國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所 博士論文
Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine
National Taiwan University Doctoral Dissertation
黏液蛋白 Mucins 在胎盤發育過程的表現 及其與子癇前症的關聯之研究
The expression of mucins in placental development and its association with preeclampsia
徐明洸
Ming-Kwang Shyu
指導教授：謝豐舟教授
Adivisor: Fon-Jou Hsieh, Professor 協同指導老師：黃敏銓副教授
Co-Advisor: Min-Chuan Huang, Associate Professor
中華民國九十八年一月
January, 2009
誌 謝
經過一千六百多天的’痛苦學習’，終於可以畢業了。
要感謝的人實在太多了。感謝臨床所陳所長的諄諄教導、臨床所多位老 師，包括楊偉勛教授的熱心指導。感謝 謝豐舟教授的實驗指導以及支持我的口 試過關。感謝解剖學暨細胞生物學研究所的黃敏銓老師的協同指導，還有提供了 這麼完善的實驗環境，讓我們的研究得以完成。很重要的，謝謝黃老師實驗室的 研究團隊：研究助理華文、彥榕、仟惠、怡芳、炯輝，碩士生美英、易玲，大學 部學生玫君、佳穎、知瑋。在此也感謝本科李建南主任、施景中、童寶玲醫師的 從旁協助。也謝謝所辦大嵐的一路幫忙。
感謝婦產部楊友仕主任的推薦及關心，以及對我們進修的鼓勵。
再來要謝謝家人，包括我的父母兄弟。謝謝我的賢內助坤華、還有小女兒 菲柔，雖然她們不頂清楚我在玩甚麼把戲，可是知道我很忙。同時我也希望已經 是大學生的鈞洋、鈞信能更用功，成績更好。
要謝謝的人實在太多了，所以如果有遺珠之憾，請提醒我一下，一定另外 好好感謝。
最後，祝大家身體健康、萬事如意，事業飛黃騰達。
徐明洸
於 台灣大學醫學院臨床醫學研究所 民國九十八年一月
目 錄
口試委員審定書……… i
誌謝……… ii
中文摘要……… iv
英文摘要……… vi
圖目錄……… viii
表目錄……… ix
緒論……… 1
研究方法與材料……… 23
結果……… 29
討論……… 35
展望……… 55
英文簡述……… 65
參考文獻……… 79
圖表……… 92
附錄……… 104
中文摘要
關鍵詞: 蛻膜、金屬蛋白酶、黏液蛋白、胎盤、懷孕、胞融型滋養層母細胞、滋 養層母細胞組織侵襲
胎盤是胎兒賴以生存的生命線。而胎盤內的子宮動脈的末端血管「螺旋動脈」
在胎盤發育過程中，能否充分完成動脈的再鑄型(remodeling)，攸關胎盤功能的 優劣及胎兒的發育是否正常。而螺旋動脈的再鑄型與絨毛外細胞型滋養層母細胞 取代螺旋動脈的血管內皮細胞的程序有關，所以滋養層母細胞在子宮內膜(蛻膜) 區是否可以正常地移行(migration)、侵襲(invasion)，滋養層母細胞最後能否靠近 及進行螺旋動脈血管內侵襲是十分重要的。
由於黏液蛋白的性狀改變，被認為與細胞的生長、複製、分化、轉型 (transformation)乃至於細胞的移動、侵襲有關。而一些胞膜型黏液蛋白在胎盤的 表現特別多，所以我們假設黏液蛋白與滋養層母細胞的蛻膜內侵襲作用有關。
我們觀察主要的黏液蛋白(MUC1及MUC15等)在整個懷孕過程中不同時期 的基因和蛋白質表現，組織中的分布及它們的可能角色。同時我們會以細胞生物 學的研究方法，了解黏液蛋白對於細胞型滋養層母細胞的侵襲作用的影響。我們 會用絨毛膜癌的細胞株(主要細胞成分就是滋養層母細胞)，給予transfection之 後，在黏液蛋白overexpression的情況下，以matrigel invasion assay來觀察滋養層 母細胞的侵襲作用會如何改變，之後再以gelatin zymography或其他研究來尋找可 能的機轉。
結果顯示MUC15 在胎盤中的表現最高。MUC1及MUC15的mRNA和protein 的表現會隨著週數增加而遞增。(P < 0.05). 組織免疫染色顯示MUC1及MUC15 protein在cytotrophoblasts和syncytiotrophoblasts都有表現，而在apical membrane of syncytiotrophoblasts又特別明顯. 此外，MUC1及MUC15 在蛻膜的腺體上皮細胞 也都有表現。而MUC15的Overexpression 明顯降低 JAR and/or JEG-3 cells 在 matrigel的invasion，此現象與tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)-1 及
TIMP-2的mRNA expression增加有密切關係。如果以small interfering RNA來 knockdown MUC15會逆轉上述現象 (P < 0.05)。有趣的是，我們在蛻膜區發現 MUC1-positive及MUC1-negative兩種族群的extravillous trophoblasts, 而且 MUC1-positive extravillous trophoblasts會隨週數增加而增加。另外，MUC1 overexpression明顯抑制JAR cells在matrigel的 invasion (P< 0.01)，而此現象與 MMP9 activity下降有關。在重度的子癇前症的胎盤，MUC1的表現也明顯增加。
整體上看來，在human placentas的MUC1及MUC15的differential expression應 該與regulation of trophoblast invasion息息相關，所以也可能與preeclampsia的發生 產生關聯。有關臨床的影響及將來針對病生理學的研究的建議也會陸續討論。
英文摘要
關鍵詞: decidua, metalloproteinases, mucin, placenta, pregnancy, syncytiotrophoblast, trophoblast invasion
Trophoblast invasion is crucial for the development of normal placentas. One of the primary placental defect in preeclampsia and partly intrauterine fetal growth restriction is shallow invasion of the extravillous trophoblast into the decidua, which leads to incomplete spiral artery remodeling and inadequate uteroplacental perfusion.
Mucins are highly glycosylated proteins expressed by epithelial cells of various organs. The membrane-bound mucins, which possess a single transmembrane domain and a highly conserved cytoplasmic tail, include MUC1, MUC3A, MUC4, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, and MUC20. Among the known mucins, MUC1 is best studied and plays crucial roles in regulating many cellular properties, including cell proliferation, apoptosis, adhesion, and invasion. Although MUC1 has been found to be expressed by trophoblasts of various species, its expression in the human placenta throughout pregnancy and its potential role in trophoblast invasion remain unclear. MUC15 is a membrane-bound mucin and the mRNA of MUC15 has been detected by RT–PCR in various human tissues. So far, physiological functions of MUC15 have never been investigated. In the present study, we therefore investigated MUC1 and MUC15 expression in the human placenta and the effect on the invasion of trophoblast cells.
MUC15 mRNA in human tissues was analyzed by Northern blot. MUC1 and MUC15 mRNA and protein in human placenta were detected by real-time RT-PCR and Western blot, respectively. The distribution of MUC1 and MUC15 was revealed by immunohistochemistry. The effects of MUC1 and MUC15 on trophoblast invasion in vitro were analyzed by matrigel invasion assay in human choriocarcinoma JAR
and/or JEG-3 cells. The results showed that MUC15 was expressed most highly in human placenta. Both MUC1 and MUC15 mRNA and protein increased with
gestational age (P < 0.05, first versus third trimester). Immunohistochemistry showed that MUC1 and MUC15 protein was expressed by both cytotrophoblasts and
syncytiotrophoblasts, especially at the apical membrane of syncytiotrophoblasts. In addition, MUC1 and MUC15 were found to be present in the glandular epithelium of the decidua. Overexpression of MUC15 substantially decreased matrigel invasion of JAR and/or JEG-3 cells, which was closely associated with an increase in mRNA expression of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP)-1 and TIMP-2.
Knockdown of MUC15 with small interfering RNA significantly reversed these effects (P < 0.05). Interestingly, we found two populations of extravillous
trophoblasts, MUC1-positive and MUC1-negative cells, in decidua. The numbers of MUC1-positive extravillous trophoblasts were increased during placental
development. Furthermore, MUC1 overexpression significantly (P< 0.01) suppressed matrigel invasion of trophoblast-like JAR cells which was associated with a decrease in MMP9 activity assessed by gelatin zymography. Besides, MUC1 expression was significantly higher in the placenta of severe preeclampsia if compared with normal ones.
It seems that differential expression of MUC1 and MUC15 in human placentas may play a critical role in the regulation of trophoblast invasion. They may play some role in the disease process of preeclampsia. The clinical implications and further suggestions for pathophysiology studies are discussed here.
圖目錄
圖一 胎盤的相關構造。論文正文第 4 頁。
圖二 Interstitial 及 endovascular trophoblast invasion 的示意圖。論文正文第 7 頁。
圖三 黏液蛋白與不同醣蛋白質示意圖。論文正文第 17 頁。
圖四 MUC1 訊息傳遞的示意圖。論文正文第 17 頁。
圖五 MUC1CT 的示意圖。論文正文第 17 頁。
圖六 人體器官組織的 MUC15 表現。論文正文第 29 頁。
圖七 MUC1 mRNA expression 的 Q-PCR。論文正文第 29 頁。
圖八 MUC15 mRNA expression 的 Q-PCR。論文正文第 30 頁。
圖九 MUC1 protein 的 expression level。論文正文第 30 頁。
圖十 MUC15 protein 的 expression level。論文正文第 30 頁。
圖十一 胎盤絨毛的 MUC1 的 Immunohistochemistry。論文正文第 31 頁。
圖十二 胎盤絨毛的 MUC15 的 Immunohistochemistry。論文正文第 31、32 頁。
圖十三 蛻膜層的 MUC1 的 Immunohistochemistry。論文正文第 31 頁。
圖十四 不同週數的蛻膜層的 MUC1 Immunohistochemistry。論文正文第 32 頁。
圖十五 MUC1 overexpression 抑制 JAR cells 的 invasion 及可能的 mechanism：
MMP9 的活性增加。論文正文第 32 頁。
圖十六 MUC15 overexpression 抑制 trophoblasts 的 invasion。論文正文第 33 頁。
圖十七 MUC15 overexpression 抑制 JAR 及 JEG-3 cells 的 invasion 的可能的 Mechanism：TIMP-1 及 TIMP-2 的表現增加。論文正文第 33 頁。
圖十八 MUC1mRNA 在 severe preeclampsia 的胎盤的表現量。論文正文第 34 頁。
圖十九 MUC1 protein 在 severe preeclampsia 的胎盤的表現量。論文正文第 34 頁。
圖二十 MUC1 (+) trophoblasts 在 mild preeclampsia 的蛻膜層的數量略增加。論文 正文第 34 頁。
表目錄
表一 PCR 的 primers。論文正文第 22 頁。
第一章 緒論 背景
我們的研究，就從關懷生命開始。人類生命的產生，可以起源於卵子受精 (fertilization)。而生命孕育的接續，則端賴胎兒的子宮內「呼吸器」—胎盤的正 常運作，聯結母體，提供胎兒安全與舒適的生長空間，然後完成子宮內發育、順 利產出。
胚胎著床是胎盤發生的第一步。此步驟的成功與否，需要適當的胚胎發育和 合適的子宮內在環境。這兩方的同步進行牽涉到胚胎是否正常發育、懷孕的子宮 接受到外來及內部因素，包括：荷爾蒙及多種生長因子的調控而後是否產生正確 有效的影響有關。這當然是許多生物現象及分子互動的結果，而這些相關研究報 告及未來研究方針將會在以下的文章中一一闡述。
回顧我們婦產科醫生的醫療歷程，無法避免地都要為胎盤的問題而奮鬥。綜 觀目前最常見的母體罹病或死亡的原因，包括：高血壓、出血及感染症而言，妊 娠性高血壓，以及加上合併蛋白尿、水腫的子癇前症，許多學者已認為與胎盤發 育過程中的子宮螺旋動脈(spiral artery)末端在完成再鑄型(remodeling)，以保護胎 盤血流順暢的過程中，所經程序(process)是否順利有關。其次有關產科出血的疾 病，最嚴重的情況幾乎也都與胎盤的問題有關，例如：前置胎盤、植入性胎盤、
胎盤早期剝離、羊水栓塞等等，只要出血來源是胎盤著床的部位，出血量就會很 大。此外胎兒發育不良，或稱做「子宮內生長受限」(intrauterine growth restriction, IUGR)，有很大比例的狀況也和不良的胎盤功能有關。而生產過程中如果出現胎 兒窘迫的現象(一種胎兒心跳型態異常的情形)，一般判讀時也認定是子宮胎盤功 能不足(utero-placental insufficiency)的臨床表現。所以，研究胎盤功能以及胎盤 發育過程中，可能的影響因子就變得重要了。
我們在本文的介紹就從胎盤形成及其發育開始說起，然後接著介紹我們研究 的主角--黏液蛋白。
胎盤的早期發育
定位 Apposition
一般認為，胎盤發育最早要從胚胎著床開始。第一個步驟稱為同位
(apposition)。胚胎自受精後即開始細胞分裂。藉著不斷的分裂，發展成多細胞的 囊胚(blastocyst)，而到受精後的第六到七天，細胞數目可多達 256 個，直徑約 0.3mm。多數的細胞形成囊胚的外層細胞，稱為滋養層母細胞(trophoblast)，是胎 盤形成的先鋒部隊；在胚囊腔內有一群體積較大的細胞，稱作內細胞質塊(inner cell mass)，隨後會發育成胚胎母細胞(embryoblast)，這些細胞將來會發育成胚 胎、臍帶和羊膜。而胚胎母細胞所在的區域的囊胚部位，稱為胚胎極(embryonic pole)(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006b)。此時位於胚胎極的囊胚外層的滋養 層母細胞(trophoblast)便與子宮內膜的上皮細胞發生「第一次接觸」，而此胚胎極 亦稱之為著床極(implantation pole)。通常胚胎極與著床極位置很接近，如此胚胎 漸次發育時，臍帶進入胎盤的位置才會在胎盤的中央(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006b)。而著床的常見位置也通常在子宮內腔的上後方中線位置，與大部 分的哺乳動物類似。
內膜侵襲 Invasion
囊胚外層的滋養層母細胞(trophoblast)與子宮內膜的上皮細胞發生「第一次 接觸」--兩種不同細胞的黏附作用(adhesion)，從囊胚在輸卵管中移動時就開始準 備，但是真正合適於黏附作用發生的時間卻只有很短，所以早期提出此論調的學 者就稱為「著床空窗期」(implantation window) (Edwards, 1988;Sarani,
Ghaffari-Novin et al., 1999)。人類胚胎著床成功，必須掌握此階段的時效。在此 之後，著床極部的滋養層母細胞開始大量複製，形成兩層細胞。而位於外層的細 胞會產生細胞融合，轉型成為胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)；而位於 內層的細胞則仍保持單核狀態，稱為細胞型滋養層母細胞(cytotrophoblast)，是滋
養層母細胞持續複製的幹細胞(stem cells)來源。之後幾天，囊胚會繼續深入母體 的子宮內膜，滋養層母細胞也會不停的複製及細胞融合，最後達到可觀的厚度，
這是形成胎盤的前驅構造。而這時候著床極的胞融型滋養層母細胞質塊已呈現類 似指頭分支的形狀，往內膜深部延伸，並且為後續產生腔隙(lacuna)及絨毛(villi) 做準備(Sadler TW, 1995)。
形成腔隙及建立早期子宮胎盤血液循環
到了受孕的八天以後，滋養層母細胞質塊內開始出現空泡(vacuoles)。第九 天以後，許多空泡融合形成較大的空間，稱為腔隙，故此時又稱所謂的腔隙期 (lacunar stage)。這時胚胎內緣產生一層細胞，包圍胚囊內腔，緊連細胞型滋養層 母細胞的內層，稱為體腔外空腔(exocoelomic cavity)，其功能是原始卵黃囊 (primitive yolk sac) (Sadler TW, 1995)。到了第 12 天，著床的胚囊已經完全包埋在 子宮內膜內，意即子宮內膜的上皮細胞已經完全包覆了原先胚囊著床及侵入內膜 時所造成的內膜表層缺陷。此時比較重要的發育步驟是胞融型滋養層母細胞更加 入侵子宮內膜，侵蝕到母體內膜的微血管內皮，造成這些微血管擴張、充血，形 成所謂的靜脈竇(sinusoid)。隨著細胞質塊內的腔隙與母體子宮內膜的靜脈竇相 通，代表母血進入了滋養層母細胞質塊內部，而相通區域愈來愈廣，於是初期的 子宮胎盤血液循環便成型了。
此時的子宮內膜的基質細胞，受到賀爾蒙的影響，變大變長，型狀可出現圓 形、橢圓形或長形(因為組織切片的角度)，鄰近細胞呈平行排列，整體型態特殊，
我們稱為蛻膜細胞(decidual cells)。
形成初期絨毛
到了第 13 天以後，由於進入腔隙的母血增加，有時會造成出血。如果出血 量稍大，期時間點又剛好是月經週期的第 28 天，那麼經常會被誤以為是下一次 月經來潮，有人稱作「假月經」(pseudomenses)，結果造成懷孕週數的誤算。現
在由於藉助超音波儀器可以精確計算胎兒週數，所以在醫療水準進步的區域，應 該比較少造成困擾。
細胞型滋養層母細胞不斷地複製細胞，促成更多的融合細胞質塊產生，因此 除了縱向深入以外，橫向增生也造成新生融合質塊往腔隙方向突出。經過不停的 分支，形成樹枝狀的構造，稱為絨毛(villi)。於是原先滋養層母細胞質塊最厚的 部位，也等同是第一次接觸的部位，稱為錨部絨毛(anchoring villi)；而往腔隙突 出去，形成的絨毛構造，則在以後被稱為游離型絨毛(floating villi)。此時的絨毛 由滋養層母細胞所組成，尚無來自胎兒的間葉細胞(mesenchymal cells)或結締組 織，所以又稱為初級絨毛(primary villi)。而接受絨毛突出的腔隙，也就是後來游 離型絨毛所在地區，就形成所謂的絨毛間空腔(intervillous space)。(圖一)
(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006b)
形成細胞索(cell columns)及次級、第三級絨毛(secondary and tertiary villi) 錨部絨毛區的細胞型滋養層母細胞會持續增生，細胞聚集成為所謂的細胞索 (cell columns)。而細胞索的細胞群在繼續增生的過程，會令錨部絨毛往縱向深處 推移，而它們所在的區域，自然而然地會造成胞融型滋養層母細胞層逐漸變薄，
最後在 20 天時，讓細胞型滋養層母細胞直接接觸到子宮內膜層。於是這裡就成 為將來往內膜深部侵襲的細胞型滋養層母細胞，被稱為絨毛外滋養層母細胞 (extravillous cytotrophoblasts, EVTs)的產生的細胞來源。
到了第 15 天時，胚胎附近的間葉層(mesenchyme layer)細胞開始往絨毛區侵 襲，並且到達絨毛頂端及錨部絨毛區的基底部位，很接近細胞索。此時的絨毛，
稱為次級絨毛。到了第 18-20 天以後，來自間葉層細胞的血管母細胞
(hemangioblast)開始在絨毛內產生微血管，而這些含有所謂的胎兒微血管的絨 毛，就稱作第三級絨毛。(Castellucci, Scheper et al., 1990)從此時一直到足月，幾 乎所有的絨毛，型態都表現如第三級絨毛，只有在細胞索附近及新生成的絨毛，
才看得到初級或次級絨毛(Demir, Kaufmann et al., 1989;King, 1987)。
形成臍帶(umbilical cord)
在 14 天左右，胚胎外體腔(extraembryonic coelom)逐漸擴張，形成絨毛膜腔 (chorionic cavity)。而胚胎外間葉層(extraembryonic mesenchyme layer)形成細胞型 滋養層母細胞的內襯，稱作絨毛膜板(chorionic plate)，包圍了整個絨毛膜腔。這 裡的細胞除了上述的往絨毛區侵襲形成絨毛內間葉及微血管之外，它們也會穿越 連接胚胎與絨毛區的連接柄(connecting stalk)，在連接柄形成血管，讓連接柄在 20 天時形成臍帶的基本構造。(Sadler TW, 1995)
絨毛基本構造
隨著絨毛間空腔逐漸接受胎兒與母體血液循環，此兩種血液循環會非常接 近。它們被所謂的「胎盤障壁」分開，靠的是微妙的胎盤絨毛構造。母血進入絨 毛間空腔(intervillous space)之後，面對的是游離型絨毛(floating villi)最外一層的 細胞：胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)，然後是ㄧ層連續或不連續的細 胞型滋養層母細胞(cytotrophoblast)，然後是一層基底膜(basement membrane)、一 層胎兒血管內皮細胞，最後是進入胎兒微血管。養份及氧氣交換就在這裡進行，
有如肺臟的肺泡一般。基底膜之下如果沒有血管，則是進入絨毛基質(stroma)。(圖 一)
子宮胎盤血管的形成(Uteroplacental vessels)
胎盤附著在子宮內膜的區域，當生產時會隨著胎盤剝落的部分，稱為基底板 (basal plate)；相對留在子宮的部分，就稱為胎盤基(placental bed)。為了建立子宮 與胎盤之間的血液循環，母體的子宮血管(子宮動脈)，就必須要穿過基底板，最 後才能灌流到絨毛間空腔，完成初級的子宮胎盤血管系統。通常子宮動脈進入子 宮內膜和基底板後，稱為「螺旋動脈」(spiral artery)，但是也有學者將「螺旋動
脈」定義為未懷孕的子宮，懷孕後稱為「子宮胎盤動脈」，不過目前大多數的文
獻均認為它們是同意詞。
有關於人類的胎盤，到底母體的血液循環甚麼時候開始進到絨毛間空腔，研 究報告還很分歧(Brosens and Dixon, 1966;Carter, 1997;Castellucci, Scheper et al., 1990;Kaufmann, Black et al., 2003)，也有觀察動物胎盤的報告(Enders and
Blankenship, 1997)。有報告顯示，受孕後 28-30 天，螺旋動脈的末梢開口會進入 絨毛間空腔，而在絨毛間空腔也出現血液的出口，流回母體的子宮靜脈系統 (Carter, 1997;Castellucci, Scheper et al., 1990;Kaufmann, Black et al., 2003))，他們 觀察還發現入口和出口數目幾乎一樣。但是也有人認為動脈入口比靜脈出口多 (Boyd JD and Hamilton WJ, 1970)，似乎研究方法會影響其結果。在足月的胎盤，
有報告基底板約每一平方公分有 1 或 0.5 個動脈血管開口(Brosens, 1964)，後續 研究報告說足月的胎盤有 120 個動脈血管開口(Brosens, Robertson et al., 1978)。
子宮胎盤血管的形態改變
除了開口數字以外，另外一個重點反而比較重要，就是這些血管的在胎盤發 育過程中的生理性變化。其中之一是螺旋動脈的內皮細胞會被滋養層母細胞所置 換(Brosens, Robertson et al., 1967;Ramsey, 1962;Ramsey, 1981)。胎兒在母體內生 長，必須仰賴母體供應足夠的養分，但是母體必須產生一些變化，以改變母體可
能為避免養分流失而產生的生理性及免疫性的「衝突」或「抵禦」。同時在整個
懷孕過程中，母體身體產生巨大生理變化時(如血壓改變)，儘可能減少對胎兒的 衝擊。螺旋動脈的內皮細胞由原先受母體血液動力學所調控的血管內皮細胞，漸 次被不受母體控制的，所謂的血管內絨毛外細胞型滋養層母細胞(endovascular extravillous cytotrophoblasts, endovascular EVTs)所取代，多少有這方面的意義 (Haig, 1993)。
螺旋動脈的再鑄型(Remodeling of spiral arteries)
上述的血管內絨毛外細胞型滋養層母細胞取代螺旋動脈的血管內皮細胞程 序，就是大家公認的螺旋動脈的再鑄型(remodeling)。
Brosens et al 在 1967 稱這個現象叫子宮胎盤動脈的「生理性變化」
(physiologic changes)(Brosens, Robertson et al., 1967)。他們認為這個程序包括四個 步驟：(1)滋養層母細胞侵襲血管內皮，明顯取代血管內皮細胞及血管中央層的 平滑肌細胞，(2)血管失去彈性，(3)血管擴張，變成寬闊、無法收縮的管狀通道，
(4)失去血管運動的調控(vasomotor control)。
螺旋動脈的失去彈性及收縮能力，並遠離母體的血管運動的調控，其實對於 維持穩定的胎盤血液循環有很大的幫助。同時隨著懷孕進行，胎兒所需營養日漸 增加，而母體血流阻抗也會隨之降低，結果子宮胎盤動脈的血流量也可以配合胎 兒需要而逐漸增加。
螺旋動脈的再鑄型如果出現欠缺，可能導致胎兒的發育遲滯。這在妊娠性高 血壓及子癇前症(preeclampsia)可以看到(Feinberg, Kliman et al., 1991;Kaufmann, Black et al., 2003)。這個部分在後面還會說明。(圖二)
再鑄型的階段性變化
近年來對於子宮胎盤動脈的生理性變化的研究愈來愈多。也因此對於它們的 過程有更進一步的了解。目前已經了解這整個過程大約可以分為三階段。
第一階段：螺旋動脈的內皮細胞變為嗜鹼性、出現細胞內空泡、平滑肌細胞 失去完整的結構排列及管徑擴大(Craven, Morgan et al., 1998;Kaufmann, Black et al., 2003)。此時血管內皮看不到滋養層母細胞，所以此階段變化與滋養層母細胞
的侵襲較無明顯關聯，主要是母體本身子宮內膜(蛻膜)之局部變化有關。
第二階段：螺旋動脈周邊出現絨毛外細胞型滋養層母細胞(EVTs)。當第一階 段完成之後，在著床部位的螺旋動脈開始有滋養層母細胞靠近及進行血管內侵 襲。這個部分的動物實驗(天竺鼠為主)資料顯示(Hees, Moll et al., 1987;Nanaev, Chwalisz et al., 1995)，血管中層的平滑肌細胞漸次減少，出現類纖維蛋白元 (fibroid)沉積，然後滋養層母細胞侵襲進來。他們發現來到螺旋動脈周邊的滋養 層母細會分泌一氧化氮(nitric oxide, NO)，一種很強的促進血管擴張的內生物
質，造成螺旋動脈的擴張及有利於滋養層母細胞侵襲到血管內(Nanaev, Chwalisz et al., 1995)。雖然滋養層母細胞會破壞血管中層的平滑肌，也會造成血擴張，但
是似乎一氧化氮的效應才是主要的影響因子。
第三階段：螺旋動脈血管內的滋養層母細胞浸潤變得明顯。隨著再鑄型的進 行，螺旋動脈的血管擴張現象會愈來愈明顯(Brosens, Robertson et al., 1967)。接 近絨毛間空腔(intervillous space)的入口處附近，螺旋動脈的血管內徑擴張將近原 先的 5 到 7 倍寬(Boyd JD and Hamilton WJ, 1970)。以精確的電子顯微鏡觀察，他 們預估原先螺旋動脈經過子宮肌肉層時的血管內徑是 200m，但是到了接近絨毛 間空腔(intervillous space)的附近，血管內徑可以是 500 到 1000m，而動脈開口 處大到 2000m(Sheppard and Bonnar, 1974b;Sheppard and Bonnar, 1974a)。
滋養層母細胞的浸潤與彈性纖維(elastic fibers)的消退是並行的。雖然螺旋動 脈在懷孕過程中仍然會產生新的彈性纖維，但是滋養層母細胞浸潤同時引發的退 行性變化(degenerative processes)，會使得新產生的彈性纖維在以後也漸次消失 (Blankenship and Enders, 1997;Enders, Blankenship et al., 1997;Pijnenborg,
Robertson et al., 1974;Robertson, 1976;Robertson, Manning et al., 1974)。最近的報 告顯示，組織蛋白分解酶(tissue proteolytic enzymes)在這裡有扮演一定的角色。
所以 interstitial collagenase (MMP-1)，gelatinase A (MMP-2)，stromelysin 1 (MMP-3) 及 gelatinase B (MMP-9)均有被注意到在此有所表現(Blankenship and Given, 1995;Blankenship and King, 1994b;Moll and Lane, 1990)。滋養層母細胞的侵襲也 會伴隨螺旋動脈管壁類纖維蛋白元(fibroid)沉積，最後也使得原本有彈性的血管 變成硬化的通道(Brosens, Robertson et al., 1967)。雖然如此，他們用-smooth muscle actin 抗體去染螺旋動脈管壁，仍然可以片段染色。
滋養層母細胞逐漸形成單層或多層的管內細胞，有時會形成管內細胞塊 (plug) (Brosens, Robertson et al., 1967;Carter, 1997)。細胞塊甚至會阻塞血管，其 結果有何生物意義目前仍待研究，不過由於螺旋動脈會有分枝，所以不易影響絨 毛間空腔(intervillous space)的血流。有些滋養層母細胞進到管內就定位之後，型
態上會變得類似內皮細胞，所以用一般的組織染色不易分辨。如果 anti-cytokeratin 17(CK-17)或 GZ112 去染色(Hartmann, Blaschitz et al., 1997;Proll, Blaschitz et al., 1997)，可以發現大部分的子宮內膜區的螺旋動脈內層細胞和內三分之一的子宮 肌肉層區的螺旋動脈內層細胞，均為陽性反應，表示他們的細胞特性是屬於滋養 層母細胞來源。
再鑄型的細胞學機轉
滋養層母細胞要進到子宮胎盤動脈，首先要先附著於螺旋動脈。因此細胞粘 連分子(cell adhesion molecules, CAMs)的運作應該是首要研究的對象。細胞附著 分子(CAMs)應該對於滋養層母細胞的組織侵襲、與細胞外間質(extracellular matrix, ECM)的附著、形成細胞聚落(colonies)及管內浸潤均有關係。
選擇素(Selectins): 螺旋動脈血管內的滋養層母細胞會表現
Sialyl-Lex(Lewisx)(King and Loke, 1988)。它是 E-selectins 及 P-selectins 的配體 (ligands)。科學家認為 Sialyl-Lex 與 selectins 的互動與滋養層母細胞附著於螺旋 動脈血管及在血管內移行(migrate)應該有關聯。
ICAM-1: 原先的研究認為 intercellular adhesion molecule-1 主要表現在床處 的子宮內膜(Ruck, Marzusch et al., 1995;Ruck, Marzusch et al., 1994)。但是證據顯 示大型顆粒淋巴球、巨噬細胞及血管周邊間質型滋養層母細胞及血管內滋養層母 細胞也都有表現(Burrows, King et al., 1993a;Burrows, King et al., 1993b;Burrows, King et al., 1994)。ICAM-1 的功用是如何，除了對於滋養層母細胞的組織侵襲有 影響之外，其他部分目前還需要進一步研究。
胞融型滋養層母細胞(syncytiotrophoblast)的特性
到了這個階段，母體胎兒或是胎兒母體物質交換開始要展開。外為組織的交 換仍舊有限，真正胎盤的代謝作用及內分泌功能主要是要在絨毛(villi)裡發生。
在整個胎盤的發育過程，絨毛的型態有很多種，但是基本構造是一致。前已述及，
包括：
1. 絨毛由胞融型滋養層母細胞層所包覆。這一層類似上皮結構的細胞層，將絨 毛內部構造(屬於胎兒部分)與母體血液分開。與其他細胞所不同之處，此細 胞層不是由一個個單一細胞所構成，它們是一層連續、不間斷、多細胞核及 無細胞間隔的細胞組成。
2. 胞融型滋養層母細胞之下，由一層細胞型滋養層母細胞(cytotrophoblast)組 成。它們分布較不連續，有時是單一細胞，有時是聚集成團的細胞
(Langhans’cells)。這裡的細胞型滋養層母細胞主要是負責胞融型滋養層母細 胞的生長及再生(regeneration)。
3. 滋養層母細胞之下的基底膜將上述兩種滋養層母細胞與絨毛的基質(stroma) 部分分開。
4. 基質層由多種結締組織細胞、結締組織纖維及基本物質構成。最重要的是，
胎兒血管分布於此。在大型的幹絨毛(stem villi)，包含動脈和靜脈；如果是分 枝的絨毛，則血管多半是以微血管或靜脈竇為主。(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)
我們要了解胞融型滋養層母細胞的重要性，是必要先知道它們是甚麼樣的細 胞特性。我們已經知道，胞融型滋養層母細胞是一層連續、不間斷的細胞，包覆 幾乎所有的絨毛表面及部分的 inner surface of chorionic plates 及 basal plates。也 就是說，它們也是所有絨毛間空腔(intervillous space)的內襯細胞。即使以電子顯 微鏡觀察，它們也是連續的構造，似乎無法將它們分成不同的單位。只有在懷孕 的末期，因為胞融型滋養層母細胞的局部退化，而有區域性的 plaques，以及 fibrin-type 的 fibrinoid 填充(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)。
過去有報告顯示，胞融型滋養層母細胞的 brush-border membrane (BBM) (面 向母體血液循環)及 basal plasma membrane (BPM)(面向 cytotrophoblast 或是基質 層)，是有些不同。據了解它們的 calcitonin、 calcitonin gene-related peptide 、 muscarinic 及 transferring receptors，在數目、affinity 及 distribution 均不同。
G-protein subunits、protein kinase C isoform 也有明顯分布上的差異(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)。
胞融型滋養層母細胞的表面，充滿了許多的微絨毛(microvilli)，它們代表了 大宗的母體胎兒的交換界面。到了足月，這些微絨毛的存在，造就了交換面積的 大量增加。據估計，總絨毛面積可以達到 12m2，大約是增加 7.7 倍。也因此微 絨毛也成為免疫學及細胞生物學研究很有興趣的區域(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)。
在微絨毛的表面，有一些糖類，稱為 glycocalyx，一種 polysaccharides，似 乎與免疫學上的關聯性，有被注意到。例如有些 lectin-binding sites 究是一個例 子。目前我們要研究的 mucins，基本上就是一種高度醣化的蛋白質，而已知的 結果顯示它們在胞融型滋養層母細胞的表面有明顯表現。表示有大量的醣類分枝 會暴露在細胞膜表面，它們是面向母體血液循環，所以它們的疫學及細胞生物學 上的意義就值得好好研究。
如果以穿透式電子顯微鏡觀察，微絨毛的表面有許多 membrane-bound enzymes，例如 alkaline phosphotase， galactosyltransferase，a-amylase，protein kinase，cyclic 3,5-nuceotide phosphodiesterase，5-nuceotidase 及 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase。其他的分析包括與 transplacental transfer 有關的 surface receptors；其中與 hormones 及生長因子有關的部分也有一 些報告。例如 insulin receptor，insulin-like growth factor(IGF-II)，interleukin-6 receptor，VEGF，colony-stimulating factor 及其 receptor 等等(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)。
其中 epidermal growth factor receptor (EGFR)，是 proto-oncogene c-erbB-1 的 gene product 及相關的 proto-oncogene c-erbB-2 的 gene product，似乎吸引了不少 目光(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a;Evain-Brion and Alsat, 1994)。EGFR 已知在胞融型滋養層母細胞及絨毛外細胞型滋養層母細胞(EVTs)有表現。它們在 羊水、臍帶血管及胎盤組織均可偵測到。EGF 可以引發滋養層母細胞的分化(分
化成胞融型滋養層母細胞)及增加 human chorionic gonadotropin (hCG)及 human placental lactogen(hPL)的製造。EGF 對於滋養層母細胞的 proliferation 的功能仍 不明顯(Muhlhauser, Crescimanno et al., 1993)。
至於 proto-oncogene c-erbB-2 的 gene product，屬於 HER family，在許多惡 性腫瘤可以被發現與 EGFR 一起表現。它們在發展及維持惡性性狀上有功能。報 告顯示，這兩種 receptors 在絨毛的胞融型滋養層母細胞會同時表現，但是在 proliferating 的絨毛外細胞型滋養層母細胞(EVTs)，則只有 EGFR 有表現。在這 裡，c-erbB-2 似乎只表現在 differentiating 細胞，而不在 proliferating 細胞 (Muhlhauser, Crescimanno et al., 1993)。
絨毛的表面以胞融型滋養層母細胞層為主。可以細分為三個層帶(zones)。
外層：吸收層，充滿 vesicular uptake 的胞器，以及細胞骨幹(cytoskeleton)，
所以又稱 syncytioskeletal layer。
中層：分泌層，主要胞器都在這裏。
基底層：少量的胞器。
中層的厚度的變異就成為絨毛的表面的特異性的變化所在。這在第二孕程以後會 漸次出現。為何出現這樣的分別，有許多種說法，但是學者相信，這可能是滋養 層母細胞的處於不同 apoptosis cascade 的 stages 所致。從細胞融合、變厚、多細 胞、rough endoplasmic reticulum (EM)變化，到包含 apoptotic 細胞核的 syncytial knots 突出細胞膜為止，一連串的不同變化的階段所致。
胞融型滋養層母細胞層到了足月，厚度大約是 2-10m，端視細胞核的位置 而定。前已述及，胞融型滋養層母細胞表面會有 microvilli。大部分的胞融型滋 養層母細胞層是充滿 rough EM (rEM)，與 energy metabolism 有關(Boyd JD and Hamilton WJ, 1970)。一些區域則出現以 smooth EM (sEM)為主的胞融型滋養層母 細胞。這些細胞也會有較多的 tubular type 的粒線體，它們的構造與活躍於 steroid metabolism 的內分泌細胞相似。此區域的 3-hydroxysteroid dehydrogenase 及 17-hydroxysteroid dehydrogenase 會增加，也就表示此區域的細胞參與了 steroid
metabolism。
隨著胎盤發育的過程，絨毛區的微血管會與滋養層母細胞愈來愈靠近，這樣 有利於血液交換。所以微血管的基底膜(basement membrane)與滋養層母細胞層的 基底膜便會癒合(fuse)。之後由於靜脈竇的壓力會過來，此時滋養層母細胞的細 胞核可能會被排擠到旁邊，所以在該處細胞核與許多胞器會大量集中，稱為胞融 結(syncytial knots)。
胞融結(syncytial knots)
胞融結的特色是多層的細胞核聚集，然後稍為往外突出。有時候是絨毛表面 的垂直切面所造成，有時要與 syncytial buds, syncytial bridges 及 syncytial sprouts 區別。另外一個鑑別的是 apoptotic knots，裡面則是充滿 aged,dying nuclei (Boyd and Hamilton, 1966;Cantle, Kaufmann et al., 1987;Hamilton and Boyd,
1966;Kaufmann, Luckhardt et al., 1987)。
Syncytial buds 通常是只正常的絨毛表面起伏或分枝的切面所造成。
Syncytial bridges 可能與相近的絨毛表面有融合現象相關。也可能因此造成 intervillous space 內的血管相連。大型的，類似 mushroom 的形狀，裡面也是充滿 細胞核的稱為 syncytial sprouts。目前此名詞已普遍認為是用於絨毛向外擴張的正 常現象。它們在早期懷孕期間很容易看到。通常細胞核排列比較沒那麼緊密。
Apoptotic knots 形狀類似，但是細胞核則更密、稍微細胞有分隔、而且已經 看不到胞器，細胞質也出現退化的現象。因為胞融型滋養層母細胞的壽命是有限 的，所以 normal aging 所造成的 degenerative change 是合理的。
絨毛部細胞型滋養層母細胞(villous cytotrophoblast)
在絨毛表面，細胞型滋養層母細胞形成第二層的滋養層母細胞。它們不同於 第一層的胞融型滋養層母細胞，它們起初是連續的，但是隨著懷孕週數增加，它 變得不是連續的。但是一些細胞型滋養層母細胞會型成所謂的Langhans’cells。
這些Langhans’cells會一直持續到足月。曾經有估算過，懷孕 12 週時，
Langhans’cells約重 2g，但是到了足月，也有 12g。所以 Langhans’cells是持續在 增加它們的數目。由於絨毛表面積在快速增加時，cytotrophoblast 無法趕上，所 以會比較散。由於細胞型滋養層母細胞不似胞融型滋養層母細胞及內皮細胞具有 Fc-receptors，所以無法協助 transfer 免疫球蛋白，因此真正的 maternofetal immunoglobulin transfer 主有在懷孕的晚期，cytotrophoblast 變得 incomplete 以後 才會明顯，就是這個道理。(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)
細胞型滋養層母細胞的內分泌活性
細胞型滋養層母細胞不僅是 trophoblastic stem cells 而已，他們也似乎有內分 泌器官的活性。過去有人認為Langhans’cells是 hCG 的主要來源。當然目前已知 Langhans’cells 的總數，會隨著週數增加而增加，但是 hCG 的血中濃度在懷孕 8 週附近是最高，已後就陸續下降，所以Langhans’cells是 hCG 的主要來源是不夠 的。當然我們現在已了解 hCG 主要是胞融型滋養層母細胞在製造。
正常情況之下，-hCG 是在 syncytial fusion 之前表現，-hCG 是在 syncytial fusion 之後表現，hPL 則是在更晚一些才出現。不過似乎不完全是 syncytial fusion 與否在決定，而是 preocess of trophblastic differentiation 的程度使然。但是在 pathological condition，在 tissue culture，或是一些 condition，如 extravillous 細胞 型滋養層母細胞，sequence of gene expressions 未被 delayed，但是 syncytial fusion 被 inhibited 時，也會出現非胞融型滋養層母細胞也分泌-hCG 的情況。
已知絨毛內細胞型滋養層母細胞(villous cytotrophoblast)，主要是
Langhans’cells，會分泌 somatostatin。Somatostatin 是許多賀爾蒙的 inhibitor。比 如 GH、TSH。Somatostatin 也會抑制胞融型滋養層母細胞分泌的 hCG 及 hPL。
villous cytotrophoblast 還會分泌 corticotropin-releasing factor (CRF)，
gonadotropin-releasing hormone(GnRH)(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)。
滋養層母細胞的週轉作用(Turnover of trophoblast)
已知的報告顯示，在最後的一個月，胎盤絨毛可以重達 90 公克，其中胞融 型滋養層母細胞佔 77.5 公克，細胞型滋養層母細胞佔 12.5 公克。假設一個滋養 層母細胞的平均體積為 1400m3，12.5 公克的細胞型滋養層母細胞應該有 9x109 個細胞。
每個足月胎盤的滋養層母細胞面積是 12m2，每 10,000m2，70 個滋養層母 細胞在四週內行有絲分裂，所以經過運算之後，每天每個胎盤有 3x109的絨毛內 滋養層母細胞行有絲分裂。
大約 15-20%的有絲分裂後滋養層母細胞可能會退化。但是絨毛內滋養層母 細胞數目大致上維持穩定。
一般而言，如果胞融型滋養層母細胞 in culture 沒有經過 syncytial
incorporation，通常 life span 是有限，可能是 2weeks 左右。In vitro 胞融型滋養 層母細胞沒有細胞型滋養層母細胞繼續 fusion，則 hormone production 會急速下 降，甚至幾天內死亡。所以從動物實驗的觀察也一樣可以看到，如果失去細胞型 滋養層母細胞，則胞融型滋養層母細胞通常很快也會 degenerative change 。
其原因何在目前仍不是很清楚。不過 syncytial fusion 之後 transcription 開始 發生 downregulation 似乎是一個可能的理由。研究發現，RNA precursor 最會 incorporation 到細胞型滋養層母細胞和 stromal cells。然而胞融型滋養層母細胞幾 乎沒有 uptake。胞融型滋養層母細胞上的有些基因，如： apoptosis inhibitor bcl-2、
protease caspase 8 以及 anion transporter OAT4，也會出現沒有 transcription 的現 象。這些與 apoptosis 有關的基因的 downregulation 顯然會影響胞融型滋養層母細 胞的 life span 。如果這個現象屬實，那麼胞融型滋養層母細胞的 survival 及 functional activity 似乎就要仰賴 syncytial fusion 以後，從細胞型滋養層母細胞去 獲得所需要的 RNA 了。所以 syncytial fusion 的速度會受大量 RNA 的需求而改變 了。(Benirschke K, Kaufmann P et al., 2006a)
mRNA 因為 RNAse 到處都存在，所以 half-life 都很短。不過很幸運的，胎
盤是 RNAse inhibitors 最多的器官，所以對於 RNA 的 stabilization 有很大的幫忙。
所以總括來說，不僅胎盤需要長大，fusion 也是將可消耗的，但是不能製造的物
質，從細胞型滋養層母細胞’送’到胞融型滋養層母細胞。只有如此步驟方能維持
胞融型滋養層母細胞的存活及維持功能(Huppertz, Frank et al., 1998)。
正常成熟胎盤
在足月的成熟胎盤，主要的結構是 long,slender, mature intermediate villi 然後 有 short,grape-like terminal villi 的分枝。大部分的周邊絨毛的橫切面的直徑大約 是 60-150m。大致上，＜5%的突出結構是 true trophoblast outgrowth，其於的 95%，大部分是 section artifacts。只有一些比較中心的 villi 會出現 stem villi 或 immature intermediate villi。但是不屬於 persisting immaturity 。在 thick section 也 比較會出現 trophoblast tangential sectioning，所以在 thin section 就比較不會有 incorrect impression of sprouting 的情況。
滋養層母細胞在子宮內膜的侵入(invasion)及移動(migration)，最有可能是受 到滋養層母細胞本身、母體及子宮內膜--此時又稱為蛻膜(decidua)的微環境的影 響，近年來隨著分子生物學和細胞生物學的進步，對於此部分的研究也更深入廣
泛，而以下要敘述的黏液蛋白，更是息息相關。
黏液蛋白(mucins)的生物角色
認識黏液蛋白的新角色
黏液蛋白(mucins)屬於一種高度醣化的蛋白質，主要表現在人體內不同類型 的上皮細胞(Hollingsworth and Swanson, 2004)。它們主要分為分泌型(secretory) 和胞膜型(membrane-bound)兩類。前者為上皮細胞所分泌，扮演類似潤滑劑的功 能，包括:第 2、5AC、5B、6、7、8 及 19 型(MUC2,5AC,5B,6,7,8,19)；後者附在
細胞膜上而向外突出，有一段貫通細胞膜(transmembrane domain)，而後一段尾節 在細胞質內(cytoplasmic tail)，包括：第 1、3A、3B、4、12、13、15、16、17 及 20 型(MUC1,3A,3B,4,12,13,15,16,17,20)(圖三)。科學家認為胞膜型黏液蛋白可以 因應外在環境的改變而表現有如反應器(sensors of external environment)的功能。
比如它們的胞外區段(extracellular domain)可以結合特定，或稱做「配體」(ligand) 的分子，或者因為周圍酸鹼度、離子成分改變，或是其他的物理性質互動造成蛋 白質的四維結構改變，於是在細胞質內的尾節可能產生修飾作用(modification)，
包含磷酸化等反應，接著引發系列的細胞內訊息傳遞(signal transduction)。因此 胞膜型黏液蛋白的性狀改變，也被認為與細胞的生長、複製、分化、轉型 (transformation)乃至於細胞的移動、侵襲有關。
目前的文獻報告顯示：第一型黏液蛋白(MUC1)的過度表現
(overexpression)，與直腸、胰臟、膽囊及口腔上皮腫瘤的侵襲性及遠處轉移有關。
許多研究顯示，第一型細胞內附著分子(intracellular adhesion molecules, ICAM-1) 可能就是MUC1的配體(ligand)之一，可以引發鈣離子活化的通路(Rahn, Shen et al., 2004)。Pseudomonas aeruginosa 或它的尾鞭與MUC1結合，也會引發訊息傳
遞(signaling)的作用，包括MUC1胞質內尾端(cytoplasmic tail, MUC1CT)磷酸化，
接著活化MAP 動力酶(MAP Kinase)通路等等(Lillehoj, Kim et al., 2004;Wang, Lillehoj et al., 2004)。MUC1包質內尾端(MUC1CT)訊息亦可藉著-catenin, p120, catenin, p53及型雌性素受體 (estrogen receptor-，ER-)傳至細胞核(Kam, Regimbald et al., 1998;Singh and Hollingsworth, 2006;Wang, Lillehoj et al., 2004)。
(圖四) (圖五) MUC1的細胞質尾端 cytoplasmic tail (MUC1CT)其中一段
(HGRYVPP)被發現是tyrosine phosphorylation site，而platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR)在human pancreatic adenocarcinoma cell lines 可以in vitro 催化此位置的tyrosine phosphorylation，同時在其他cell lines實驗中，刺激PDGFR
可以促進cell invasion。所以MUC1與PDGFR互動誘發的signal transduction似乎 會影響pancreatic adenocarcinoma 的metastatic properties。(Singh, Wen et al., 2007)
而down-regulation of MUC1 protein expression似乎也降低了metastatic potential of pancreatic adenocarcinoma(Tsutsumida, Swanson et al., 2006c)，而此現象與一些被 人認為會增加doubling times的基因 (cyclin B1 及 cyclin D3)出現overexpression 有關。
第四型黏液蛋白(MUC4) 的過度表現也可能跟乳房、肺臟、直腸及胰臟的癌 症有關。而 Singh AP 在 2007 的報告顯示抑制 MUC4 得表現可以壓制胰臟的癌 細胞生長及轉移(Singh, Chauhan et al., 2007)。甚至 Ramsauer VP 在 2003，2006 和 Pino V 在 2006 的報告已發現 MUC4 之如何影響細胞行為，應該與透過 ErbB2 及 ERK 的訊息傳遞有關(Pino, Ramsauer et al., 2006;Ramsauer, Carraway et al., 2003;Ramsauer, Pino et al., 2006)。另外，第二十型黏液蛋白(MUC20)在腎臟有很 高的 mRNA 表現量，在人類胎盤也有中度的表現量。MUC20 的產生，可能會降 低一些蛋白分解酶，如 HGF-induced matrix metalloproteinase (MMP)表現(Higuchi, Orita et al., 2004a)，也使人類胚胎腎細胞株(HEK293 cell line)的細胞複製減少 (Higuchi, Orita et al., 2004c)。
黏液蛋白在子宮及胎盤的角色
我們的分析顯示，人類胎盤的胞膜型黏液蛋白以第一、三、十五、二十型的 基因表現最為明顯。第一型黏液蛋白(MUC1)的研究特別多，第十五型黏液蛋白 (MUC15)則是最近才被定序出來，它的生物功能是何，尚待大家去解密，顯然後 面還有很多研究空間，因此特別在此介紹此二型黏液蛋白。
第一型黏液蛋白表現在許多器官的上皮細胞表面，包括：乳腺、肺臟、腎臟、
胃、膽囊、胰臟，以及女性生殖道。人類第一型黏液蛋白的基因約長 4 到 7 千對 鹼基(kb)，含有七個 exons。蛋白質全長分三段，包括較短的胞質內尾節、貫通 細胞膜區段，以及一塊很大的細胞外區段。後者含有一段是由 20 個胺基酸為單 位，重複 20 到 125 次的序列，富含 serine, threonine 及 proline 等胺基酸，可以接 上許多醣基。核心蛋白分子量約 120 到 225kDa，但是加上醣基以後可以達到 250
至 500kDa。從細胞表面伸展出去甚至可達到 200 到 500nm，遠長於一般的細胞 粘連分子，例如 integrins 或 syndecans(它們不超過 50nm)。這些現象符合我們對 mucins 的看法，即黏液蛋白不僅是細胞的保護屏障，更具有調控細胞粘連的性 質。Muc1 缺乏的小鼠，會有子宮的慢性感染及發炎。已知子宮內膜細胞的表面 富含 MUC1，而體外實驗顯示，內膜上皮細胞表面如果表現出高量的 MUC1，則 囊胚就很難附著到內膜。倘若從細胞表面移除 MUC1，則附著現象才會成立。合 起來說，就是 MUC1 一部分扮演保護子宮內膜免於微生物的侵犯的角色，但是 在胚胎著床時期則必須減少或消失，以利囊胚的附著。
MUC1 的表現，會受類固醇賀爾蒙的調控。例如雌性素會刺激子宮內膜 MUC1 的增加；而黃體素在小鼠實驗中是會對抗雌性素對 MUC1 的效果，但是 在人類的子宮內膜，在分泌期(排卵後黃體素增加的狀態)時，MUC1 的表現是增 加的。不同物種為何效果不同，其機轉仍待研究。不過我們的研究顯示，MUC1 在胎盤的表現，是隨著懷孕週數增加而遞增，而此現象是否與雌性素有關則須進 一步研究。讓我們好奇的是，MUC1 可以增加許多腫瘤細胞的侵襲及轉移作用，
那麼在胎盤是否也表現類似的功能呢?前已述及，滋養層母細胞的細胞學性狀，
包括複製、分化、侵襲等等，與胎盤最後可否完整發育及是否引起子癇前症 (preeclampsia,一種懷孕 20 週以後合併高血壓、蛋白尿及全身水腫的疾病)可能有 關，所以我們進一步想了解 MUC1 對於滋養層母細胞的影響是如何。
第十五型黏液蛋白 MUC15 在人體各組織之中，以在胎盤的表現最為明顯。
但是 MUC15 到底對胎盤的影響是如何，卻也耐人尋味。MUC15 是 2002 年才剛 從牛奶脂肪球被分離出來。它的核心蛋白有 334 個胺基酸，一樣是全長分三段，
包括胞質內尾節、貫通細胞膜區段，以及一塊細胞外區段。目前 MUC15 的生理 功能還沒有人研究。我們發現 MUC15 與 MUC1 有許多類似的性質，如:初步數 據顯示：表現量均會隨著懷孕週數增加而增加、在胎盤絨毛的胞融型滋養層母細 胞(syncytiotrophoblast)及蛻膜區的腺體細胞表現明顯，不過最大的不同點
是:MUC15 在 EVTs 似乎沒有表現。而 MUC15 會抑制 JAR 及 JEG-3 兩個絨毛膜
癌細胞的細胞株的細胞侵襲特性，但是可能是經由增加 tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1,TIMP-2)的表現來達成。由於 EVTs 沒有表現，所以 MUC15 如何在胎盤或蛻膜區發揮影響力，目前還無法解釋。
黏液蛋白的 Epigenetic regulation
MUC1 目前被視為是 oncoprotein，在許多 cancer 中與 malignant potential 有 關。已知的一些 cancer-related genes，p16 或是 E-cadherin，它們都有受到 epigenetic regulation 的調控。最近的研究顯示 MUC1 在 breast cancer cell line 的 表現，似乎也受到 epigenetic regulation(Watanabe, Kashiwagi et al., 2008)。DNA methylation 及 histone H3-K9 modification 被認為與 MUC1 gene expression 有很 重要的關聯。所以了解其 epigenetic 的改變，對於癌症產生的風險了解及預測疾 病預後，幫助很大。所以同樣地，了解 MUC1 在不同週數的胎盤中的 gene expression 的改變的 mechanism，包括是否有 epigenetic regulation 也是未來的方 向之一。
本研究的假說
一、黏液蛋白與滋養層母細胞的蛻膜內侵襲作用有關
前面已經談過，胎盤是胎兒賴以生存的生命線。胎盤可以供應胎兒在子宮內 所需的氧氣和養份。而胎盤內的子宮動脈的末端血管「螺旋動脈」在胎盤發育過 程中，能否充分完成動脈的再鑄型(remodeling)，攸關胎盤功能的優劣及胎兒的 發育是否正常。而螺旋動脈的再鑄型與絨毛外細胞型滋養層母細胞取代螺旋動脈 的血管內皮細胞的程序有關，所以滋養層母細胞在子宮內膜(蛻膜)區是否可以正 常地移行(migration)、侵襲(invasion)，滋養層母細胞最後能否靠近及進行螺 旋動脈血管內侵襲是十分重要的。
由於前面已經說明，黏液蛋白的性狀改變，被認為與細胞的生長、複製、分
化、轉型(transformation)乃至於細胞的移動、侵襲有關。而一些胞膜型黏液蛋 白在胎盤的表現特別多，所以我們假設黏液蛋白與滋養層母細胞的蛻膜內侵襲作 用有關。
我們會觀察主要的黏液蛋白(主為 MUC1 及 MUC15 等)在整個懷孕過程中不同 時期的基因和蛋白質表現，組織中的分布及它們的可能角色。同時我們會以細胞 生物學的研究方法，了解黏液蛋白對於細胞型滋養層母細胞的侵襲作用的影響。
我們會用絨毛膜癌的細胞株(主要細胞成分就是滋養層母細胞)，給予
transfection 之後，在黏液蛋白 overexpression 的情況下，以 invasion assay 來觀察滋養層母細胞的侵襲作用會如何改變，之後再以 zymography 或其他研究 來尋找可能的機轉。
二、 研究黏液蛋白與滋養層母細胞的互動可以提供子癇前症的病生理學研究的 參考
同樣的研究方法也將會應用到一些子癇前症的胎盤的變化。黏液蛋白在子癇 前症的胎盤的表現量是如何，目前沒有報告。由於我們已知子癇前症的胎盤，其 滋養層母細胞侵襲作用是受到抑制而不完全的，所以黏液蛋白如果會對滋養層母 細胞的組織侵襲作用有影響，勢必在子癇前症的產生，其病生理學方面，一定有 它們的角色。我們將在本研究中觀察 MUC1 及 15 在子癇前症的胎盤中，它們的 基因、蛋白質及組織免疫化學的表現及分布狀況，以提供將來後續研究的重要參 考依據。
黏液蛋白研究的意義
黏液蛋白的特殊分子結構，使得它們具備了多種生物功能的特性。分泌型黏 液蛋白扮演類似潤滑劑的功能，胞膜型可以表現有如因應外在環境的反應器。大 分子的黏液蛋白，其胞外區段尚可以做為抵擋微生物入侵的屏障，避免細胞膜與 外在環境(包括細胞訊息分子)的直接接觸。而胞外區段的醣化作用，也可能與生
物功能的不同表現相關，而其不同的抗原性，也與細胞組織的免疫反應息息相 關。所以研究黏液蛋白的生物角色，方向絕對是多元化的。我們目前的研究數據 顯示，MUC1 在重度子癇前症的胎盤表現，似乎不同於正常的胎盤。是否意味著 重度子癇前症的胎盤，其滋養層母細胞侵襲作用是有受到的 mucins 的影響。由 於我們只能從生產的胎盤觀察，所以重度子癇前症的胎盤在妊娠早期是如何，目 前仍不得而知。將來建立母體血中監測 mucins 的方法，似乎可能成為預測懷孕 預後的其中一項方法也說不定。總之 MUC1 與 preeclampsia 之因果關係，仍待我 們繼續去研究。整體而言，不論是 secretory 抑或是 membrane-bound 的 mucins，
它們的生物學角色，應該不只於原來我們所認知的 mucins。
滋養層母細胞的功能攸關胎盤的良莠，所以 mucins 在這裡的角色為何，確 實值得我們好好研究。
第二章 研究方法與材料
一、臨床組織之收集
我們收集三個孕程(trimester)的胎盤或絨毛組織，包括正常及有子癇前症的案 例。第一孕程(first trimester)是8-14週，第二孕程是15-28週，第三孕程是29到42 週。第一孕程收集到的是絨毛組織為主，二、三孕程則是胎盤。組織均由台大醫 院婦產部產房取得。實驗步驟已穫醫院之倫理委員會通過，取樣均獲受試者之同 意。胎盤取1.5x1.5公分面積，0.5公分厚，面對子宮方向之部分。用於組織免疫 染色的胎盤組織以4% 福馬林paraformaldehyde / phosphate buffered saline (PBS) 浸泡。作RT-PCR的組織以RNA later (Qiagen, CA,USA)保存，與作西方墨點檢驗 Western blot analysis的組織存在-800C冰箱。
二、細胞株及細胞培養
我們自新竹食品工業發展研究所購買人類絨毛膜癌(human choriocarcinoma)的細 胞株JAR及JEG-3。細胞以Dulbecco’smodified Eagle’smedium (DMEM)(Biowest, Florida, USA) 保存，加上 10% 的fetal bovine serum (FBS) (PAA Laboratories, Linz, Austria)，以及100 IU/ml的 penicillin和100 μg/ml 的streptomycin (Biowest) 於humidified tissue culture incubator培養，370C及5% CO2atmosphere。
三、北方墨點檢驗
我們自Clontech公司(BD Biosciences, CA, USA)購買多種組織北方墨點檢驗試紙 Multiple Tissue Northern (MTNTM) Blot。加上32P-labeled random-primed之
full-length MUC15 comlementary DNA (cDNA)作為探頭。在650C環境下過夜配對 (hybridization)。之後550C下沖洗一小時，採用含2x standard saline citrate及 0.5%
sodium dodecyl sulphate (SDS)之buffer，用Kodak BioMax film之autoradiography判 讀signals。
四、RNA萃取及RT-PCR
全RNA以Trizol reagent (InVitrogen, California,USA)依據manufacturer’sprotocol萃 取. 取 2 micrograms之全RNA用StrataScript reverse transcriptase (Stratagene, CA,USA)作reverse-transcription (RT-PCR)以取得 cDNA 並收在 25 μl體積中。我 們同時作conventional和quantitative PCR。作法是：取 2 μl的cDNA aliquot， PCR primers 參考表一。PCR 產物在2% agarose gel上跑膠，用ethidium bromide觀察。
(Argueso, Balaram et al., 2002;Argueso, Spurr-Michaud et al., 2003;Bernacki, Nelson et al., 1999;Gipson, Spurr-Michaud et al., 2003;Higuchi, Orita et al., 2004d;Higuchi,
Orita et al., 2004b;Higuchi, Orita et al., 2004c;Higuchi, Orita et al., 2004a;Williams, McGuckin et al., 1999;Williams, Munster et al., 1999)
五、利用 Escherichia coli 製造MUC15的recombinant protein
我們以RT–PCR從normal human colon的全RNA clone出partial human MUC15 (Genbank Accession No. BC020912)。sense primer是5’-GGg gta ccG ACA TAA ACA CAA CAC AG-3’。 anti-sense primer是5’-CCG ctc gag GGG ATC TGA CGT ATT TGG-3’。PCR產物再clone到 pET30a(+) (Novagen, Madison, WI, USA)以製 造MUC15-His fusion gene，其insert用DNA sequencing來確定。為表現MUC15 recombinant proteins 我們將pET30a/MUC15 plasmids transform到 E. coli的 BL21。而 MUC15-His expression 用 1 mM 的isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)來誘發。
六、建立vectors
以RT–PCR來clonine full-length human MUC15 (BC020912)，用的total RNA是來自 normal human colon。 sense primer是5’-CGG GAT CCC GAC AAT GTT GGC CTT AGC C-3’，而anti-sense primer是5’-GCT CTA GAG CCG TTC CAT ACA GAA
GTA CG-3’。PCR 產物clone到pcDNA3.1/myc-His (InVitrogen)來generate
MUC15/myc-His fusion gene。其insert用DNA sequencing來確認。MUC1的vector 則是贈送品：control expression vector pHb-Apr1-neo (Mock) orpHb-Apr1-neo containing full-length human MUC1 (MUC1) (a gift from Dr. Michael A.
Hollingsworth, Eppley Institute for Research in Cancer and Allied Diseases, University of Nebraska Medical Center, Nebraska)(Burdick, Harris et al., 1997)
七、Matrigel組織侵襲性檢測(invasion assays)
我們用BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber (BD Bioscienses, Massachusetts, USA)來監測細胞的invasion assays。分析方法依據manufacturer的protocol，且可 參考以前的描述(Huang, Liang et al., 2007)。簡單來說：JAR細胞株取5X104或 JEG-3取2X105的細胞量於500l的DMEM中置入chamber中。在humidified tissue culture incubator中，370C，5%的CO2atmosphere環境48hrs後觀察matrigel的invasion 的程度。non-invading cells會留在matrigel的membrane的upper surface。我們用 cotton-tipped swab刮除 這些上層細胞。invaded cells則會跑到membrane的lower surface。我們用100% methanol固定它們，然後以0.5% crystal violet (Sigma)染色。
蒸餾水沖洗兩次，將chamber風乾。利用phase contrast microscope計算每一個field 有幾個invaded cells。以six random fields per invasion chamber得出 means ± SD。
八、Mucins的過度表現(overexpression)
取5X105個JAR或JEG-3細胞，以4g的pcDNA3.1/myc-His control plasmids (標示 為Mock)或MUC15/pcDNA3.1/myc-His (標示為MUC15)作transient transfection，或 以2g 的control expression vector pHb-Apr1-neo (Mock) 或pHb-Apr1-neo
containing full-length human MUC1 (MUC1) ，以Lipofectamine 2000 (InVitrogen) 促進反應。48 h後所有細胞均被回收。
九、抗體來源
Anti-MUC15：將聯結了MUC15的synthetic N-terminal peptide：
hSPPLNLPNNSHGITDFS (MDBio Inc., Taipei, Taiwan)的keyhole limpet hemocyanin (Pierce, Illinois, USA)注入rabbits，以製造 anti-human MUC15 polyclonal antibody。簡單來說：以0.5 mg的conjugated peptide作為每次的
immunization，總共做了nine boosts來enhance titer。Anti-serum使用聯結了MUC15 peptide的CNBr-sepharose beads，以affinity purification的方式純化。
Anti-MUC1：Mouse anti-MUC1 monoclonal antibodies (mAbs) (clone VU4H5及 M2C5)及 mouse anti-cytokeratin (CK)7 (或標示成KRT7) mAb是購自Santa Cruz (California)。 Mouse anti--actin (ACTB) mAb是購自BD Pharmingen (California)。
Goat anti-mouse IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies 購自Vector Laboratories (California)。
十、組織免疫化學染色法
胎盤切片以xylene去蠟(de-paraffinize)然後以系列之graded alcohols作
re-hydration。以1% H2O2in PBS，計10min，去除endogenous peroxidase的活性。
再以PBS rinse三次，5% non-fat milk/PBS incubate 30 min，以減少non-specific bindings. Sections 與primary antibodies incubate：anti-MUC1 mAb VU4H5(1:400)，
for anti-MUC1 mAb M2C5 (1:100)，anti-MUC15 polyclonal antibody (1:400)，
anti-cytokeratin (CK) 7 monoclonal antibody (1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)，或anti-Ki67 monoclonal antibody (1:100; Santa Cruz Biotechnology)， 用5%
non-fat milk/PBS稀釋後在40C 16h。用PBS rinse兩次，以Super SensitiveTM link-Label IHC detection System (BioGenex, California, USA)系統，配用
3,3-diaminobenzidine liquid substrate system (Sigma)來判讀免疫染色的結果。所有 切片都用hematoxylin，1 min 作為counterstain。以UltraKitt (J.T. Baker, Deventer, Holland)來mount。Negative controls採用同濃度isotype matched control IgG來取代
primary antibodies。
十一、定量real-time PCR
採用Quantitative PCR System Mx3000P (Stratagene)來分析胎盤之 MUC15
expression。依據manufacturer’sprotocol，簡單來說：在25-l 之volume中，含2 l cDNA，400 nM個別的sense及anti-sense primers，12.5lBrilliant ®SYBR®Green QPCR Master Mix (Stratagene)來做反應。PCRs過程是950C incubation 15 min，接 著40個amplification cycles：30-s denaturation at 950C, 50-s annealing at 540C, 30-s extension at 720C. 所有樣品均做三套以資分析，而產品純度皆以real-time PCR cycles結束時的dissociation curves來檢定。MUC1及MUC15 expression的Relative quantity to-actin是以MxPro Software (Stratagene) normalized之後分析。
十二、西方墨點檢驗(western blot)
胎盤組織在含有1% Triton X-100, 20 mM Tris–HCl (pH 8.0), 160 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride的lysis buffer中讓它homogenized
(Huang, Chen et al., 2006)。Insoluble material則以10,000 g離心15 min去除。取40g 的proteins去做electrophoresis：6% SDS- polyacrylamide gel，transfer到Hybond enhanced的chemiluminescence nitrocellulose membrane (GE Healthcare, UK)上。
MUC1 protein 以mouse anti-MUC1 mAbs來detection。MUC15 proteins是以rabbit anti-MUC15 polyclonal antibodies 來detection。internal control採用 Actin，用 anti-actin monoclonal antibodies (BD Pharmigen, California, USA)來detect。觀察 Bands的方法是以horse-radish peroxidase conjugated secondary antibodies (Vector Laboratories, California, USA)一起incubate後，以chemiluminescence reagents (GE Healthcare)判讀。Mucins的 signals 再用ImageQuant 5.1 software (Molecular Dynamics, CA, USA) normalized to actin signals後做定量分析。
十三、以SiRNA knockdown MUC15 expression
對抗MUC15的表現的small interfering RNA (siRNA) oligonucleotides 及control siRNA是購自Dharmacon Research, Inc. (Illinois, USA)，它們分別是用 custom SMARTpool 及 non-targeting siRNA pool來合成。在MUC15的 knockdown實 驗，JAR及JEG-3細胞以Lipofectamine 2000 (InVitrogen)，最後siRNA濃度是100 nmol之下，將siRNA transfect上去。細胞先以serum-free DMEM medium incubate 4h之後，改用complete DMEM medium (含10% FBS)再incubate 48 h，然後再harvest 細胞。MUC15 expression 是否有被knockdown是以real-time RT–PCR及western blot來確認。
十四、Gelatin zymography
以Conditioned media在serum-free DMEM下培養transfected cells cultured 48 h，用 8% SDS-polyacrylamide gel co-polymerized with 1% gelatin 跑 electrophoresis。之 後gels用2.5% Triton X-100洗 30min 兩次，然後在developing buffer (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, and 0.05% Brij35, pH 7.5)下 incubate 16 h。
incubation之後，gels用Coomassie Brilliant Blue R-250 (0.5% in 50% methanol, 10%
glacial acetic acid) 染色2 h，再以10% glacial acetic acid及20% methanol做destain。
十五、統計分析
我們以Student t-test 或Mann-Whitney U-test 來做statistical analyses。Data 以 mean ± SD來呈現。P<0.05表示 statistically significant。
第三章 結果
第一部分 不同人體器官組織的MUC15 mRNA的表現型態
MUC1, 3, 4, 12, 15, 16, 17,and 20的gene transcripts 以RT–PCR分析結果 (表一, 圖六，A)：我們發現MUC1, 3, 15, and 20在足月胎盤的表現量最高。MUC13 及 17表現量中等，而 MUC4, 12, and 16 則很低。表現量最高的mucins之中，我們 對於MUC15的了解最少，故我們首先將focus擺在MUC15的研究。為了確認 MUC15 在不同人體器官組織的mRNA的表現型態，我們用commercialized human tissue northern blot 來分析。在不同人體器官組織裏， MUC15 mRNA在胎盤有最 強的 表現 (圖六，B)，在肺及腎臟有中等表現量 。我們也發現MUC15有兩種 不同大小的mRNA product在胎盤，但是在肺及腎臟則只有一種size。在其他人體 器官組織，包括 brain, heart, skeletal muscle, colon, thymus, spleen, liver, small intestine, 及peripheral blood leukocytes, 幾乎很少或甚至沒有表現MUC15。所以 表示MUC15在胎盤表現特別活躍；此外，胎盤可以表現兩種forms的MUC15，推 測最有可能是membrane-bound 和 secreted forms這兩種。為了確認，我們又設計 specific primers ，讓它可以同時amplify membrane-bound form及secreted forms of MUC15，然後出現different sizes of MUC15 by RT–PCR (表一, 圖六，C). 所以証 明 human placentas 同時表現membrane-bound and secreted forms 的MUC15 mRNA。
第二部分 不同懷孕週數之胎盤的MUC1及MUC15 mRNA表現
MUC1：以Quantitative RT-PCR偵測MUC1 mRNA在不同孕程的胎盤中的表現量 發現，第三孕程明顯高於第一孕程(P＜0.01)及第二孕程(P ＜0.05) (圖七，A)。 第 二孕程雖然也高於第一孕程，但是差異不明顯(P＝0.17)。代表性的quantitative RT-PCR 的amplification plots顯示在圖七之B。這些結果顯示胎盤中MUC1 mRNA expression是隨著懷孕週數的增加而增加。
MUC15：MUC15 mRNA表現量也是隨著懷孕週數進展而增加(圖八，A)。第二孕 程的 MUC15 mRNA 表現量明顯高於第一孕程(P＜0.05)。第三孕程則明顯高於 第二孕程及第一孕程。同樣地，代表性的quantitative RT-PCR 的amplification plots 顯示在圖八之B. 這些結果也類似MUC1，顯示胎盤中MUC15 mRNA expression 是隨著懷孕週數的增加而遞增。
第三部分 MUC1及MUC15的蛋白質表現
為了了解mRNA表現量與protein expression量是否一致，我們繼續作western blots，結果如下。
MUC1： 以clone VU4H5的anti-MUC1 mAb偵測，我們看到兩個 major bands (170 kDa 及 ＞250 kDa)，顯示胎盤中有two isoforms of MUC1 (圖九，A)的可能。此 外，第三孕程胎盤的protein expression量，果然明顯高於第二孕程及第一孕程，
這與mRNA表現量的趨勢是符合。如果用clone M2C5的anti-MUC1 mAb偵測，
可以recognized與VU4H5看到的不同的isoforms(圖九，B)。將signals of VU4H5- and M2C5-reactive MUC1定量，可以得到更明顯的趨勢(圖九，C)。
MUC15：首先我們要先確認自製的anti-MUC15 polyclonal antibodies的
specificity，所以我們就用E. coli lysates，看有誘發及無誘發recombinant MUC15 proteins (~37 kDa)之後的anti-MUC15 polyclonal antibodies的辨識能力來判斷。結 果有用IPTG作induction of MUC15 protein expression的才會被binding(圖十，A, +IPTG)，顯示出我們自製的anti-MUC15 polyclonal antibodies的 high specificity。
接著我們作western blot，第三孕程胎盤的MUC15 level也是明顯果然明顯高於懷 孕早期的胎盤。(圖十，B、C)。此與real-time RT–PCR的結果亦符合。另外MUC15 的protein band有出現smear，不過大致是在~120 kDa的位置，此則與以往的結果 一致。
