及 5 在各孕程的表現

MUC1：我們的研究結果顯示MUC1 mRNA 及MUC1 protein隨著懷孕週數增加而 遞增。在第一孕程與第二孕程的比較中，雖然沒有明顯差異，但是可以看出逐漸 上升的趨勢。整個看來，MUC1 mRNA 及MUC1 protein在進入第三孕程後開始 快數增加。雖然兩種anti-MUC1抗體 (clone VU4H5及clone M2C5的anti-MUC1 mAb) 的敏感度略有不同，免疫染色的結果也顯示與mRNA及protein一樣的相符 情況。

免疫染色提供了組織定位的效果。MUC1 protein在整個懷孕過程中，在胎盤 絨毛的部位，仍以胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)的表現較為明顯。在 第一孕程，我們可以在游離型絨毛(floating villi)看到較多的細胞型滋養層母細胞 (cytotrophoblast)，然而由於MUC1 protein在此時的訊號並不明顯，而且只在外圍 胞融型滋養層母細胞的apical surface，所以在內層的細胞型滋養層母細胞是沒有 看到染色現象。由於胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)是由細胞型滋養層 母細胞(cytotrophoblast)成熟、分化及細胞融合而來，在所有孕程都以在胞融型滋

養層母細胞表現較為明顯，所以MUC1似乎是在細胞逐漸成熟分化後表現出它們 的功能。

MUC1 mRNA及MUC1 protein的分子生物學表現，我們是focus在placental villi(取樣以villi為準)，免疫染色則可以觀察到蛻膜層(decidua)的變化。我們發現 在蛻膜層，所有細胞型滋養層母細胞(在此處均稱為絨毛外細胞型滋養層母細 胞，extravillous cytotrophoblasts，EVTs)，可以分為MUC1陽性或MUC1陰性兩種。

MUC1陽性的細胞型滋養層母細胞隨著懷孕週數增加，而有逐漸增加的趨勢。同 時我們也發現MUC1陽性的滋養層母細胞在週數愈大時，分布位置愈往蛻膜層的 深部集中(即愈靠近子宮肌肉層)。顯示這個區域的細胞型滋養層母細胞是以 MUC1陽性的細胞為主。其意義為何在下段會再說明。

我們為了了解MUC1在滋養層母細胞的生物性狀的影響，以絨毛膜癌

(choriocarcinoma)的細胞株：JAR cell line—主要細胞成分是癌化的細胞型滋養層 母細胞作為研究標的。我們發現MUC1 overexpression可以抑制JAR cells在in vitro 的invasion。進一步以gelatin zymography來探討，發現MMP9會被MUC1

overexpression所抑制，此與JAR cells在in vitro 的invasion被抑制應該有關聯。由 MUC1在分子生物學表現及免疫染色在不同懷孕週數的表現，我們初步認為 MUC1應該與懷孕期間之絨毛外細胞型滋養層母細胞(extravillous

cytotrophoblasts)在蛻膜層的invasion有密切關聯。

過去有研究報告顯示，在macaque的懷孕早期的胎盤，有表現低量的MUC1 expression(Thirkill, Cao et al., 2007)。然而即使是最佳情況，MUC1表現量可以說 是很equivocal and weak。他們發現MUC1在懷孕早期的endovascular trophoblasts 有表現，另外與trophoblast transendothelial migration有關，而blocking antibody against MUC1可以產生抵銷的效果。所以在macaque的懷孕早期的研究，顯示 MUC1似乎與胚胎著床及建立絨毛血液循環有關。由於MUC1在其他器官組織與 ntercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1)有互動，所以在胎盤此處，ICAM-1是 否也有類似或是不同的效應，也是需要繼續觀察。另外一個報告則顯示MUC1在

第一孕程及第二孕程均有表現(Jeschke, Richter et al., 2002)，他們注意到MUC1是 Thomsen-Friedenreich (TF) antigen (Epitope Gal-1-3GalNAc-O-)，一種

carcinoma-associated antigen的putative carrier protein，但是進一步的互動仍在研究 中，而他們的報告主要是在免疫染色。由於我們研究MUC1 mRNA及MUC1 protein，包括分子生物學的表現，如：定量RT-PCR、西方墨點試驗，也包括免 疫組織染色。而且我們是用兩種抗體(clone VU4H5及clone M2C5的anti-MUC1 mAb)在西方墨點試驗及免疫組織染色，也得到相似結果，所以結果應該相當可 靠。有報告顯示VU4H5在比較hypoglycosylated MUC1 的染色效果較佳

(Ciborowski, Finn et al., 2002)。而M2C5對於natural MUC1和 underglycosylated MUC1的結合效果較好。由於我們的報告顯示定量RT-PCR、西方墨點試驗及免 疫組織染色的結果一制性很高，所以我們可以認為MUC1的表現確實是隨著不同 懷孕週數的增加而增加。

前已述及：MUC1主要表現在胎盤絨毛的胞融型滋養層母細胞 (syncytiotrophoblast)和子宮內膜(此時為蛻膜)區內的絨毛外滋養層母細胞

(EVTs)。蛻膜層的滋養層母細胞，有一部分會表現MUC1(MUC1陽性)，有一部 分則不表現MUC1(MUC1陰性)。MUC1陽性的滋養層母細胞隨著懷孕週數增加，

而有數目逐漸增加的趨勢及分布位置愈往蛻膜層的深部集中的情況。如果我們從 細胞外實驗(in vitro)觀察MUC1過度表現(overexpression)的滋養層母細胞細胞株 (JAR cell line，分離自絨毛膜癌細胞，細胞性狀類似滋養層母細胞)，發現他們的 侵襲能力降低約百分之三十五。這些現象出乎意料，MUC1對於滋養層母細胞細 胞株(JAR)的影響居然與MUC1對於一般腫瘤細胞的影響相反，可是我們要知 道，JAR細胞原始來源也是癌細胞，為何MUC1對絨毛膜癌細胞的影響是不同的，

這顯然還需要繼續去探討。初步結果顯示MUC1對於滋養層母細胞的影響不是刺 激而是抑制侵襲。我們的研究也發現：此現象似乎與JAR cell line的MMP9的活性 下降有關。如果我們再回過頭來看一下組織切片，在蛻膜區MUC1陽性的EVTs 主要分布在較靠近蛻膜深部(即愈靠近子宮肌肉層)，即較靠近蛻膜-肌肉層交界

面。淺層比較接近cell column的部分，MUC1陽性細胞就比較少。所以組織染色 的結果，呼應前面的in vitro結果，即表示：MUC1對於滋養層母細胞的蛻膜侵襲，

應該是一種負性調控者，一種屏障(restraint)、踩剎車的機制。我們很好奇胎盤自 從著床起就一直發育，為何長到一定程度會自然減緩，而自然情況之下滋養層母 細胞為何會停留在蛻膜區，不會穿透整個子宮肌壁。因為滋養層母細胞在蛻膜層 的適度且足夠的侵襲適胎盤建全發育的基本條件，而MUC1似乎在這個部分扮演 了極重要的角色。而蛻膜區的腺體細胞均明顯表現出MUC1陽性反應，所以蛻膜 區的微環境應該與MUC1抑制滋養層母細胞侵襲功能能否發揮，有直接關係，意 即缺少蛻膜區的腺體，滋養層母細胞侵襲可能不易受控制。此點與發生植入性胎 盤的地區其往往有蛻膜缺損的現象似乎也吻合。當然此論點仍須累積更多證據才 能證實。同時我們對於兩種不同的性狀的絨毛外滋養層母細胞(EVTs)，他們的生 物學角色是如何還須進一步釐清。

其實很多proteolytic enzymes都與細胞的組織侵襲有關。而MMP2及MMP9則 與胎盤發育時的trophoblast invasion有關(Ferretti, Bruni et al., 2007)，尤其是 MMP9。我們的研究報告顯示MUC1 overexpression可以抑制MMP9，這是第一次 在文獻上的報告，有其價值，而MUC1 overexpression可以抑制trophoblast-like cells 的組織侵襲，可能與MMP9被抑制有關，也是我們的創見。除了我們在intrduction 的references之外，過去也有review報告說，MUC1在接受外在訊息的時候，可以 將訊息經由胞內區域傳遞，最後在細胞體表現出相關的性狀(Singh and

Hollingsworth, 2006)。可能的pathways包括：經由Ras、-catenin、p120 catenin、

p53 及estrogen receptor -。因為MUC1CT也可以與一些transcription factors形成 複合體，然後以某些尚未知的機轉移位到細胞核(nucleus)內。而目前MUC1在滋 養層母細胞如何去影響MMP9的作用，則仍留待我們繼續去研究。

前面已提到，MUC1對於絨毛膜癌細胞株(JAR)的影響是與MUC1對於一般腫 瘤細胞的影響相左。我們知道有許多器官組織的腫瘤是會表現MUC1，而且MUC1 的表現量大的與腫瘤細胞的侵襲能力增加有關或是促進癌化作用的進行

(Kohlgraf, Gawron et al., 2003;Singh, Wen et al., 2007;Tsutsumida, Swanson et al., 2006b)。前已述及，MUC1的細胞質尾端(MUC1CT)有tyrosine phosphorylation site，而platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR)可以in vitro催化此位 置以及RDTYHPM site的tyrosine phosphorylation，同時在其他cell lines實驗中，刺 激PDGFR可以促進cell invasion。所以MUC1與PDGFR互動可以誘發signal transduction，並且影響pancreatic adenocarcinoma的metastatic properties(Singh, Wen et al., 2007)。此外，這些adenocarcinomas所造成的MUC1的overexpression及 不同程度的醣化glycosylation，會改變cell surface adhesion properties(經由細胞外 區域extracellular domain的tandem repeat(TR))，或是引發morphogenetic signal transduction(經由MUC1CT的tyrosine phosphorylation)等最後影響到腫瘤細胞的 invasive及metastatic potential (Kohlgraf, Gawron et al., 2003)。不過他們的human pancreatic tumor cell line S2-013的研究也發現S2-013 cells overexpressing

full-length MUC1(完整足量的TR及CT)，反而表現出less invasive and metastatic phenotype，意即lacking the TR domain or CT 的cells會表現invasiveness。有點耐 人尋味。所以MUC1CT的tyrosine phosphorylation到底會引發什麼樣的signaling變 成一個很重要的研究課題。是否滋養層母細胞由於胎盤發育過程所在的蛻膜其 microenvironment有所不同，亦或有其他intracellular pathways，所謂有不同的細 胞因子表現(differential expression of cellular factors)，而表現不一樣的生物性狀，

這可能需要進一步再研究。之前已述及，MUC1 protein expression如果給與 down-regulation，一些會增加doubling times的基因 (cyclin B1 及 cyclin D3)結果 出現overexpression，因而降低了metastatic potential of pancreatic

adenocarcinoma(Tsutsumida, Swanson et al., 2006a)。目前我們還在研究MUC1 overexpression對於滋養層母細胞的cell proliferation，是什麼效應，屆時有關cell cycle的重要基因，勢必是要列入研究範圍。

我們的研究顯示，足月胎盤的胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)會表 現明顯的MUC1 expression。女性生殖器官基本上是對於外界環境是屬open

system，除了支持embryonic development、implantation 及 placentation之外，還 必須設法抵禦微生物感染。所以基本上所有reproductive tract mucins，還有研究 比較多的Muc1/episialin，應該在implantation related events以及protection from microbial infection 扮演key roles才對。所以在lower reproductive tract表現High levels of mucin expression 應該是保護器官免於感染的重要條件。因此Muc1-null mice (Muc1^tm1Gend) 因為缺乏Mucin1保護，所以會表現生殖道的chronic infection 以及包括子宮發炎(Brayman, Thathiah et al., 2004a;DeSouza, Surveyor et al., 1999)。而病原菌只是normal bacteria of the reproductive tract！此外，MUC1也被 認為有immunoregulatory role的功能，例如soluble MUC1會造成T-cell的

unresponsiveness，而且被活化的T cells也會表現及分泌MUC1(Agrawal, Gendler et al., 1998)，所以MUC1被認為有保護腫瘤免於被免疫細胞所攻擊的效用。另外的

研究也顯示，MUC1會in vitro抑制human T-cell proliferation，而此現象可以被外 加的IL-2 reverse回來(Agrawal, Krantz et al., 1998)。若從臨床的角度來看，我們可 以預測MUC1在絨毛的胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)的細胞表層有大 量表現，似乎有保護胎盤免於病原體及免疫系統的侵襲的功用。

過去的研究已知，MUC1與estrogen receptor alpha (ESR)及epidermal growth factor receptor (EGFR)有直接互動，或會調控它們的signalings (Schroeder,

Thompson et al., 2001;Wei, Xu et al., 2006)。經由progesterone biosynthetic

pathway，靈長類胎盤會受estrogen調控，使得與estrogen receptor結合後控管細胞 型滋養層母細胞分化成胞融型滋養層母細胞(Pepe and Albrecht, 1999)。另外有研 究顯示，EGF(epidermal growth factor)，與EGFR產生互動之後，也會影響胞融型 滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)的Nat/Ht exchanger activity及trophoblast

apoptosis (Johnstone, Speake et al., 2007;Moll, Jones et al., 2007)，重要的是， EGF 可以減少 trophoblast apoptosis resulting from exposure to hypoxia。當然很重要的

apoptosis (Johnstone, Speake et al., 2007;Moll, Jones et al., 2007)，重要的是， EGF 可以減少 trophoblast apoptosis resulting from exposure to hypoxia。當然很重要的