第三章 實驗結果
3. 嘗詴由菇類 cDNA 中以退化性引子擴增出藍光受器部分片段
3.1.選殖香菇的 LephrA
以香菇 cDNA 為模板，使用引子 LephrA-full-F 與 LephrA-full+stop codon-R 夾取 LephrA 全長，結果如圖二十一(A)所示，但因擴增產物的量少，加上全長 為 2,775 bp，再將全長片段純化進行 TA 選殖時的效率很低，所以改以使用引子 LephrA-full-F 與 phrA-PAS-F 擴增 LephrA 近 5’端的前半段，大小為 1,440 bp，
引子 LephrA-F 與 LephrA-full+stop codon-R 擴增 LephrA 近 3’端的前後半段，大 小為 1,494 bp，前後兩段有 159 bp 的重疊區域，使用 Bioedit 將兩段串接後得到 本研究使用的香菇之 LephrA 全長序列，以 photorecptor A 稱之，與已發表之 LephrA 序列比對如圖二十二所示。
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圖二十一 由香菇的 cDNA 選殖 LephrA 與 LephrB
(A) LephrA：模板為香菇的 cDNA 與引子為 LephrA-full-F、LephrA-full+stop codon-R 的 PCR 產物，將電泳膠片上約 3 kbp 的目標產物處切下純化。1：目標 產物 LephrA 切膠純化所得產物。(B) 1：模板為香菇的 cDNA 與引子為
Lephrb-full-F、LephrB-full+stop codon-R 的 PCR 產物。
Figure 21. Cloning of LephrA and LephrB from L. edodes’ cDNA.
(A) LephrA：PCR results and the target fragment cutting of LephrA from L. edodes’
cDNA by using primers LephrA-full-F and LephrA-full+stop codon-R. Lane 1: Gel extracting product of LephrA (B) Lane 1: PCR results of LephrB from L. edodes’
cDNA by using primers LephrB-full-F and LephrB-full+stop codon-R.
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圖二十二 LephrA 與本研究選殖之 photoreceptor A 之序列比對 Figure 22. The sequence alignment of LephrA and photoreceptor A
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圖二十二(續) LephrA 與本研究選殖之 photoreceptor A 之序列比對
Figure 22.(Continued) The sequence alignment of LephrA and photoreceptor A
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3.2.選殖香菇的 LephrB
以香菇 cDNA 為模板，使用引子 LephrB-full-F 與 LephrB-full+stop codon-R 夾取 LephrB 全長，結果如圖二十一(B)所示，將約 900 bp 的產物純化後進行 TA 轉殖法，定序得到本研究使用的香菇之 LephrB 全長序列，以 photorecptor B 稱 之，其與已發表之 LephrB 比對如圖二十三所示。
限制酶截切後的 vector: pET-21a(+)與 insert: BamHI-photoreceptor B-HindIII 如圖二十四所示，黏合建構質體使用大腸桿菌 BL21 (DE3)表現之 Photoreceptor B -His × 6 ， 在 150 mL 培 養 液 中 以 IPTG 誘 導 生 產 ， 並 使 用 ProBondTM Nickel-Chelating Resin 純化後，所得蛋白質濃度約在 0.2 mg/mL，其蛋白質電泳 圖與以 6His 單株抗體進行的西方墨點法結果如圖二十五所示。
3.3.Photoreceptor B-His x6 功能測詴
香菇、金針菇、鮑魚菇、美白菇與雞腿菇的菌絲液加入 Photoreceptor B-His x6 後以黑暗與光照環境培養 7 天，圖二十六顯示菌絲狀況，黑暗與光照環境的 菌絲狀況沒有差異，沒有預期的色素產生。
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圖二十三 LephrB 與本研究選殖之 photoreceptor B 之序列比對 Figure 23. The sequence alignment of LephrB and photoreceptor B
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圖二十四 vector: pET-21a(+)與 insert: BamHI-photoreceptor B-HindIII 限制酶截切 結果
Figure 24. The results of vector: pET-21a(+) and insert: BamHI-photoreceptor B-HindIII digested by BamHI and HindIII
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圖二十五 (A)各純化分劃的本研究選殖表現之 Photoreceptor B-His x6 蛋白質電 泳圖與(B)西方墨點圖
Figure 25. (A) The SDS-PAGE of Photoreceptor B-His x6 from different elution fraction (B) The western-blot of Photoreceptor B-His x6 from different elution fraction by anti-His x6 monoclonal primary antibody and goat anti-mouse IgG-AP conjugate secondary antibody
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圖二十六 香菇、金針菇、鮑魚菇、美白菇與雞腿菇的菌絲液加入 Photoreceptor B-His x6 後黑暗與光照環境處理結果
Figure 26. The mycelia condition of L. edodes, F. velutipes, P. ostreatus, H.
marmoreus variant and C. comatus after adding Photoreceptor B-His x6 and incubating in dark and light environment.
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3.4.金針菇中選殖結果
使用引子 dp-F/R、dp-1-F/R、dp-1-F/dp-2-R、dp-2-F/dp-1-R 對模板金針菇 cDNA 進行 PCR，結果如圖二十七所示。引子 dp-F/R 進行 PCR 結果未有專一 的擴增產物；引子 dp-1-F/R 的擴增產物為約 1.4 kbp、700 bp 與 350 bp，三個片 段分別切膠純化進行定序分析後，皆非屬於 PAS domain 之序列；引子
dp-1-F/dp-2-R 的擴增產物在 600 bp~900 bp 之間，將此範圍擴增產物切膠純化進 行定序分析，所得 661、747、765、779、812 與 932 bp 皆不屬於 PAS domain；
引子 dp-1-F/R 的擴增產物為約 400 bp，定序後得知為 420 bp，序列如圖二十八 所示，轉譯成 140 個胺基酸後，與香菇、裂褶菌(S. commune)、布拉克鬍鬚黴(P.
blakesleeanus)與灰蓋鬼傘中已發表的 WC-1 同源藍光受器分別具 28%、28%、
24%與 31%相同度，胺基酸序列比對如圖二十九所示，使用網站為 NCBI 的 Constraint-based Multiple Alignment Tool
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink。
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圖二十七 使用引子(A)dp-F/R、(B)dp-1-F/R、(C)dp-1-F/dp-2-R、(D)dp-2-F/dp-1-R 對模板金針菇 cDNA 進行 PCR 的結果
Figure 27. The PCR results for first strand cDNA of F. velutipes by using primers (A)dp-F/R、(B)dp-1-F/R、(C)dp-1-F/dp-2-R、(D)dp-2-F/dp-1-R
圖二十八 使用引子 dp-2-F/dp-1-R 對模板金針菇 cDNA 進行 PCR 所得 420 bp 序 列，以 FV-cDNA-dp21-420 bp 稱之
Figure 28. The sequence of FV-cDNA-dp21-420 bp
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圖二十九 FV-cDNA-dp21-420 bp 轉譯之胺基酸與香菇、裂褶菌、布拉克鬍鬚黴 與灰蓋鬼傘中已發表的 WC-1 同源藍光受器之比對圖
Figure 29. The multiple alignment for the translation of FV-cDNA-dp21-420 bp and the WC-1 homologs of L.edodes (BAF56991)、S. commune (XP_993928974)、P.
blakesleeanus (ABB77844)、C. coprinus (XP_001832659) (Constraint-based Multiple Alignment Tool on NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink )
67 中聚合酶作用的誤差。Sano 等人以南方雜合法(southern blot)分析 LephrA 在香 菇菌株 FMC2 (48)基因組 DNA 的拷貝數與分布情形，發現以探針偵測分別被限 制酶 AvaI、SmaI 與 XhoI 截切之 DNA 片段中，三組都只各有一個片段有訊號，
顯示在香菇菌株 FMC2 中 LephrA 應該只有一個拷貝數，所以不會是因為在基 因組中有多個拷貝數而造成序列有所差異。