和刻傷逆境中對 OsSUT4 基因 表現的有所不同，可能原因為對於植物荷爾蒙JA 不同調控的影響而不同，
導致 OsSUT4 基因表現在一般機械性傷害和褐飛蝨危害下產生差異性。
褐飛蝨為韌皮部刺吸的昆蟲，以吸取韌皮部中養分為食物來源，，褐 飛蝨危害時推測其會降低韌皮部中糖類相關物質的含量(Khattab, 2007)。由 前人研究中，OsSUT1 的基因表現在種子發芽時期，發芽第一天會受到糖類 的抑制 (Chen et al., 2010)，推測在褐飛蝨處理下造成韌皮部中糖濃度的下降，
會進而促進 OsSUT1 基因表現。水稻種子胚中的 OsSUT2 和 OsSUT4 基因表 現會受到胚乳所提供的糖類分子誘導調控(陳, 2007; Siao et al., 2011)，本研 究在黑暗處理中對於 OsSUT4 基因表現也呈現一個下降趨勢(圖四 B)，因此 推測褐飛蝨會降低韌皮部中的糖含量而造成 OsSUT2 和 OsSUT4 基因表現下 降的趨勢。
4. 刻傷逆境下各荷爾蒙對 OsSUT4 表現的探討
由本試驗結果顯示刻傷逆境下會誘導JA、ABA 和 ET 植物荷爾蒙生合成 關鍵基因的表現(圖五 A、B;圖六 A、B;圖七 A、B、D)，另外從前人研究也 發現 SA 的生合成酵素 PAL 活性和基因表現都受到誘導(López-Gálvez et al.,1996; Mur et al.,2002)。另一方面在刻傷逆境下可以偵測到 OsAOS1 和 OsAOS2 的基因表現上升，可推測內生的 JA 含量為一個上升趨勢，另以 OsDREBF1 做為 ABA 的反應基因(Wang et al., 2008)，也可看到受到刻傷後也 有上升趨勢(圖七 C)，也以 OsERF3 的乙烯反應基因反映出內生乙烯變化(圖 八E)，可證明 JA、ABA 和乙烯在水稻受刻傷後上升的情況(圖五 A、B;圖七 C;圖八 E)。而在外加 JA、SA、ABA 和 ET 的直接外加處理中發現，OsSUT4 的基因表現都會受到上述四種荷爾蒙的直接外加而促進基因表現，ABA 和乙 烯誘導不明顯(圖五 C;圖六 A;圖七 D;圖八 F)。在前處理 JA、ABA 和乙烯三 種荷爾蒙生合成抑制劑後，處理刻傷實驗中，發現在外加 JA 生合成抑制劑 Aspirin 下，刻傷所促進 OsSUT4 的基因表現會有下降(圖五 F)。由 ABA 生合
25
成抑制劑處理加上刻傷實驗中，ABA 反應基因 OsDREB1F 會受到抑制劑 Fluridon 處理而降低刻傷所誘導表現，因此推測在刻傷逆境下抑制劑處理可 降低內生ABA 的產生(圖七 G)，而抑制劑處理組 OsSUT4 基因表現受刻傷誘 導的倍率和對照組一樣沒有下降，可說明刻傷不會透由 ABA 路徑去誘導 OsSUT4 的基因表現。乙烯抑制劑前處理試驗中，以 OsERF3 基因表現可反應 出內生的乙烯會有下降的趨勢，同樣也會降低刻傷所誘導 OsERF3 的基因表 現，推測可降低刻傷所誘導的乙烯產生(圖八 I)，而 OsSUT4 的誘導倍率隨著 抑制劑 AIB 上升只有些微下降(圖八 H)。因此水稻受到刻傷逆境後可能會透 由JA 路徑去促進 OsSUT4 的基因表現。先前研究指出 SA 可以作為植物體內 訊息傳導調控的因子，調控體內氧化逆境程度而產生相關對生物性逆境的反 應。當病原菌侵襲植物後，可以觀察到在感染部位會有SA 的累積(Yang et al., 2004)，而 SA 會抑制植物體中 Catalase 酵素活性，造成植物體中 H2O2增加，
進一步調控systemic acquired resistance (SAR)反應，以增加植物對生物性逆境 的防禦反應(Guo et al., 2007; Chen et al., 1993)。而本試驗中 OsSUT4 基因表現 在外加 SA 後 有促進表現的趨勢(圖五)，推測可能透由 SA 去抑制 Catalase 酵素活性而使H2O2的含量上升，最後使 OsSUT4 的基因表現上升(圖九)。
ABA 和乙烯的外加處理會誘導 OsSUT4 的基因表現(圖六 D;圖七 E)，Chen 及 Wang (2012)利用抽穗前的水稻葉鞘處理 100 µM ABA，結果 OsSUT1、
OsSUT2 和 OsSUT4 都會有促進表現調控的情況。乙烯對蔗糖轉運蛋白的研究 中，目前已知在馬鈴薯中，處理ethephon 會促進 StSUT4 的表現(Chincinska et al., 2008)。
5. 刻傷逆境下 H2O2對 OsSUT4 基因表現的影響探討
本研究以DAB 定性染色法和四氯化鈦法定量，偵測水稻葉身受到機械 性傷害後 H2O2位置和其變化量。結果顯示刻傷處明顯的DAB 染色呈現(圖 九 A)，並且由定量結果進一步確實 H2O2呈現上升趨勢(圖九 B)，本結果和 OROZCO-CARDENAS (1999)在馬鈴薯、玉米、棉花、豌豆和黃瓜葉片中都
26
有一樣結果。NADPH oxidase 的抑制劑 DPI 前處理確實可抑制刻傷 30 分鐘 後H2O2產生的量，由基因表現 OsSUT4 在 DPI 處理組，在刻傷後基因表現 的促進情形較於對照組要來的低，因此推斷在刻傷逆境會透由誘導 H2O2產 生而去促進 OsSUT4 基因表現(圖九)。
在刻傷逆境下會有刻傷荷爾蒙JA 生合成大量產生(Abraham and Gregg 2009)，而當植物外加 MeJA 處理或是遭受到昆蟲咬食逆境會去促進 H2O2的 產生(OROZCO-CARDENAS et al., 2001; Shivaji et al., 2010)，推測刻傷逆境 下水稻可透由JA 的生合成增加去促進 NADPH oxidase 產生 H2O2，並促進 OsSUT4 基因表現的上升。
6. 受到刻傷逆境調控的 OsSUT4 啟動子區域探討
Ibraheem 等人(2010)根據現有資料庫 Plant CARE、PLACE、Genomatix Matinspector professional 分析阿拉伯芥 9 個蔗糖轉運蛋白和水稻 5 個蔗糖轉 運蛋白基因的啟動子序列，分析上游-1 ~ -1500 的 cis-acting element 的可能 調控的序列。由根據National Center for Biotechnology Information(NCBI)資 料顯示，以 OsSUT4 轉譯起始點 ATG 的 A 為+1，到上個基因的轉譯終止的 TGA 的 A，中間的核甘酸長度為 848 的核甘酸，並將此長度定為 OsSTU4 的啟動子全長。而在本研究中發現外加JA、SA、ABA 和 ET 皆會促進 OsSUT4 基因表現，由資料預測結果可以看到確實有許多調控 JA、SA 和 ABA 的 cis-acting element，如 ABRE、MYC、Me-JA motif 和 GT-1(附圖二)。
本試驗啟動子 POsSUT4(-802/-11)到最短片段 POsSUT4(-248/-11)仍會有 刻傷誘導 GUS 報導基因的表現(圖十一)，由根據 Ibraheem 等人(2010)的整理 分析，發現在 OsSUT4 啟動子 848 長度中，確實有 5 個受刻傷逆境誘導的 cis- acting element－W-box，一直到本試驗 POsSUT4(-248/-11)最短片段仍含有 1 個W-box cis-acting element，因此仍須以更短片段啟動子的轉植株去做進一 步確認。而在 POsSUT4(-248/-11)長度片段中也包含一段 MeJA motif 的 cis-acting element，由前面結果顯示刻傷逆境會透由 JA 生合成去調控下游的
27
OsSUT4 基因表現，因此 MeJA motif 在刻傷下的調控仍須進一步確認。
7. 結語與未來展望
本研究為了了解刻傷逆境下水稻對於 OsSUT4 促進表現的調控機制，和 不同於一般機械性傷害的褐飛蝨危害對 SUT 的影響，及可能在啟動子上調 控的區間，因此利用荷爾蒙的外加和生合成抑制劑的前處理偵測 OsSUT4 的 基因表現，並以五個不同長度片段 OsSUT4 啟動子接上 GUS 報導基因來探 討受刻傷後誘導 OsSUT4 的區間。結果顯示(圖十三): (1)機械性刻傷會促進 OsSUT4 基因表現及啟動子的活性;(2)斜紋夜盜蟲的咬食亦會提升 OsSUT4 的 表現;(3)刺吸式口器－褐飛蝨對 OsSUT4 的基因表現為一個抑制作用;(4)刻傷 主要會透由JA 路徑去調控 OsSUT4 基因表現;(4)刻傷逆境所造成 OsSUT4 促 進的現象，H2O2亦會參與其中;(5)OsSUT4 受到刻傷的促進調控的啟動子區 域在-248 仍有活性。
未來會進一步探討的問題有:(1)目前實驗室有 pOsSUT4(-194/-11) 和 POsSUT4(-139/-11)片段轉殖株，以更短片段的啟動子驅動 GUS 的轉植株，
去找出刻傷調控的啟動子序列;(2)OsSUT4 在刻傷逆境下的功能;(3)褐飛蝨對 於 OsSUT4 基因表現抑制作用的調控機制和對刺吸式昆蟲的關係;(4)刻傷誘 導 OsSUT4 表現的組織。
28
圖一、水稻三葉齡幼苗第三片葉受機械性刻傷後 OsSUT4、OsCIN1 及 OsMST6 基因表現分析。以三葉齡水稻為材料，以剪刀對第三片葉身做機械性傷害。並利 用real-time RT-PCR 測定 OsSUT4 基因(A)、OsCIN1 基因(B) 及 OsMST6 基因(C) 表現。Control 組為沒有處理刻傷材料。結果為獨立生物性和技術性三重複之平 均值，誤差值以standard error (S.E.) 表示。MST:monosaccharide transporter;CIN cell wall invertase。
29
圖二、水稻三葉齡幼苗受到機械性刻傷和夜盜蟲餵食處理之 OsSUT4 基因表現之 比較分析。以水稻三葉齡為材料餵食夜盜蟲，密度為10 隻/株，在餵食夜盜蟲 1 小時後收取材料，並利用real-time RT-PCR 測定基因表現。結果為一重複。Control:
為沒有處理;Wounding:為刻傷處理組;Insect:夜盜蟲處理組。
30
圖三、水稻三葉齡幼苗莖部經褐飛蝨餵食處理後 OsSUT1、OsSUT2 及 OsSUT4 基因之個別表現分析。以三葉齡水稻為材料餵食蟲齡為二~三齡之褐飛蝨(BPH) 若蟲，密度為8 隻/株。並利用 real-time RT-PCR 測定 OsSUT1 基因(A)、OsSUT2 基因(B)及 OsSUT4 基因(C)表現。結果為三重複之平均值，誤差值以 standard error (S.E.) 表示。Control:為沒有褐飛蝨餵養處理;BPH: brown planthopper。
