0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Total RNA
Relative ration of HCV RNA
pCMV-myc pCMV-mycPTB
Figure. 1. 細胞內表現 PTB 蛋白質的 RNA 結果
HCV subgenomic replicon 細胞在大量表現 PTB 蛋白質時觀察細胞內 HCV subgenomic replicon RNA 正股及負股的變化。以 HCV subgenomic replicon 細 胞 進 行 轉 染 分 別 送 入 Mock 、 Vector(pCMV-myc) 、 pCMV-myc-PTB，在轉染 48 小時後，萃取細胞 RNA，Total RNA 是直 接進行One-step RT-PCR 同時偵測正股及負股 RNA 的變化，負股(minus strand)和正股(plus strand)的結果則是將 RNA 先進行反轉錄作用，再取 互補DNA 進行 real-time PCR。
Figure. 2. 細胞內表現 PTB 蛋白質的 Western blot 結果
HCV subgenomic replicon 細胞在大量表現 PTB 蛋白質時觀察細胞內 HCV 非 結 構 蛋 白 的 變 化。以 HCV subgenomic replicon 細 胞 進 行 transfection 分別送入 Mock、Vector(pCMV-myc)、pCMV-myc-PTB，在 transfection 48 小時後，萃取細胞蛋白質，以 8% SDS-PAGE 將蛋白質分 離並分別以anti-PTB、anti-NS5A、anti-Actin 及 anti-NPT II 抗體偵測。
0 0.5 1 1.5 2
Total RNA minus strand plus strand
Relative ratio of HCV RNA
pU6 pU6-PTB43
Figure. 3. 細胞內表現 PTB siRNA 的 RNA 結果
HCV subgenomic replicon 細胞在 PTB 蛋白質被抑制時觀察細胞內 HCV subgenomic replicon RNA 正股及負股的變化。以 HCV subgenomic replicon 細胞進行轉染分別送入 Mock、Vector(pU6)、 pU6-PTB43，在 轉染24 小時後，用相同條件再次進行轉染，在二次轉染後 24 小時，萃 取細胞RNA，Total RNA 是進行 One-step RT-PCR，同時偵測正股及負 股 RNA 的變化，負股(minus strand)和正股(plus strand)的結果則是將 RNA 先進行反轉錄作用，再取互補 DNA 進行 real-time PCR。
Figure. 4. 細胞內表現 PTB siRNA 的 Western blot 結果
HCV subgenomic replicon 細胞內 PTB 蛋白質被 knock-down 後，觀察細 胞內 HCV 非結構蛋白的變化。以 HCV subgenomic replicon 細胞進行 transfection 分別送入 Mock、Vector(pU6)、pU6-PTB，在 transfection 48 小時後，萃取細胞蛋白質，以 8% SDS-PAGE 將蛋白質分離並分別以 anti-PTB、anti-NS5A 和 anti-Actin 抗體偵測。
A.
B.
Figure. 5. 不同刪除突變 PTB 蛋白質示意圖及 Western blot 結果 (A.)不同刪除突變 PTB 蛋白質的示圖。(B.)HCV subgenomic replicon 細 胞在大量表現 PTB 以及 PTB deletion 蛋白質時觀察細胞內 HCV subgenomic replicon RNA 的變化。 以 HCV subgenomic replicon 細胞進 行 transfection 分 別 送 入 Vector(pCMV-myc) 、 pCMV-myc-PTB 、 pCMV-myc-PTB(1-169)、pCMV-myc-PTB(169-294)、pCMV-myc-PTB(1- 329)、pCMV-myc-PTB(330-531)，在 transfection 48 小時後，萃取細胞 蛋白質，以8% SDS-PAGE 將蛋白質分離並分別以 anti-myc 和 anti-Actin 抗體偵測。
0 0.5 1 1.5
Total RNA minus strand plus strand
Relative ratio of the HCV RNA
PTB PTB1-169 PTB169-294 PTB1-329 PTB330-531
Figure. 6. 細胞內表現不同刪除突變 PTB 蛋白質的 RNA 結果
HCV subgenomic replicon 細胞在大量表現刪除突變 PTB 蛋白質時觀察 細胞內 HCV subgenomic replicon RNA 正股及負股的變化。以 HCV subgenomic replicon 細胞進行轉染分別送入 Mock、Vector(pCMV-myc)、
pCMV-myc-PTB、pCMV-myc-PTB(1-169)、pCMV-myc-PTB(169-294)、
pCMV-myc-PTB(1-329)、pCMV-myc-PTB(330-531)，在轉染 48 小時後，
萃取細胞RNA，Total RNA 是進行 One-step RT-PCR 同時偵測正股及負 股 RNA 的變化，負股(minus strand)和正股(plus strand)的結果則是將 RNA 先進行反轉錄作用，再取互補 DNA 進行 real-time PCR。
Figure. 7. HEK293 細胞經分別轉染表現 NS5B 及 PTB
在 HEK293 轉染完後 48 小時，生長在蓋玻片上的細胞進行一系列的固 定、增加通透性、BSA blocking、一級抗體反應、二級抗體反應等間接 免疫螢光呈色法的步驟，最後以mounting media 將細胞封片。左圖 NS5B 使用的一級抗體為rabbit-anti-flag、二級抗體為 goat-anti-rabbit-FITC，左 下圖使用DAPI(存在 mounting media 中)將細胞核染色。右圖 PTB 使用 的一級抗體為mouse-anti-myc、二級抗體為 goat-anti-mouse-TRITC。
Figure. 8. HEK293 細胞經共同轉染表現 NS5B 及 PTB
在 HEK293 轉染完後 48 小時，進行間接免疫螢光呈色法的步驟，以 mounting media 將蓋玻片封片。在共軛焦顯微鏡下觀察，細胞內螢光分 布狀況。左圖 NS5B 使用的一級抗體為 rabbit-anti-flag、二級抗體為 goat-anti-rabbit-FITC，左下圖為 NS5B 和 PTB 兩個圖片重疊在一起的結 果，若NS5B 和 PTB 是單獨存在，細胞則呈現原本的綠色或是紅色，當 NS5B 和 PTB 存在同一個位置時，就會因為顏色的疊加產生黃色結果。
右 圖 PTB 使 用 的 一 級 抗 體 為 mouse-anti-myc 、 二 級 抗 體 為 goat-anti-mouse-TRITC。
Actin
Figure. 9. 細胞核與細胞質蛋白分析結果
萃取分離細胞核與細胞質的蛋白質。觀察NS5B 及 PTB 在細胞內分佈的 狀況。HCV subgenomic replicon 為實驗對照組，以 HEK293 細胞進行 transfection 分 別 送 入 Vector(pCMV-flag) 、 NS5B 、 PTB/NS5B 、 在 transfection 48 小時後，以 Nuclear/Cytosol fractionation kit 分離出細胞質 與細胞核的蛋白質，以8% SDS-PAGE 將蛋白質分開並分別以 anti-PTB 和anti-NS5B 抗體偵測。