以螢光染色觀察 NS5B 與 PTB 在細胞內的分佈狀況時，首先內 生性的 PTB 蛋白質，不管是否在 HEK293 細胞內進行大量表現 PTB (fig. 7)，卻只能觀察到 PTB 出現在細胞核內，這表示 PTB 只會出現 在細胞核。而NS5B 並不是 HEK293 所具有的蛋白質，所以經由細胞
轉染才能在細胞中觀察到NS5B 在細胞內的分佈，在那些有大量表現
NS5B 的細胞，看到 NS5B 只散佈在細胞質，並未進一步進入到細胞 核。即使是 PTB/NS5B 共轉染表現蛋白質時(fig. 8)，也是一樣只能看 到PTB 在細胞核，NS5B 在細胞質，很少數則可以看到 PTB 和 NS5B 會共同表現在靠近核膜附近的位置。
此外，我們也分別取細胞質及細胞核蛋白質觀察 PTB 與 NS5B
蛋白質的分佈狀況(fig. 9)：HEK293 細胞做細胞轉染後，觀察 PTB 或 NS5B 在細胞內的分佈是否有變化，pCMV-flag(Sigma)是 NS5B 的 vector，這只是證實 NS5B 在大量表現後，如果 PTB 有受到影響並不 是因質體轉染所造成的。HCV subgenomic replicon cell 是這個實驗的 對照組，由此觀察細胞內 PTB 和 NS5B 兩個蛋白質之間的互動，PTB
還是只存在細胞核內，而NS5B 也是只分佈在細胞質中，但這是指大
部分NS5B 而言因為有發現極微量的 NS5B 會出現在細胞核內。在只
單獨表現在 NS5B 的結果上看到 PTB 仍然只存在細胞核內不論是在 轉染Vector 或是 pCMV-flag-NS5B 表現的結果，然而 NS5B 在大量表 現之後卻看到NS5B 會平均散佈在細胞質和細胞核，當 PTB/NS5B 共
同表現在細胞內時卻見到 PTB 不只出現在細胞核就連細胞質也有出
現。
四、討論
已經有文獻證明PTB 和 HCV 5’-UTR IRES 區域會交互作用結合
在一起，說明了 PTB 會參與 HCV 轉譯反應的調控。目前知道過量
PTB 蛋白質對 HCV 轉譯反應會有抑制作用[Murakami et al., 2001]，
從本論文 Western blot 的分析也得到一樣的結果；當細胞大量表現 PTB 蛋白質時，非結構性蛋白質 NS5A 的表現下降，但是 NPT II 蛋 白質的表現並沒有變化的現象（Fig. 2），也就是 HCV IRES 控制的 轉譯反應並沒有受到抑制，雖然這樣的結果和文獻提出的結果並不相 符，也許在細胞內還存在某些未知的因素才造成這樣的情況發生。其 實在Domitrovich et al.[2005]也有提到，PTB 會和 HCV 非結構性蛋白 NS5B 和 NS3 都有交互作用產生，而 NS3 protease 的功能就是控制多 蛋白質前驅物的切割，或許因為PTB 的大量表現間接地影響到 NS3，
最後造成NS5A 的下降，然而這個推論需要更進一步的求證。和 PTB 有交互作用的非結構性蛋白NS5B 是個 RdRp (RNA dependent RNA polymerase)酵素，在 HCV RNA 的複製機制中扮演決定性的角色，因
此 PTB 的大量表現極可能會對 HCV RNA 的合成造成影響。由
Real-time RT- PCR 的結果得知，PTB 大量表現時，HCV RNA 的合
成下降（Fig. 1），因此可以推測出 PTB 參與 HCV subgenomic replicon RNA 的合成，可能因此造成 HCV 蛋白質表現量的減少。
相對的，利用RNAi 抑制 PTB 的表現，此時 HCV 蛋白質的表現 也有些微的下降（Fig. 4），特別的是，HCV RNA 的合成有些微的增 加（Fig. 3）。根據 Domitrovich et al.[2005]發表的結果有兩個地方必 須注意，(1)利用 RNAi 抑制 PTB 的表現後，HCV IRES 的轉譯反應 也會跟著被抑制。但是單獨觀察 HCV IRES 調控的 GFP 報導基因 時，PTB RNAi 也會增加 GFP 的表現（data not shown），顯示除了 IRES 外，可能仍有其他調控 HCV 轉譯的機制。(2)隨著 PTB 抑制時 間的延長，雖然HCV 複製機制剛始會被抑制，但隨著時間的拉長 HCV
複製反應卻漸漸回復甚至於更強，因此推論HCV RNA 的複製機制應
有許多的細胞因子可供病毒進行複製。
若以大量表現 PTB 蛋白質的細胞 RNA 為基準，則其他 PTB deletion 蛋白質存在的細胞，其 HCV subgenomic replicon RNA 的複製 機制似乎是被抑制，其中 PTB(1-329)不但能抑制 HCV subgenomic replicon 的複製機轉，而且其抑制的效果比 PTB 多出許多，而包含 PTB 蛋白質C 端部分的 PTB(330-531)蛋白質，抑制 HCV RNA 的合成較 不明顯。而且實驗室其他人的結果顯示，PTB 的 N 端而非 C 端與 NS5B 結合。再加上根據 Kamath et al.[2001]的描述 PTB 具有 4 個 RRMs
(RNA recognition motifs)，其中靠近 N 端 RRM 1 和 RRM 2 的功能是 控制進出細胞核，另外靠近C 端 RRM 3 和 RRM 4 是和 RNA 結合的 主要區域，或許這可以解釋為何PTB(1-329)能夠抑制複制機制。
在 FA 的結果看到，單獨表現 PTB 或 NS5B 時，都只看到 PTB
在細胞核內不會到細胞質，而 NS5B 散佈在細胞質中沒有進入細胞核
內，如果 PTB 只會存在細胞核這是正確的話，那麼當大量表現 NS5B 或是 PTB/NS5B 共同表現時，應該可以看到多數 PTB 和 NS5B 共同 表現在同一位置的結果，因為PTB/NS5B 的 IP Western 結果是兩個蛋 白質會交互作用結合在一起，但共同表現蛋白質PTB/NS5B 的 FA 結 果卻不是如此，因為能看到 PTB 和 NS5B 共同表現的結果實在太少 了，在 400 倍的顯微鏡下觀察有共同表現蛋白的細胞約每 1000 個才 能看到一個，這是否說明PTB 和 NS5B 的結合並非一直持續在進行，
而是在某個特定的狀況才在結合在一起。還是說 PTB 和 NS5B 雖然 能夠直接相互結合但是必須存在某個條件，因為未滿足那個條件所以 在FA 看不到在細胞內共同表現。
有些細胞內發生的結果可能無法經由間接的免疫螢光呈色分析 方法(IFA)觀察，所以必須藉助其他較特別的分析方法瞭解蛋白質在 細胞內分佈的情形，再經由不同實驗結果的相互印證和比較，推測細
胞內較接近真實狀況的結果。藉由分離HCV subgenomic replicon 細 胞蛋白質，可觀察到 PTB 依然只存在細胞核內，而 NS5B 主要是分
佈在細胞質，但是卻有一小部分的NS5B 似乎會進入細胞核內，這是
否表示在一般狀況下 PTB 和 NS5B 都是各自分布在細胞核和細胞
核，唯有在特定的情況下才會促使NS5B 進入到細胞核內。在 HEK293 細胞轉染pCMV-flag 和 pCMV-flagNS5b 的結果，得知不論是表現載 體或是NS5B 都不會影響 PTB 的分佈(只存在細胞核內)，但是當大量 表現NS5B 時卻可以觀察到在細胞核和細胞質內都有 NS5B 的存在，
然而 β-Actin 的結果也同樣在細胞核和細胞質都有表現，這意味著在 細胞核與細胞質蛋白分析的實驗會互相干擾，可能因此和間接免疫螢 光呈色法(IFA)觀察到的結果不同。由 IFA 結果得知 NS5B 單獨表現 時只在分佈在細胞質並不會進入細胞核內，而且少數細胞可以觀察到 PTB 和 NS5B 共同表現在細胞核膜周圍。
綜上所述，細胞因子 PTB 與 HCV NSB 具交互作用，此交互 作用影響HCV RNA 的合成，並進一步可影響 HCV 蛋白質的轉譯作 用。但PTB 只是參與 HCV 病毒複製機制宿主蛋白質中其中之ㄧ，仍 需其他病毒及宿主細胞因子的參與。