嘗詴由菇類基因體中以專一性引子擴增出藍光受器部分片段

參考 NCBI 網站中擔子菌香菇與灰蓋鬼傘的藍光受器 LephrA、LephrB 與 dst1 的基因序列，設計能擴增出其保守性區域 PAS domain 的專一性引子

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圖七 引子 LephrA-F/R 與 LephrB-F/R 確認結果

Figure 7. Confirmation of the primer LephrA-F/R (A)and LephrB-F/R (B).

Le-LephrA and Le-LephrB are represented the sequences which are amplified by using primers LephrA-F/R and LephrB-F/R. Le.LephrA and Le.LephrB PAS domain are represented the published nucleotide sequences of the PAS domains in L. edodes.

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圖八 引子 dst1.1-F/R 與 dst1.2-F/R 確認結果

Figure 8. Confirmation of the primer dst1.1-F/R (A)and dst1.2-F/R (B). Cc-dst1.1 and Cc-dst1.2 are represented the sequences which are amplified by using primers

dst1.1-F/R and dst1.2-F/R. Cc.dst1 PAS domain 1and 2 are represented the published nucleotide sequences of the PAS domains in C. cinerea.

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1.2.本研究選殖之 LephrB：photoreceptor B 在基因組中 exon 與 intron 的分布

使用引子 LephrB-full-F/ R，以香菇基因組為模板的 PCR 結果如圖九所示。

PCR 所得序列以 GD-photoreceptor B 稱之，表示由基因組 DNA 中 (genomic DNA, GD)選殖，CDS-photoreceptor B 表示由 cDNA 中選殖的片段，CDS 表式 轉譯區(coding region, CDS)，序列比對如圖十所示，圖十一為卡通圖表示 exon 與 intron 的分布。

圖九 使用引子 LephrB-full-F/LephrB-full-R，以香菇基因組為模板的 PCR 結果 Figure 9. The PCR result for genomic DNA of L. edodes using primers LephrB-full-F/R.

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圖十 photoreceptor B 在基因組中 exon 與 intron 的分布

CDS-photereceptor B 表示本研究選殖之 photoreceptor B 轉譯區，GD-photereceptor B 表示本研究中 photoreceptor B 在基因組中 exon 與 intron 的分布狀況

Figure 10. The distribution of exon and intron of photoreceptor B in the genome

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圖十一 本研究選殖 photoreceptor B 之 exon 與 intron 分布的示意圖 Figure 11. Schematic represention od the distribution of exon and intron of photoreceptor B in the genome

1.3.金針菇的選殖結果

先以 gradient PCR 找出四組引子以金針菇 genomic DNA 為模板時，各組引 子的最適 PCR 黏合溫度後(表三)，其中三組引子有放大產物，引子 LephrA-F/R 在 PCR 後放大出三個主要 DNA 片段，大小分別在約 1.2 kbp、800 bp 與 400 bp 左右，如圖十二(A)所示，將這些片段純化後定序分析，得知 DNA 片段確實大 小分別為 1,255 bp、837 bp 與 402 bp，這些片段以軟體 BioEdit 轉譯成胺基酸後 於 NCBI 資料庫中進行 Blast，並未比對到目標序列。

引子 LephrB-F/R 在黏合溫度降至 48℃後，仍無明顯放大產物；引子 dst1.1-F/R 在黏合溫度為 54℃時有明顯產物，如圖十二(B)所示，定序得知大小 為 811 bp，以相同方法分析其轉譯胺基酸後，並無比對成功。

引子 dst1.2-F/R 則在在黏合溫度 50℃能擴增出明顯 DNA 片段如圖十二(C) 所示，定序得 718 bp 與 308 bp，但分析比對後依然未成功。

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圖十二 (A) 以 LephrA-F/R 為引子對金針菇 genomic DNA 進行 PCR 之結果(B) 以 dst1.1-F/R 為引子對金針菇 genomic DNA 進行 PCR 之結果(C) 以 dst1.2-F/R 為 引子對金針菇 genomic DNA 進行 PCR 之結果

Figure 12. (A) Lane 1: PCR result for genomic DNA of F. velutipes using primers LephrA-F/R. (B) Lane 2: PCR result for genomic DNA of F. velutipes using primers dst1.1-F/R. (C) Lane 3: PCR result for genomic DNA of F. velutipes using primers dst1.2-F/R.

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1.4. 鮑魚菇的選殖結果

四組引子以鮑魚菇 genomic DNA 為模板的最適 PCR 反應黏合溫度如表二 所示，其中三組引子能放大出產物，LephrA-F/R 引子在 PCR 反應後放大出三個 主要片段，大小分別約在 2.5 kbp、1.6 kbp 與 800 bp 左右，如圖十三(A)所示，

因已知真菌藍光受器中 PAS domain 的 DNA 片段大小範圍在 350 bp ~400 bp 間，

所以具此推估大於 400 bp 太多的 PCR 擴增片段不會屬於 PAS domain，便只將 約 800 bp DNA 片段純化後定序分析，確認 DNA 片段大小為 838 bp，Blast 此 序列轉譯成的胺基酸序列後，並未比對到目標序列。

引子 LephrB-F/R 在黏合溫度降至 48℃後，仍無明顯放大產物；引子 dst1.1-F/R 擴增出的產物如圖十三(B)所示，定序得知大小為 444 bp，是由 dst1.1-F 做為3’與 5’端的引子而擴增出的產物，在 NCBI 網站上 Blast 其轉譯胺基酸(圖 十四)後，發現與擔子菌 S. commune 的 XP_003028059 蛋白質的保守性區域 DSP_MapKP (N-terminal regulatory rhodanese domain of dual specificity phosphatases (DSP), such as Mapk Phosphatase.)有相似性，比對結果如圖十四所 示，有 41%相似性，但是並非本實驗所要釣取的藍光受器之部分序列。

引子 dst1.2-F/R 能擴增出明顯 DNA 片段如圖十三(C)所示，定序得 729 bp 片段，但仍未比對到目標序列。

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圖十三 (A) 以 LephrA-F/R 為引子對鮑魚菇基因體 DNA 進行 PCR 之結果(B) 以 dst1.1-F/R 為引子對鮑魚菇基因體 DNA 進行 PCR 之結果(C) 以 dst1.2-F/R 為引 子對鮑魚菇基因體 DNA 進行 PCR 之結果

Figure 13. (A) Lane 1: PCR result for genomic DNA of P. ostreatus using primers LephrA-F/R. (B) Lane 2: PCR result for genomic DNA of P. ostreatus using primers dst1.1-F/R. (C) Lane 3: PCR result for genomic DNA of P. ostreatus using primers dst1.2-F/R.

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圖十四 (A) 以 dst1.1-F/R 為引子對鮑魚菇 genomic DNA 進行 PCR 之放大片段定 序後轉譯成的氨基酸序列，以 Po-GD-dst1.1-F 稱之(B) 於 NCBI 網站上 Blast 之 結果

Figure 14. (A) Deduced amino acids of PCR products for P.ostreatus, Po-GD-dst1.1-F, amplified by using primers dst1.1-F/R. (B) The blast results in NCBI website. Query:

A part sequences of Po-GD-dst1.1-F；Subject: A part sequences of XP_003028059

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1.5. 美白菇的選殖結果

以美白菇基因體 DNA 為模板時只有 LephrB-F/R 與 dst1.1-F/R 兩組引子能 擴增出產物(圖十五)，定序後片段大小分別為 808 bp 與 857 bp、357 bp，引子 dst1.1-F/R 放大出的 857 bp 經分析後，發現此片段是由 dst1.1-F 做為 3’與 5’端 的引子而擴增出的產物，以軟體 BioEdit 將序列轉譯為胺基酸後進行 Blast，其 部分序列與灰蓋鬼傘之 XP_001837065 之保守性區域 RNRR2 (Ribonucleotide Reductase, R2/beta subunit, ferritin-like diiron-binding domain)具 88%相同度，比 對結果如圖十六所示。而另外兩段序列未比對到目標序列。

1.6.雞腿菇的選殖結果

以雞腿菇 genomic DNA 為模板時只有 LephrA-F/R 此組引子能擴增出產物 (圖十七)，定序後片段大小分別為 758 bp，以前述方法將序列分析比對，結果 未比對到目標序列。

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圖十五 (A) 以 LephrB-F/R 為引子對美白菇基因體 DNA 進行 PCR 之結果(B) 以 dst1.1-F/R 為引子對美白菇基因體 DNA 進行 PCR 之結果

Figure 15. (A) Lane 1: PCR result for genomic DNA of H. marmoteus variant using primers LephrB-F/R. (B) Lane 2: PCR result for genomic DNA of H. marmoteus variant using primers dst1.1-F/R.

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(A)

(B)

圖十六 (A) 以 dst1.1-F/R 為引子對美白菇 genomic DNA 進行 PCR 之放大片段定 序後轉譯成的氨基酸序列，以 HmV-GD-dst1.1-F 稱之。(B) DNA 片段

HmV-GD-dst1.1-F 於 NCBI 網站上 Blast 之結果。

Figure 16. (A) Deduced amino acids of PCR products for H. marmoteus

variant ,HmV-GD-dst1.1-F, amplified by using primers dst1.1-F/R. (B) The blast results in NCBI website. Query: A Part sequences of HmV-GD-dst1.1-F；Subject: A Part sequences of XP_001837065.

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圖十七 以引子 LephrA-F/R 對雞腿菇 genomic DNA 進行 PCR 之結果 Figure 17. Lane 1: PCR result for genomic DNA of C. comatus using primers LephrB-F/R.

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