一. 緒論
1. 論文評述
(1) 尼古丁型乙醯膽鹼受器 (nicotinic acetylcholine receptor,
nAchR) 簡介
nAchR 是一種具有神經傳導物質受體及鈣離子孔道功能的膜蛋
白。在分類上可分成兩種，一種是由 α7 到 α10 形成同源五聚體
(homopentamer) 的 α 銀 環 蛇 毒 素 (α-bungarotoxin) 結 合 型 nAchR(Elgoyhen, et al., 1994)。另一種則是由 α1 到 α6 次單元和 β2 到 β4 次單元組成的異源五聚體(heteropentamer) 的 α 銀環蛇毒素非結合 型 nAchR(Lindstrom, 1997) ， 這 兩 種 nAchR 都 會 和 乙 醯 膽 鹼 (acetylcholine) 或是尼古丁 (nicotine) 結合(Elgoyhen, et al., 1994)。
nAchR 除了在神經系統上會表現在，其它像是內皮細胞、膠質細胞、
免疫細胞、角質細胞以及腸胃道、肺、膀胱、結腸、乳腺組織也有 nAchR 的表現(Minna, 2003)。
在功能方面，神經系統上的nAchR具有增加神經細胞興奮及加強 突觸傳導的功能(McGehee, et al., 1995)；不過在其它組織上則不具有 這類功能，究竟其詳細功能為何至今仍不完全清楚(Minna, 2003)，但
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有研究指出α 9 nAchR和角質細胞黏貼(Nguyen, et al., 2000)、免疫反 應(Luebke, et al., 2005)、神經生理痛(Vincler, et al., 2006)有關。此外也 有研究指出，在尼古丁誘導下，nAchR會增加癌細胞增生及侵入、加 強血管新生(Dasgupta and Chellappan, 2006)及抑制細胞凋亡(Jin, et al., 2004)的功能。所以nAchR的過度活化是跟癌症形成有關的。其中，α7 nAchR和肺癌(West, et al., 2003)、大腸癌(Wei, et al., 2009)以及膀胱癌 有關(Chen, et al., 2010)。而α9 nAchR則是跟乳癌有關(Lee, et al., 2010)。
(2) α9 nAchR 誘發乳癌之機制
尼古丁會和細胞表面的α9 nAchR結合並活化AKT和MAPK 路徑 的訊息傳遞，進而在磷酸化下游的細胞內雌激素受體(Lee, et al., 2011)。除此之外胞內雌激素受體也會受到如Sp1, AP1, 和NF-kB等轉 錄因子活化(Glidewell-Kenney, et al., 2005)。活化的雌激素受體會進入 細胞核和activating protein 1 (AP1) 以及vitamin D receptor (VDR) 結 合後接上α9 nAChR啟動子(Lustig and Peng, 2002)後表現α9 nAChR。
而更多新表現的α9 nAChR會再結合更多的尼古丁導致更多的α9 nAChR表現，在這正回饋的作用下最後會導致癌症(Lee, et al., 2011)。
更有研究指出約有六到七成左右的乳癌病患檢體，其α9 nAChR的表
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現量是正常組織的八倍。且如果抑制MDA-MB-231乳癌細胞株的α9 nAChR表現再移植到動物時，其移植瘤生長會較慢：反之，如果誘導 正常乳腺細胞株MCF-10A的α9 nAChR大量表現再移植到動物時，其 移植瘤生長則會較快。此外，α9 nAChR mRNA表現量較高的乳癌病 患的五年存活率較表現較低的病患來得低(Lee, et al., 2011)。
(3) 乳癌簡介
乳癌在美國婦女中是死亡率第二高的癌症。在美國2005年約有21萬名 女人被診斷出侵入性乳癌、5萬人罹患原位導管癌，更有4萬人死於侵 入性乳癌(Poola, et al., 2005)。全球每年有超過一百萬人被診斷出乳 癌，超過41萬人死於乳癌(Coughlin and Ekwueme, 2009)。病理分類上 主 要 可 分 為 小 葉 癌 (lobular carcinimas) 跟 導 管 癌 (ductal carcinomas)。而臨床分期則大致分成四期：第一期：乳房腫塊小於2 公分，無腋下淋巴結轉移；第二期：乳房腫塊在2-5公分之間，可能 有或沒有淋巴結轉移；第三期：乳房腫塊大於5公分，皮膚可能出現 紅腫、潰爛或橘皮樣變化，大部份腋下淋巴結轉移；第四期：有遠處 器官轉移，如骨、肝、肺等器官。
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(4) 乳癌之篩檢與治療
乳癌在篩檢上最常用的是自我檢查或是觸診跟視診，大約 90%的 乳房腫塊可藉由這種方式發現。而未知的腫塊則可藉由 X 光或超音 波檢查來檢測。當發現有腫塊時會再以針抽吸細胞或乳房切片取出細 胞或組織進行染色，經病理專家判斷後才能確定是否罹患乳癌。
乳癌在治療上則是取決於臨床分期。第一期病患常以外科手術切 除輔以放射線治療，預後通常很好。化學治療在第一期並不常用。第 二和第三期病患也會以手術切除腫瘤或乳房，並視情況切除淋巴結。
並會配合化學治療和放射性治療但通常預後較差。第四期治療包含手 術切除、放射性、化學治療和標靶治療。不過第四期術後預後通常很 差，完整治療後的十年存活率僅約 10%，而不治療則只有 5%。在標 靶治療上，若是 HER2 陽性的乳癌腫瘤則會再施以 Herceptin 治療，
但 HER2 陽性的乳癌病患約只占全部侵入性乳癌病患的 15-20 %左右 (Wolff, et al., 2007)。非 HER2 高表現量的乳癌病患則需要針對其它乳 癌標的物分子的抗體才能進行標靶治療。
(5) 多株抗體與單株抗體
在實驗動物受免疫注射時，其每個 B 細胞會產生一種對應此抗原
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之抗原表位 (epitope) 的抗體，此種由單一株 B 細胞所產生的抗體即 為單株抗體，只會辨識特定抗原的單一表位；而由許多株 B 細胞所 產生的會辨識特定抗原的不同表位之抗體群則為多株抗體。以雞隻做 為實驗動物的話，由免疫注射後的雞隻蛋黃中具有抗原專一性辨識能 力的多株抗體比例約是全部抗體的 10 %(Akita and Li-Chan, 1998)，而 其它的 90 %抗體則是非專一性的抗體。若將全部的抗體都純化出來 則會有其他非專一性的抗體造成檢驗上的背景值或是誤差。而為了降 低非專一性的反應，單株抗體是較好的選擇。
(6) 融合瘤單株抗體生產
以融合瘤細胞生產單株抗體的技術是於1975年由Georges Köhler 和César Milstein所發表的(Kohler and Milstein, 1975)。這技術是將免疫 注射過的小鼠脾臟細胞和多發性骨隨瘤細胞於 PEG1500溶液中融 合，並以HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) 培養基篩選出 融合成功的細胞。之後將融合瘤細胞極限稀釋並分離到96孔盤中培 養，使每一孔洞最多只有一株細胞。最後再從培養液中純化單株抗體 進行後續測試。這方法雖然已經行之有年，但融合瘤細胞法有細胞培 養成本高且不穩定、發展侷限在嚙齒類動物、在動物系統中不容易對 單株抗體進行改良及改造等缺點(Winter and Milstein, 1991)。
17 片段 (single chain variable fragment，scFv) 是由重鏈和輕鏈之多樣性 片段和連接這兩者的短肽鏈組成，不含有 Fc 片段。
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篩選出帶有能夠辨識抗原的重組抗體基因之噬菌體(Parmley and Smith, 1988)。之後將這些噬菌體感染大腸桿菌後就可以用大腸桿菌 大量表現重組抗體。其優點在於操作簡易快速、硬體設備便宜、量產 容易、抗體基因可長期保存(Ahmad, et al., 2012; Burritt, et al., 1996;
Holliger and Hudson, 2005)。而其缺點在於原核細胞產生的蛋白沒有 轉錄後修飾 (post-translation modification) 作用，缺乏醣化作用可能 會影響其三級結構進而影響抗體的專一性和結合能力。其次是沒有表 達 Fc 片段會造成後續的細胞性免疫包括補體的活化和細胞毒殺作用 都無法產生。
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