表格 1. 抗人類 α9 nAchR scFv 噬菌體基因庫篩選效價
Short linker Long linker Elution titer
54
表格 2. 抗人類 α9 nAchR scFv 輕鏈變異區 (VL) 定序結果分類 Anti-human α9 nAchR scFv VL
The sum of the same clones /the sum of clones (%)
The same sequence clones
2/16 (12.5%) S1、S2
4/16 (25%) S4、S5、S9、S12
2/16 (12.5%) S7、S11
1/16 (6.25%) S8
1/16 (6.25%) S10
2/16 (12.5%) S13、S15
1/16 (6.25%) S14
3/16 (18.74%) L6、L7、L9
55
表格 3. 抗人類 α9 nAchR scFv 重鏈變異區 (VH) 定序結果分類 Anti-human α9 nAchR scFv VH
The sum of the same clones /the sum of clones (%)
The same sequence clones
2/16 (12.5%) S1、S2
4/16 (25%) S4、S5、S9、S12
2/16 (12.5%) S7、S11
1/16 (6.25%) S8
1/16 (6.25%) S10
2/16 (12.5%) S13、S15
1/16 (6.25%) S14
3/16 (18.74%) L6、L7、L9
56
(A)
(B)
圖表 1. 於每輪篩選之抗人類 α9 nAchR scFv 噬菌體基因庫中隨機挑 選之質體 DNA
於每輪篩選後隨機挑選 15 株菌分別培養後抽取純化其質體 DNA，以 1% agarose 電泳分析其大小確認質體 NDA 中是否有 scFv 基因。(A) short linker scFv 質體 DNA；(B) long linker scFv 質體 DNA；
Lane M: marker；lane 1~15: 隨機挑選之質體 DNA；lane 16: 正控制 組
57
(A)
(B)
圖表 2. 抗人類 α9 nAchR scFv 基因轉型至 Top 10F’大腸桿菌的結果 將第四次篩選完成後富化的質體 DNA 基因庫以電穿孔轉殖入 Top 10F’ 大腸桿菌後隨機挑選 15 株菌分別培養後 純化其質體 DNA，以 1 % agarose 電泳分析其大小確認是否有轉型成功。(A) short linker scFv 質體 DNA；(B) long linker scFv 質體 DNA；Lane M:
marker；lane 1~15: 隨機挑選之質體 DNA；lane 16: 正控制組
58
(A) (B)
59
圖表 3. 以 Top 10F’大腸桿菌表現抗人類 α9 nAchR scFv
以 IPTG 誘導 Top 10F’大腸桿菌表現 scFv 約 16 小時後以超音波 破菌後取上清液以 SDS-PAGE (A) 和西方墨點法 (B) 測試大腸桿菌 是否有表現 scFv。一級抗體 mouse anti-His IgG 以 1:3,000 稀釋以室 溫反應 1 小時後用二級抗體 HRP conjugated rabbit anti-mouse IgG 以 1:5,000 稀釋室溫反應一小時後以 DAB 呈色
60
圖表 4. 利用酵素結合免疫分析法 (ELISA) 測試抗人類 α9 nAchR scFv 結合重組 α9 nAchR 之能力
於 96 盤中分別加入重組人類 α9 nAchR 片段以及作為負控制組的 BSA 後以 scFv 作為一級抗體稀釋 100、300、1,000 倍測試 scFv 是否 具有抗原辨識能力。並以四次免疫過的 IgY 稀釋 1,000、3,000、10,000
61
倍作為正控制組以及 L15 scFv 作為負控制組。之後加入二級抗體 goat anti-chicken light chain IgG 3,000 倍稀釋和三級抗體 HRP-conjugated donkey anti-goat IgG 5,000 倍稀釋後以 TMB 呈色再以 1 N HCl 終止反 應最後測 OD 450 nm
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圖表 5. 利用西方墨點法 (Western blot) 測試抗人類 α9 nAchR scFv
結合重組α9 nAchR 之能力
將重組人類α9 nAchR 片段做完 SDS-PAGE 後轉漬到 NC paper 上 以 scFv 作為一級抗體稀釋 100 倍測試 scFv 是否具抗原辨識能力。並 以四次免疫過的 IgY 稀釋 3,000 倍作為正控制組以及用 L15 scFv 作為 負控制組。之後加入二級抗體 goat anti-chicken light chain IgG 3,000 倍稀釋和三級抗體 HRP-conjugated donkey anti-goat IgG 5,000 倍稀釋 後以 DAB 呈色。Lane M：marker；lane Ag：重組 α9 nAchR 片段。
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(A)
(B)
圖表 6. 抗人類 α9 nAchR scFv 之序列分析
重 鏈 變 異 區 (VH) 和 輕 鏈 變 異 區 (VL) 胺 基 酸 序 列 和 雞 隻 germline 抗體變異區序列的比較。(A)輕鏈變異區序列；(B)重鏈變異 區序列；“－“代表和 germline 胺基酸相同；FR：framework region；
CDR：complementary determing region
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圖表 7. Ni+ Sepharose 純化抗人類 α9 nAchR scFv 之結果
Lane M：marker；lane 1：和 Ni+ Sepharose 結合後之上清液；lane 2: 第一次清洗；lane 3：第二次清洗；lane 4：第一次沖提；lane 5：
第二次沖提；lane 6：沖提後之 Ni+ Sepharose
65
(A)
(B)
圖表 8. 利用西方墨點法測試抗人類 α9 nAchR scFv 結合 MDA-MB -231 細胞蛋白中原生 α9 nAchR 之能力
將 MDA-MB-231 細胞蛋白做完 SDS-PAGE 後轉到 NC paper 上以 scFv 作為一級抗體稀釋 100 倍測試 scFv 是否具抗原辨識能力。之後 加入二級抗體 goat anti-chicken light chain IgG 3,000 倍稀釋和三級抗 體 HRP-conjugated donkey anti-goat IgG 5,000 倍稀釋後以 ECL 呈色照 相 (A) 後 再 以 DAB 呈 色 (B) 。 Lane M ： marker ； lane Ag ： MDA-MB-231 細胞蛋白。
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S1 S8 S9
S10 S11 S13
L9 IgY AI
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圖表 9. 利用流式細胞儀分析抗人類 α9 nAchR scFv 結合 MDA-MB -231 細胞上原生 α9 nAchR 之能力
用 100 倍稀釋 scFv 作為一級抗體和 MDA-MB-231 細胞和 HEK293 細胞作用半小時後再以 100 倍稀釋 goat anti-chicken light chain IgG 作 為二級抗體作用半小時，最後用 100 倍稀釋三級抗體 FITC-conjugated rabbit anti-goat IgG 作用半小時後以流式細胞儀檢測。
68
(A)
(B)
圖表 10. 以 MTT 方法測試抗人類 α9 nAchR scFv S1 抑制 MDA-MB- 231 細胞生長之能力
用經純化及透析過之不同濃度抗人類 α9 nAchR scFv S1 處理 MDA-MB-231 乳癌細胞 1 到 7 天後以 MTT 處理 2 小時後再用 DMSO/
酒精回溶後測定 OD 560 nm (A) 並以控制組為基準計算出各濃度組 別之百分比 (B) (n=4)。