第三章 實驗材料與方法

3.1. 樣品製備

3.1.2. 基因位點追蹤的菌株

O. TCH3 (hupA-mturquoise::FRT::yjaH):

此菌株是先以 MG1655 的菌株植入雙色抑制子螢光融合蛋白系統序列 yciH::FRT::Ptet::tetR-yfp::TSAL2, PparABCb:: parBb-mcherry::B1006::osmB 形 成 YJL2 突變株。

再以 YJL2 作為奠基植入 hupA-mturquoise::FRT::kanR::FRT::yjaH 形成 TCH3K 添加類核標記的突變株。

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再轉型 pCP20A 的質體將 kanR (康黴素 Kanamycin, Kan 的抗藥性蛋白的基 因)進行剃除,也就是說只保留 hupA-mturquoise::FRT::yjaH 的序列,最後再 將 pCP20A 剃除,便得到 TCH3 突變株。而此接下來的菌株都是奠基在 TCH3 進行下一步的基因改造。

I. MH2912KTCL (mazE::FRT::kan

R

::FRT::tetOx56::relA,

barA

1882-2757

::FRT::cm

R

::FRT::lacOx90::gudD

449-1341

):

此菌株是以 TCH3 的菌株在 relA 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基 因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列,將原基因中 mazE::relA 的序列置換成 mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA 形成 MH2909KT 突變株。

再以 MH2909KT 作為奠基在 relA 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基 因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列,原基因中 barA1882-2757:: gudD449-134的 序 列 置 換 成 barA1882-2757::FRT::cmR::FRT::lacOx90::gudD449-134 形 成 MH2912KTCL 突變株。

註:只要含有重複操縱基因序列的菌株,我們都沒有進行將抗藥性蛋白基因 剔除的工作,因為在這個操作進行的過程中,容易造成操縱基因序列的 縮短或丟失,使我們的基因位點成像無法有足夠好的對比度。

最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH2912KTCL,就完成我們觀察標定 relA 基 因上下游的菌株。

II. MH3210KTCL (ttdT::FRT::kan

R

::FRT::tetOx56::tsaD,

mug::ileX::FRT::cm

R

::FRT::lacOx90::yqjH):

此菌株是以 TCH3 的菌株在 rpoD 基因的上游植入康黴素的抗藥性蛋白的基 因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列,將原基因中 ttdT::tsaD 的序列置換成 ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD 形成 MH3207KT 突變株。

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再以 MH3207KT 作為奠基在 rpoD 基因的下游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基 因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列,原基因中 mug::yqjH 的序列置換成 mug::ileX::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yqjH 形成 MH3210KTCL 突變株。

最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3210KTCL,就完成我們觀察標定 rpoD 基 因上下游的菌株。

III. MH3424KTCL (yhdZ::FRT::kan

R

::FRT::tetOx56::rrfF::thRV, yrdA::FRT::cm

R

::FRT::lacOx90::yrdB):

此菌株是以 TCH3 的菌株在 rrnD 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基 因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列,將原基因中 yhdZ::rrfF::thRV 的序列換 成 yhdZ::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rrfF::thRV 形成 MH3421KT 突變株。

再以 MH3427KT 作為奠基在 rrnD 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基 因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列,原基因中 yrdA::yrdB 的序列置換成 yrdA::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yrdB 形成 MH3424KTCL 突變株。

最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3424KTCL,就完成我們觀察標定 rrnD 基 因上下游的菌株。

IV. MH3917CLKT (glmU::FRT::cm

R

::FRT::lacOx90::atpC, atpI::FRT::kan

R

::FRT::tetOx56::rsmG):

此菌株是以 TCH3 的菌株在 atp 基因的下游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因 及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列,將原基因中 glmU::atpC 的序列換成 glmU::FRT::cmR::FRT::lacOx90::atpC 形成 MH3913CL 突變株。

再以 MH3913CL 作為奠基在 atp 基因的上游植入康黴素的抗藥性蛋白的基 因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列,原基因中 atpI::rsmG 的序列置換 atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG 形成 MH3917CLKT 突變株。

最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3917CLKT,就完成我們觀察標定 atp 基 因上下游的菌株。

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V. MH3935CTKL (rbsR::FRT::cm

R

::FRT::tetOx56::hrsA,

aspT::trpT::FRT::kan

R

::FRT::lacOx90::hdfR):

此菌株是以 TCH3 的菌株在 rrnC 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基 因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列,將原基因中 rbsR::hrsA 的序列換成 rbsR::FRT::cmR::FRT::tetOx56::hrsA 形成 MH3931CT 突變株。

再以 MH3931CT 作為奠基在 rrnC 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基 因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列,原基因中 aspT::hdfR 的序列置換成 aspT::trpT::FRT::kanR::FRT::lacOx90::hdfR 形成 MH3935CTKL 突變株。

最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3935CTKL,就完成我們觀察標定 rrnC 基 因上下游的菌株。

在文檔中 基因表現對細菌基因位點的動態行為及相鄰核醣核酸聚合酶空間分布的影響 (頁 31-34)