基因表現對細菌基因位點的動態行為及相鄰核醣核酸聚合酶空間分布的影響

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(1)國立臺灣師範大學物理學系碩士論文 Department of Physics National Taiwan Normal University Master’s Thesis. 基因表現對細菌基因位點的動態行為及相鄰核醣核酸聚合酶空間分布的影響 The motions of chromosomal loci and the vicinal distributions of RNA polymerase influenced by gene expression in E.coli. 研究生：鄧安祐指導教授：張宜仁教授. 中華民國一百零九年七月.

(2) 摘要染色體的組織和基因表現之間存在著一定的關聯性，然而，對於原核細胞來說，基因表現具體是如何影響染色體組織，依舊是一個需要進行更多實驗驗證與討論的問題。其中，轉錄作用對染色體的組織更是扮演了一個相當重要的角色。轉錄工廠(transcription factories)便是在探討轉錄作用與染色體組織的課題之一。轉錄工廠的現象是指旺盛的轉錄行為可能會發生在細胞內部幾個離散的區域當中，RNA 聚合酶(RNA polymerase)和其他的轉錄因子(transcription factors)，以及被旺盛表達的基因會一同聚集在「工廠」，藉此達到最高的轉錄效率。然而在原核細胞當中我們無法以現有的螢光顯微術，直接觀察到這麼微小的結構。只能以各種旁敲側擊的實驗來印證轉錄工廠的存在。而從前人的驗證實驗當中，卻也一直都缺乏同時記錄基因與 RNA 聚合酶的位置資訊。為此在本次實驗中，會以 TetR-YFP/tetO 的螢光抑制操作系統標定目標基因，並用單分子定位顯微(single-molecule localization microscopy)觀察由 PAmCherry 標定的 RNA 聚合酶，藉此同時得到基因位點與 RNA 聚合酶在細胞中的位置。之後再進一步分析 RNA 聚合酶的群聚行為，並探討基因表現旺盛與否，基因位點周圍 RNA 聚合酶的群聚現象。也藉由 TetR-YFP/tetO 和 LacI-mScarlet/lacO 標定目標基因的上下游，觀察基因表現對於染色體運動行為產生的影響。而從結果可以看出，RNA 聚合酶的分布，相較於基因表現的旺盛程度，可能更容易受到染色體的結構而影響。從軌跡追蹤實驗中，發現基因的表現的確會對基因位點的運動造成差異，然而這些差異似乎還是主要源自於類核自身的結構，這個結果與前一部分的實驗結果相互印證。而我們從擬合出軌跡互相關函數得到的 DNA 表觀尺寸也可以初步知道，致使基因位點關聯性下降的原因，有可能是因為染色體的聚集，使 DNA 產生糾纏，因此增加了傳遞的困難。關鍵字：轉錄工廠、基因表現、染色體分布、RNA 聚合酶 I.

(3) Abstract There is a certain correlation between the organization of chromosomes and gene expression. However, for prokaryotic cells, how gene expression specifically affects chromosome organization is still a problem that needs more experimental verification and discussion. Transcription plays a important role in the organization of chromosome. “Transcription factories” is one of the topics that discusses transcription and chromosome organization. The phenomenon of transcription factories means that vigorous transcription may occur in several discrete areas inside the cell. RNA polymerase and transcription factors, as well as the genes that need to be expressed vigorously, will gather together in the "factories" to achieve the highest transcription efficiency. However, we cannot directly observe such tiny structures in prokaryotic cells with the existing fluorescence microscopy. In previous verification experiments, there has been a lack of simultaneous recording of gene and RNA polymerase location information. For this reason, in our experiment, the target gene tagged with the fluorescent repressor-operator system of TetR-YFP/tetO, and single-molecule localization microscopy used to observe the RNA polymerase tagged by PAmCherry. Afterwards, we further analyzed the aggregation behavior of RNA polymerase, and the clustering phenomenon of RNA polymerase around the gene locus. The TetR-YFP/tetO and the LacI-mScarlet/lacO pairs had been applied as the loci tags at the upstream and downstream of the target gene. The influence of gene expression on chromosome movement had also been observed. It can be seen from the results that the distribution of RNA polymerase may be more susceptible to the structure of chromosomes than the exuberance of gene expression. In the single molecule trajectory tracking experiment, it is found that the performance of the gene does cause II.

(4) slight differences in the movement of the gene locus. However, these differences seem to be mainly due to the structure of the nucleoid itself, which is mutually corroborated by the experimental results in the previous part. From the “apparent size” of the DNA obtained by fitting the cross-correlation function of the trajectory, we can also initially know, the reason for the decline in the relevance of gene loci may be that the aggregation of chromosomes makes DNA entangled, thus increasing the difficulty of transmission. Keywords: transcription factories, gene expression, chromosome organization, RNA polymerase. III.

(5) 致謝進入實驗室的三年時光一晃而過，從一開始進入一個陌生環境的茫然，轉眼就又要邁向下一個人生階段。在實驗室學習的這段期間，我要特別感謝我的指導教授張宜仁老師，幫助我訂定論文題目並適時地修改研究方向，一直以來的悉心指導、協助，以及不斷鼓勵我完成研究論文。若非如此，我真的很難想像得到我能在碩士兩年期限內，順利地完成學業。也特別感謝周家復老師提供實驗室空間與資源器材，以及共同與邱顯智老師給予建議與指正。感謝胡宗奇學長在實驗樣品菌株製作上的協助，才讓我得以有較為充裕的時間進行樣品觀測和累積數據。感謝宋運欣同學協助我解決實驗和程式上各種大大小小的問題。感謝曾經幫助過我的，實驗室的學長姐、學弟妹和同儕們，謝謝你們的幫忙、鼓勵與陪伴。最後，感謝我的家人，在這段期間不厭其煩地傾聽我的絮叨、容忍我各種奇怪地叨擾，並且給予一切生活和精神上的支持。. 真的謝謝大家！. IV.

(6) 目錄摘要 ...................................................................................................................... I ABSTRACT......................................................................................................... II 致謝 .................................................................................................................... IV 目錄 ..................................................................................................................... V 圖目錄............................................................................................................... VIII 表目錄................................................................................................................. IX 第一章緒論 .....................................................................................................- 1 1.1. 大腸桿菌染色體介紹 .................................................................................... - 2 1.1.1. 類核的形成與分布 .................................................................................- 2 1.1.2. 轉錄作用對染色體組織的重要性 .........................................................- 3 1.2. 原核細胞的轉錄工廠假說 ............................................................................ - 4 1.2.1. 轉錄工廠的機制 .....................................................................................- 5 1.2.2. 轉錄工廠至今的驗證工作 .....................................................................- 5 1.3. 研究目標與策略 ............................................................................................ - 7 第二章實驗設計原理..................................................................................... - 10 2.1. RNA 聚合酶的追蹤與分析 ......................................................................... - 10 2.1.1. 單分子定位顯微術(single-molecule localization microscopy) ........... - 10 2.1.2. 聚類分析演算法—DBSCAN .............................................................. - 11 2.2. 基因位點的追蹤及運動狀態分析 .............................................................. - 12 2.2.1. 螢光抑制操作系統(FROS) ................................................................. - 12 2.2.2. 單分子軌跡的方均位移(MSD) ........................................................... - 13 2.2.3. 軌跡速度的互相關(cross-correlation) ................................................. - 14 V.

(7) 2.2.4. 染色體在細胞裡的運動模型 .............................................................. - 15 2.2.5. 目標基因的選擇 .................................................................................. - 16 2.3. 類核的螢光標記 .......................................................................................... - 17 第三章實驗材料與方法 ................................................................................. - 20 3.1. 樣品製備 ...................................................................................................... - 20 3.1.1. 質體 ...................................................................................................... - 21 3.1.2. 基因位點追蹤的菌株 .......................................................................... - 21 3.1.3. 基因位點定位的菌株 .......................................................................... - 24 3.2. 實驗流程 ...................................................................................................... - 26 3.2.1. 觀測前的樣品準備工作 ...................................................................... - 26 3.2.2. 觀測的條件和步驟 .............................................................................. - 27 3.3. 影像分析 ...................................................................................................... - 28 3.3.1. 單分子定位分析 .................................................................................. - 28 3.3.2. 單分子追蹤分析 .................................................................................. - 28 第四章實驗結果與討論 ................................................................................. - 33 4.1. 基因表現對 RNA 聚合酶分布的影響........................................................ - 33 4.1.1. RNA 聚合酶的群聚現象 ...................................................................... - 33 4.1.2. 基因位點周圍的 RNA 聚合酶 ............................................................ - 35 4.2. 基因表現對染色體運動的影響 .................................................................. - 36 4.2.1. 基因位點上下游的相對距離 .............................................................. - 36 4.2.2. 基因位點上下游的擴散運動 .............................................................. - 36 4.2.3. 基因位點上下游的速度互相關 .......................................................... - 37 第五章結論 ................................................................................................... - 50 參考文獻 ......................................................................................................... - 52 -. VI.

(8) 附錄 ................................................................................................................ - 54 附錄一質體建構引子表 .................................................................................... - 54 -. VII.

(9) 圖目錄圖 1.1 抗生素對類核和 RNA 聚合酶的影響........................................................- 8 圖 1.2 轉錄工廠的機制 ..........................................................................................- 9 -. 圖 2.1 螢光抑制操縱系統的運作機制 ................................................................. - 19 -. 圖 3.1 樣品標記的相對位置 ................................................................................ - 30 -. 圖 4.1 細胞處在不同營養環境底下對類核分布的影響。 ................................ - 39 圖 4.2 細胞處於不同環境中 RNA 聚合酶分別與類核和隨機模型的相關性 .. - 40 圖 4.3. RNA 聚合酶在細胞中的聚集行為 ......................................................... - 41 -. 圖 4.4 RNA 聚合酶相對於細胞骨架所在位置的分布情形 ............................. - 43 圖 4.5 基因位點相對於細胞骨架所在位置的分布情形 .................................... - 44 圖 4.6 基因位點的表達與基因周圍 RNA 聚合酶的關係 .................................. - 45 圖 4.7 基因上下游位點的距離 ............................................................................ - 46 圖 4.8 基因位點的方均位移與延遲時間關係圖 ................................................ - 47 圖 4.9 基因位點的運動範圍 ................................................................................ - 48 圖 4.10 基因位點的軌跡速度互相關函數與表觀尺寸的比值 .......................... - 49 -. VIII.

(10) 表目錄表 3.1 質體表 ........................................................................................................ - 31 表 3.2 菌株表 ........................................................................................................ - 31 -. IX.

(11) 第一章緒論不同於真核細胞，原核細胞內並沒有細胞核模，能將遺傳物質與細胞內其他的分子物質在空間上區隔開來。因此染色體會位在原核細胞中間，一個沒有固定大小與形狀的區域，也就是細胞的類核。當細胞處於快速分裂的狀態時，真核細胞與原核細胞必須適當的壓縮並組織染色體，藉以維持細胞內高效率的系統運作及反應[1]。然而，原核細胞也缺乏能與 DNA 纏繞成核小體的組織蛋白(histone)，因此未被纏繞的 DNA 線段會非常的長。這也就意味著，對於原核細胞的基因組，是如何有效地進行空間上的組織、調動與分配，將是一個未知的重要課題。而在許多可能影響染色體構型的因素中，細胞的轉錄作用則扮演了一個不可或缺的角色。轉錄是細胞中最重要的工程之一，與細胞中其他的生理作用都息息相關，作為 RNA 轉錄的模板，細胞的 DNA 更是直接參與轉錄作用的整個過程。這使得無論是針對染色體的巨觀分布或者是內部區域性結構，轉錄作用都可能會為染色體的組織帶來不同尺度的影響[2]。其中，轉錄工廠(transcription factories)便是轉錄作用可能會帶來的現象，此一說法最早是在 1996 年由 Iborra 等人提出，指的是旺盛的轉錄行為可能會發生在細胞內部幾個離散的區域當中，RNA 聚合酶(RNA polymerase)和其他的轉錄因子(transcription factors)，以及被旺盛表達的基因會一同聚集在「工廠」，藉此達到最高的轉錄效率[3]。此一現象在真核細胞中已經被發現並且確認[4]，然而對於原核細胞來說仍然是一個比較新的概念，需要更多的實驗進行推敲和驗證。於本論文中，我們紀錄大腸桿菌 RNA 聚合酶的分布情形，並同時加入基因位點的位置訊息，藉此得知基因周圍的 RNA 聚合酶群聚行為，和基因表現與否之間的關聯性。並且藉由不同營養條件的環境底下得到基因位點的運動行為，說明基因表達會對基因位點的運動造成什麼程度的影響。本章第一節，會介紹大腸 -1-.

(12) 桿菌染色體及探討可能影響其在空間上構型和分布的因素；第二節，會回顧前人對轉錄工廠存在於原核細胞一說的驗證成果；第三節，會針對此次的研究目標及策略方向進行說明。. 1.1. 大腸桿菌染色體介紹大腸桿菌染色體的分布及結構和基因表現可能有著密不可分的關聯性，兩者可能會彼此互相影響。於 1.1.1 節中，會介紹並討論染色體所處在的類核會受到那些原因而影響分布；1.1.2 節中，討論染色體的結構以及與轉錄作用的關聯性。 1.1.1. 類核的形成與分布與我們所一般所認知到真核細胞的線形染色體不同，典型的一個大腸桿菌細胞具有一條環形的染色體。大腸桿菌的染色體攜帶著完整的遺傳訊息，大約含有 460 萬個鹼基對[5]。然而從熱力學的角度出發，染色體因為受限於庫恩長度(Kuhn length, 對於典型的染色體約等於 50nm)的作用，應該會折疊成一個比自身細胞空間還要大上許多的分子。因此，染色體處在這麼侷限的空間中，就勢必需要額外的力量來維持其在細胞內的構型。由於大腸桿菌缺乏細胞核模，染色體會直接散佈在細胞質當中。而除了染色體之外，大腸桿菌的細胞內還存在著許多其他的小分子，因此染色體在受到熵力 (entropic force) 的作用下，會與一些親和力較高的類核黏附蛋白 (nucleoidassociated proteins)集中在細胞的中間形成桿狀的類核，並且讓其他小分子在細胞的邊緣遊走。類核在細胞空間中的大小並不固定，會因為細胞所處在的環境改變而受到調節，當細胞處於營養度較高的培養液時，細胞的類核可能會有很多小節，而類核聚集的程度，也會比處在不營養環境底下時來的更加明顯與緊實。我們知道當細胞處於高營養環境底下會容易進入快速分裂期，而為了因應快速分裂，細胞就需要更快速的完成染色體複製與合成重要蛋白以維持基本的生理機制和功. -2-.

(13) 能。適當的壓縮組織染色體，就可能會提高細胞的複製及基因表現等生理作用的效率。細胞在添加不同抗生素的環境下，類核的分布情形也會給予不同的響應[6]。如圖 1.1，當添加干擾新生肽鏈合成的氯黴素(Chloramphenicol)阻斷細胞的轉譯作用時，類核會變得非常收縮集聚；相反的，當添加阻止 RNA 聚合酶附著在 DNA 上的利福平(Rifampicin)，細胞的轉錄與轉譯都停擺時，類核則會呈現舒張擴散開來的狀態。因此可以推測，基因的表現可能會是影響染色體組織的力量之一。此一現象也有轉嵌(transertion)模型來進行詮釋，轉嵌現象指的是原核細胞在表達膜蛋白基因時，尚未完全完成基因轉錄的 RNA 序列，會在 RNA 持續轉錄的過程中就進行肽鏈的轉譯，同時，剛轉譯出的部份肽鏈則會在轉譯持續進行的過程中，就嵌入細胞膜並開始折疊成膜蛋白。換言之，膜蛋白基因正在表達時，這一連串同時發生的作用會使得膜蛋白基因受牽動而靠近細胞膜，也為類核提供了向外舒張的力量[7]。因此，當細胞的轉譯作用受阻時，舒張類核的力量也會跟著減少，類核也會表現得更加聚集。然而當我們阻斷細胞的轉錄作用時，也代表後續的轉譯與其他重要的生理機制將跟著停擺，因此對於轉錄作用具體會為染色體的組織提供什麼樣的力量，就需要更多的實驗來進行探討與驗證。 1.1.2. 轉錄作用對染色體組織的重要性染色體在類核中並不是均勻分布，目前大腸桿菌的染色體模型中提到類核主要分成了 Ori, Ter, Left, Right 四大片段，其中 Ori 包含著大腸桿菌 DNA 的複製起點序列 oriC，而 Ter 則包含的是 DNA 的複製終端，在大腸桿菌細胞空間中這兩個片段趨向分布在彼此的對面[8, 9]。四大片段的成因目前還無法論定，但可能與細胞的複製作用和轉錄作用的機制相關。除了四大片段之外，染色體在更小的尺度上依然有著特殊結構，染色體互動區域(chromosomal interaction domains)便是其一，每個區域內部都有著較為相似的環境與性質[10]。DNA 的超螺旋結構(supercoiling)則可能會存在於不同的染色 -3-.

(14) 體互動區域當中，超螺旋結構的生成主要是因為 DNA 自身具有旋性，並且當轉錄作用發生時，DNA 雙股在進行拆開旋入 RNA 聚合酶的過程中，會導致 RNA 聚合酶前後兩端的 DNA 出現旋轉的更緊或更鬆的情況，因而產生局部的超螺旋結構[11]。儘管原核細胞中缺乏組織蛋白能幫助 DNA 組織成核小體，但原核細胞中的類核黏附蛋白還是會對染色體構型造成一定的影響。其中就有類組織蛋白 (histone-like proteins)能幫忙 DNA 穩固結構[12]，例如：調節基因表現的 H-NS，可能會使得 DNA 的啟動子(promter)序列產生彎曲；協調基因轉錄的 Hu 或 Fis，會穩固超螺旋的結構；IHF 則可能在 DNA 上創造更多的扭結[13]。然而，同樣也作為類核黏附蛋白的一種，RNA 聚合酶對 DNA 的結合強度卻大於類組織蛋白與 DNA 之間的結合強度，而 RNA 聚合酶附著在 DNA 非特定序列的比例也相對於類組織蛋白來的更多，因此 RNA 聚合酶對於染色體的組織或許會扮演著更重要的角色。在轉錄作用的進行下，RNA 聚合酶與 DNA 位點之間的互動，可能也就存在著「轉錄工廠」一說。然而轉錄行為貢獻給組織染色體的力量，則需要更進一步的探討與驗證。. 1.2. 原核細胞的轉錄工廠假說轉錄工廠的存在相當於為細胞提供一個高效率的轉錄場所，然而在原核細胞當中這樣的結構，因為受限於光繞射極限，所以並沒辦法透過傳統螢光顯微術直接在活體細胞中證實工廠的存在。而即便轉錄工廠真的存在，轉錄工廠的行為又會為染色體的結構造成什麼尺度的影響，就成為了科學家們至今仍致力研究的謎題。於 1.2.1 節中，會介紹轉錄工廠的形成以及基本機制；1.2.2 節中，回顧至今原核細胞中轉錄工廠假說的驗證工作。. -4-.

(15) 1.2.1. 轉錄工廠的機制轉錄工廠是一個已經在真核細胞當中被發現且被證實的特殊機制，目的是為了提高轉錄作用的效率以因應細胞的快速分裂，使細胞能維持住基礎的生理功能。如圖 1.2 所示，一定數量的 RNA 聚合酶和其他的轉錄因子以及協調轉錄作用進行的分子，會聚集在細胞特定的區域當中，當需要被旺盛表達的基因一旦進入這些區域，RNA 聚合酶就會快速的結合在基因的啟動子序列並啟動 RNA 的轉錄。而當 RNA 轉錄作用還在進行延長階段時，又會有新的 RNA 聚合酶立即附著上基因的啟動子並開始進行下一輪的 RNA 轉錄[3]。這樣的現象又會使得某些在區域周圍附近晃動，並且也具有相同轉錄因子需要被旺盛表達的基因，或者是更多的轉錄因子，因為感受到較高的親和力而晃進此區域當中。當數個被旺盛表達的基因進入此區域，轉錄工廠便就此成形，工廠內部會不斷地有許多轉錄行為同時進行著。RNA 聚合酶一旦完成轉錄脫離 DNA，又會立即找到新的啟動子序列進行結合，此舉大幅降低了 RNA 聚合酶需要搜尋轉錄起始點的時間。而這些基因進入工廠之後，會因為不斷的有 RNA 聚合酶附著上來進行轉錄，使得基因就被拉在工廠中不容易脫離。這也說明轉錄行為對 DNA 的影響可能不是僅僅侷限於單一旺盛表達的基因，轉錄工廠的力量或許使得數個原本在序列上相距較遠的基因，在細胞空間上卻容易彼此互相靠近。 1.2.2. 轉錄工廠至今的驗證工作藉由螢光標定大腸桿菌的 RNA 聚合酶，可以看到 RNA 聚合酶的分布範圍總是跟類核分布範圍相似，且當細胞處於營養環境當中，RNA 聚合酶的確會有聚集在某些離散位點的現象[14]。但因為受限於光繞射極限，沒有辦法得到這些聚集團內部更詳細的資訊。2013 年，Ulrike Endesfelder 等人就利用了單分子定位顯微術(single-molecule localization microscopy)來觀察 RNA 聚合酶的分布，發現 RNA 聚合酶的聚集團多數是由 70 個左右的分子，做為一個最小聚集團的單位。 -5-.

(16) 而處在高營養環境中的細胞會有機率出現更大的聚集團，很可能就是來自於數個這些小單位聚集團彼此靠近而形成的[15]，這也相對了印證轉錄工廠中 RNA 聚合酶會傾向靠近彼此的說法。當細胞處於高營養環境時，需要製造大量的核醣體來進行蛋白質的轉譯，所以核醣體 RNA(ribosomal RNA)就必須要大量的被轉錄出來，細胞中超過 80%被合成的 RNA 都會是核醣體 RNA。然而當細胞處於營養缺乏的環境時，細胞僅會合成維持生命條件的必需蛋白，核醣體 RNA 的生成就會被嚴格的限縮[1]。而當加入絲氨酸羥基醯胺(serine hydroxamate，SHX)，則會為細胞創造一個缺乏必需胺基酸的飢餓環境[16]，核醣體 RNA 的生成也會受到限制。在細胞停擺了很大一部份的轉錄作用下，也可以觀察到 RNA 聚合酶以及類核的分布範圍會明顯擴張許多，但 RNA 聚合酶的聚集團數量雖然會有部分減少，卻依然保有明顯的群聚現象存在[17]。然而 RNA 聚合酶的群聚現象，或許會跟自身與核醣體基因系列的高親和性有關，換言之，即便轉錄作用沒有在進行，也可能會看到 RNA 聚合酶的群聚現象。為此，Julio E. Cabrera 等人將核醣體基因系列中六個基因刪除，只保留了一個核醣體基因[6]，然而結果並沒有和添加絲氨酸羥基醯胺有太大的差異，RNA 聚合酶依舊會有群聚現象的產生。 Cedric Cagliero 等人，也嘗試使用了染色體結構捕捉 (Chromosome conformation capture)的相關技術來還原大腸桿菌染色體的結構，此技術的主要精神在於利用特定的限制酶，將已經固定住的染色體切碎再重新連接。因為限制酶造成的切口會是一樣的，因此在空間中相近的基因就會有較高的機率連接在一起。從他們的實驗結果也證實了大腸桿菌的染色體有四大片段，亦存在著扭結螺旋的結構。也證實了當加入絲氨酸羥基醯胺，染色體的局部結構都會變得更加鬆散 [18]。. -6-.

(17) 這些實驗結果似乎都與轉錄工廠的存在有一定的關聯，但卻也都無法直接證實此一現象的存在。以 RNA 聚合酶的角度做為出發點的實驗，多數都只與類核的分布情形直接進行比較，而缺乏了真正會參與在轉錄工廠中，被旺盛表達基因的訊息。這導致我們無法了解到，RNA 聚合酶所聚集的原因，是不是真的與被旺盛表達的基因有關。而添加藥劑以及刪除基因序列，都有可能會對細胞的生理環境受到劇烈的影響，使得最後產生的實驗結果變因太多，無法確定就是轉錄行為的缺乏而直接導致的現象。而染色體結構捕捉技術雖然證實了染色體會有特殊的結構，但因為受限於此方法的解析度，對轉錄工廠來說仍舊不足，實際上轉錄的行為是怎麼影響染色體的結構，依然是一個未知的答案。. 1.3. 研究目標與策略建立在 1.2.2 節的實驗結果以及探討上，基於過去觀察 RNA 聚合酶的實驗中都缺乏 DNA 位點的資訊。因此我們會選定幾個目標基因位點，在觀察 RNA 聚合酶的分布情形時，同時記錄這些基因位點的位置。雖然我們仍然無法直接觀察到轉錄工廠內部的基因構造，但如果原核細胞的轉錄工廠假說為真，那麼正在被旺盛表達的基因附近，應該也會有著較高的機率存在 RNA 聚合酶的聚集團。而從過去的實驗中也較缺乏討論轉錄行為，具體會帶給 DNA 什麼尺度的力量。因此我們透過螢光標定目標基因位點的上下游，來觀察當基因旺盛表達或較不表達的情形下，基因上下游位點的運動情形以及關聯性會不會受到什麼樣尺度的影響。想像如果基因正在被旺盛轉錄時，RNA 聚合酶及轉錄因子真的會牽動著基因位點，或者是導致 DNA 的空間結構產生變化，那麼從基因位點的運動行為上，就可能會受到影響產生改變。而我們也希望能夠透過運動狀態的改變，從而推導出轉錄行為可能會牽引 DNA 的力量大小。. -7-.

(18) 圖 1.1 抗生素對類核和 RNA 聚合酶的影響從圖中我們可以看到，在營養的 LB 培養液中，RNA 聚合酶與類核分布區域大致相同，但 RNA 聚合酶則會出現數個聚集團在類核的邊緣（如白色箭頭所指）。當加了氯黴素阻斷細胞的轉譯作用時，類核會變得非常收縮集聚，而當繼續添加阻止轉錄作用（轉譯也不會進行）的利福平，類核則會呈現舒張擴散開來的狀態。且當類核出現這樣的行為時，RNA 聚合酶也會跟著出現一樣的響應。因此可以猜想基因表現或許對類核的組織以及 RNA 聚合酶的分布都會產生影響，只是這具體的影響機制是什麼，就必須要有更多的證據進行驗證。. -8-.

(19) 圖 1.2 轉錄工廠的機制「工廠」裡頭會存在著數個被旺盛表達的基因、許多的 RNA 聚合酶分子和轉錄因子，而基因就會被拉動在此區域中，不停進行著高效率的轉錄作用。這樣的結構在細胞中可能會有好幾個，因此如果這個效應真的存在，並且真的足以牽動更多周圍的基因或 RNA 聚合酶加入到轉錄工廠內，那就可能會對染色體的組織提供一個很顯著的聚集效應。i. A 基因被旺盛表達，基因周圍存在 RNA 聚合酶等轉錄因子。ii.和 iii. 在 A 附近晃動，需要被旺盛表達且與 A 具有相同轉錄因子的 B 基因，以及更多的轉錄因子，會開始感受到 A 基因的轉錄場域，逐漸晃到 A 基因周圍一同進行轉錄。iv. 受到 B 基因的拉動，具有相同轉錄因子的 C 基因也進入轉錄場域，最後也晃到 A 和 B 基因周圍進行轉錄，形成「工廠」。 -9-.

(20) 第二章實驗設計原理本文中的實驗主要可以分為兩大部分，在第一部分的實驗中，我們選用紅色的光激活螢光蛋白(photoactivatable fluorescent proteins) -- PAmCherry，來標定 RNA 聚合酶中的 β′ 次單元[14, 15]，運用單分子定位顯微術來記錄 RNA 聚合酶在細胞空間中的位置。此部分的目標基因位點則是選用螢光抑制操作系統 (fluorescent repressor-operator system, FROS)[19] -- TetR/tetO 進行標記，藉此可以同時得到 RNA 聚合酶以及基因位點的空間資訊進行分析。第二部分的實驗，我們會在目標基因的上下游分別以 TetR/tetO 及 LacI/lacO 且不同顏色的螢光標定系統來標記，藉此得到基因位點上下游的軌跡資訊。另外，在兩部分的實驗中也都有使用螢光標記類核黏附蛋白 HU 的次單元蛋白 HupA (Hu-α)，使得我們也可以有類核的整體分布進行對照[20]。本章會介紹實驗方法與分析的原理，2.1 節針對 RNA 聚合酶的觀察以及分析方式做說明；2.2 節說明基因位點的追蹤與討論其運動的模型；2.3 節介紹類核的標定方法。. 2.1. RNA 聚合酶的追蹤與分析為了能更仔細的辨別 RNA 聚合酶聚集團的參與分子數比例，以及能夠更精準地得到與基因位點在空間位置上的關聯，本次實驗會使用單分子定位顯微術進行觀測 RNA 聚合酶。2.1.1 節介紹單分子定位顯微術的原理及方法；2.1.2 節介紹聚集團的分析演算原理。 2.1.1. 單分子定位顯微術(single-molecule localization microscopy) 傳統光學顯微術因為受限於光繞射極限(diffraction limit，約等於發射光的半波長)，最後的成像會是由許多的光暈疊合而成，因而無法得知在一群發亮的影像之下，每個螢光分子所在的具體位置，因此在應用層面上，也使得我們無法得 - 10 -.

(21) 到許多比繞射極限更細微的結構資訊。而超解析螢光顯微術的發明[19, 21]，如今已經逐漸克服了這個難題。單分子定位顯微術是屬於隨機座標(coordinate-stochastic)類型的超解析螢光顯微術(superresolution fluorescence microscopy)[22]。這個方法主要是利用具有光激活(photoactivatable)、光可逆(photoswitchable)以及光轉換(photoconvertable)等特殊性質的螢光蛋白，同時照射低劑量的短波光與高劑量的激發光，促使它們少部分的被活化或轉換後，開始進行單獨、隨機的發亮，並且很快地就會被關閉 (switch off)或漂白(photobleaching)。因此每一個時刻所偵測到的信號，就會是數個獨立均勻的點擴散函數(point spread function)，而不是一群發亮無法各自辨別的光暈。此時我們便可以藉由點擴散函數的峰值，定位出發射光的中心位置，定位的精確度 σ 就會有如式(2-1)所表示： 𝑠2. 𝑎2. 𝑁. 12𝑁. σ= √𝑖 +. +. 8𝜋𝑠𝑖4 𝑏2 𝑎2 𝑁2. (2-1). 其中，𝑎 是像素大小，𝑏 2 是平均背景值，𝑠𝑖 與 N 則分別是點擴散函數的特徵寬度以及接收到的光子數。換言之，定位的精準度就大約會等於點擴散函數的特徵寬度除以光子數的二分之一次方。（舉例來說，若點擴散函數的特徵寬度為 100 nm，而光子數為 400，那麼定位的精確度就會約等於5 nm。）藉此，我們就可以得到每一偵照片中每個分子的位置資訊，進而疊合成一張超解析的螢光位點分布影像。 2.1.2. 聚類分析演算法—DBSCAN 為了能夠定量聚集團的總數以及參與聚集團的分子數，我們引入 DBSCAN (density-based spatial clustering of applications with noise)來進行聚集團的演算[23]。此種演算法是基於密度的概念去定義一個分子是否參與聚集團，並對空間中所有的分子都進行聚集團的分組。也就是說當以某一個分子為圓心，在某個半徑範圍內存在一定數量的其他分子時，那麼這些範圍內所有的分子，就會被歸類為 - 11 -.

(22) 同一個聚集團，以此再繼續進行尋找同一聚集團內的分子；反之，若此分子周圍在訂定範圍內的分子數量並沒有超過最小分子數，則該分子就被認為不參與聚集團。通常我們會先定義最小分子數(MinPts)為 4[15]，接著設定範圍半徑的閾值 𝜀 ， 𝜀 的訂定與分子在細胞的平均濃度 𝜇 有關，會有如下的關係式：. 𝜀2 =. MinPts π ∙ n𝜇. (式 2.2). 其中，n 表示聚集團的濃度必須至少等於平均濃度的倍數，本實驗的 n 值都定義為 3。 DBSCAN 的演算法可以適用於不同尺度的分子聚集團分析，然而閾值的設定就會是一個很重要的變因，需要多試幾次條件才能找出比較合適的數值。. 2.2. 基因位點的追蹤及運動狀態分析在基因位點的標記上，我們使用的都是螢光抑制操作系統，此系統的方便之處在於系統會自行調節螢光蛋白的合成，並且讓基因位點又會標記上足夠的亮度以便進行追蹤。統計出的基因軌跡會建立在染色體的運動模型下，進行運動行為分析與討論。2.2.1 節中，會介紹螢光抑制操作系統的機制；2.2.2 節，說明方均位移的計算與物理意義；2.2.3 節，說明互相關函數的特徵；2.2.4 節，闡述染色體在細胞黏彈環境中的運動模型；2.2.5 節，討論目標基因的選擇。 2.2.1. 螢光抑制操作系統(FROS) 為了能觀察到染色體在細胞空間中的位置與結構，目前已經有許多種方式能夠對 DNA 進行標定，螢光抑制操作系統便是比較常見的一種標定基因的方式[19]。其精神主要是利用細胞的負向操縱組 (operon) 系統中，生成的抑制蛋白質 (repressor)會與操縱基因(operator)序列結合的特性，來達成對目標序列的標定。. - 12 -.

(23) 本實驗中選用的乳糖操縱組的乳糖抑制蛋白 LacI 與其操縱基因 lacO，以及四環黴素抗藥抑制蛋白與操縱基因 TetR/tetO 就是常被使用的配對之一，而對應的螢光蛋白標記則分別是紅色螢光蛋白 mScarlet 及青綠色螢光蛋白 YFP。此系統的設計如下：首先會在選定的目標基因序列旁邊加入數十個重複的操縱基因，接著在細胞內添加會生成抑制子螢光融合蛋白系統，此融合蛋白就會與偵測到的操縱基因序列結合，直到將我們加入的操縱基因序列都填滿為止，此時我們就能以足夠強的螢光訊號觀察到目標基因在細胞空間中的位置(圖 2.1.)。我們在本實驗中是將生成融合蛋白的系統置入在細菌的質體上，並且在融合蛋白基因序列的啟動子端，添加一個操縱基因，以達到基因調控的功能。也就是說當細胞中的操縱基因序列幾乎都被填滿時，細胞就會停止對融合蛋白基因的轉錄，因而不會有太多未被結合的融合蛋白分布在細胞質內，影響我們對基因位點偵測以及造成細胞多餘的負擔。 2.2.2. 單分子軌跡的方均位移(MSD) 分子的擴散方式會依據液體與空間環境的影響，而主要分為正常擴散 (normal diffusion)以及異質性的次擴散(subdiffusion)、超擴散(superdiffusion)三種模式。為了從已經取得的基因位點軌跡中，得到分子的擴散模式和擴散係數等資訊，我們選用了常見的擴散運動分析法--方均位移(mean squared displacement)。方均位移的意義是指，觀察分子在不同延遲時間(time delay, 𝜏 )尺度之下，平均能夠向外擴散多大的距離。兩者的關係依據時間隨機擴散模型可以式(2.3)呈現： MSD(𝜏) = 2𝑑𝐷𝜏 𝛽. (式 2.3). 其中， 𝑑 指的是分子運動的空間維度，D 為分子的擴散係數(diffusion coefficient)，𝛽則是異常擴散指數(anomalous diffusion exponent)，也是作為判定分子是以何種方式進行擴散的指標。當𝛽 = 1時，方均位移與延遲時間呈現線性關係，這也說明分子正在進行簡單的布朗運動，屬於正常擴散行為；而當𝛽 < 1， - 13 -.

(24) 則說明分子的運動可能因為受到某種侷限的力量，使得擴散的行為隨著時間尺度增加，會遠小於正常擴散所能擴散的距離，此即為次擴散模式；反之當𝛽 > 1，表示該分子進行擴散時，可能還受到某種額外的牽引或推擠的力量，使得當時間尺度增加時，該分子的平均擴散距離會比正常擴散來的大。本次實驗中，我們將會先統計出基因位點軌跡的方均位移對延遲時間關係後，再以式(2.3)擬合出方均位移對延遲時間的函數。另外，我們也統計了基因在每個時刻下的位置與平均位置的位移，藉此來描述該位點的平均運動空間範圍。我們想像如果基因被表現時，基因附近真的會因此聚集許多 RNA 聚合酶與轉錄因子，甚至轉錄的力量可能會對 DNA 的局部結構造成影響，那麼這些環境的變動，應該就足以讓基因軌跡的方均位移產生差別。 2.2.3. 軌跡速度的互相關(cross-correlation) 我們可以想像染色體其實是由許多的 DNA 片段串接而成，因此除了基因位點各自的運動行為之外，基因上下游兩個位點的晃動，應該也會透過 DNA 片段的傳遞而對彼此的運動行為產生影響。同樣，如果當基因被表現時，基因附近的環境組成與 DNA 結構會產生變化，那麼兩位點之間運動行為互相響應的程度應該也會有所改變。於是我們便可以藉由分析基因上下游兩個位點的運動互相關性，得到基因表現可能會影響染色體運動的物理定量表徵。在這裡我們會計算基因上下游兩個位點軌跡速度的互相關(cross-correlation)： (𝛿) 𝐶𝑉𝑉 (𝜏). ⃑⃑⃑𝑢 其中，𝑉. (𝛿). ⃑⃑⃑⃑𝑑 和𝑉. (𝛿). =. ⃑⃑⃑⃑𝑢 ⟨𝑉. (𝛿). ⃑⃑⃑⃑𝑢 ⟨𝑉. ⃑⃑⃑⃑⃑𝑑 (𝑡+𝜏)∙𝑉. (𝛿). ⃑⃑⃑⃑⃑𝑑 (𝑡)∙𝑉. (𝛿). (𝛿). (𝑡)⟩. (𝑡)⟩. (式 2.4). 分別是基因上游和下游位點的速度，而速度的計算方式則. 是以 𝛿 作為時間間隔對軌跡位置 𝑋 取平均速度，即為： ⃑. ⃑. ⃑ (𝛿) (𝑡) = 𝑋(𝑡+𝛿)−𝑋(𝑡) 𝑉 𝛿. - 14 -. (式 2.5).

(25) 而計算出來的互相關關係圖，會於 2.2.4 節中進行與理論模型的擬合，並闡述其相關量值的物理意義。 2.2.4. 染色體在細胞裡的運動模型為了能夠量化基因位點互相擾動的程度，我們引進 Rouse 模型來描述染色體在細胞中的運動狀態。此模型被發現可以用來模擬聚合物在受限空間環境中的運動行為。理想的 Rouse 模型指的是，想像一個聚合物是由許多單體小球，以庫恩長度為間距進行排列，並互相用彈簧串接而成，此時單體小球所受到的力量分別來自於熱擾動產生的隨機布朗力，以及單體小球間的彈性力。但我們應該考慮實際上染色體處在的環境是一個擁擠稠密具有黏彈性的環境，因此應該引進環境的阻力記憶項的概念，來修正 Rouse 模型。意即當物體處在一個黏彈性的系統中，物體此刻的運動狀態，會受到上一刻的運動狀態所回饋的阻力影響[7, 24]。因此，根據修正後的 Rouse 模型，聚合物中的一小段單體，在弛豫時間 (relaxation time)內的方均位移可以近似成： MSD(𝜏) ~ 𝑏(𝑘𝐵 𝑇/𝜉 )1/2 𝜏 𝛽. (式 2.6). 其中，𝑏 是庫恩長度，𝑘𝐵 𝑇是熱擾動能量，𝜉 為聚合物中一小段單體的阻力係數。結合式(2.3)，我們也可以得到表觀擴散係數(apparent diffusion coefficient) 𝐷𝑎𝑝𝑝 ∝ 𝑏(𝑘𝐵 𝑇/𝜉 )1/2 的關係。而在修正後的 Rouse 模型下，兩個單體的速度互相關則可以表示成，無因次的延遲時間 𝜏̃ 、回彈係數 𝛼、無因次的 Rouse 弛豫時間 𝜏̃∆n ，三個變數的函數。其中， 𝜏̃ 會是延遲時間 𝜏 與平均速度間隔時間 𝛿 的比值；𝛼 的量值則會等同於自由粒子在相同環境下的異常擴散指數，約會等於聚合物單體的異常擴散指數 2 倍，意即 𝛽 = 𝛼/2；𝜏̃ ∆n 則等於 𝜏∆𝑛 /δ，𝜏∆𝑛 是 Rouse 弛豫時間，即是描述基因位點間透過 DNA 傳導擾動的特徵時間，會有以下關係式：. - 15 -.

(26) 𝛼 𝑡∆𝑛 =. (∆𝑛 𝑏)2 𝜉 𝑘𝐵 𝑇. ∝. (∆𝑛 𝑏2 )2 (𝑢). (𝑑). 𝐷𝑎𝑝𝑝 𝐷𝑎𝑝𝑝. (式 2.7). 其中，∆𝑛 是兩位點之間等效的單體數量，而(∆𝑛 𝑏 2 )就可以描述兩基因位點間，藉由位點互相擾動的程度，所得到的 DNA 片段的表觀物理尺寸。也就是說當兩基因位點所處的環境越不容易進行擴散運動，或者是兩基因位點間的 DNA 片段所受的干擾或阻礙越多，那麼所測量到兩位點間 DNA 的表觀尺寸應該就會越大。 2.2.5. 目標基因的選擇本實驗中是以改變細胞所在的環境營養度，藉此達成調節細胞基因表現的旺盛程度。而我們此次一共選擇了五個目標基因進行觀察，依照基因上下游的順序分別為 relA、rpoD、rrnD、atp 以及 rrnC。首先是 relA 基因，當大腸桿菌細胞處在缺乏必需胺基酸的飢餓環境中，RelA 蛋白會促使細胞嚴格限縮基因表現等生理機制。然而，無論細胞處於營養密度高或是低的環境下，RelA 蛋白都只有少量被轉譯出來，平均每個細胞在營養的 EZ 培養液中與在較不營養的 MOPS 培養液中，所生產出的 RelA 蛋白數量為 356 與 213 個 (比值僅約為 1.7)。也就是說無論在營養環境與否，relA 的基因表現穩定不旺盛，因此我們將其作為此次實驗的對照組。接著是 rrnD 基因，是核醣體 RNA 基因系列之一。依據前文所述，核醣體 RNA 的轉錄作用會因為細胞處在不營養的環境而被嚴格限縮。意即環境的營養程度與否，會對於 rrnD 的基因表現程度造成劇烈影響。因此我們猜想，rrnD 基因或許會是一個好的指標來描述基因表現所帶給染色體的影響。第三是 rrnC 基因，同樣是核醣體 RNA 基因系列之一。但與 rrnD 不同的是， rrnC 在細胞空間中所處在的位置，與其他 6 個核醣體 RNA 基因系列的位置較不相近。因此我們想知道即便同為被旺盛表達，且基因性質相似的基因，會不會因為所處在的環境不太一樣，而產生不同的響應行為。 - 16 -.

(27) 再來是 rpoD 基因，作為參與最多基因轉錄過程的 σ 因子，RpoD 蛋白(σ70 ) 會率先辨認 DNA 上的啟動子序列，並加強 RNA 聚合酶核心蛋白與 DNA 的結合，協助轉錄作用的進行。平均每個細胞在營養的 EZ 培養液中與在較不營養的 MOPS 培養液中，所生產出的 RpoD 蛋白數量比值約為 5.1 (11809/2284)。為了確認基因表現所產生的結果，會不會是核醣體 RNA 基因系列才會產生的響應，因此，我們挑選雖然不是核醣體 RNA 基因系列，但同樣也是在營養環境底下更會被旺盛表達的基因。最後是 atp 基因，atp 基因其實是包含 atpI::atpB::atpE::atpF::atpH::atpA:: atpG:: atpD::atpC 的系列基因，之後本文中都統稱為 atp 基因。atp 基因會轉譯出 ATP 合酶，進行利用 ADP + Pi 轉化 ATP 的反應，平均每個細胞在營養的 EZ 培養液中所生產出的 ATP 合酶，都會是在較不營養的 MOPS 培養液中的二到三倍之多。同樣的，我們又多挑一組來自其他系列，也會被旺盛表達的基因來進行對照。我們想像中，如果轉錄作用對於染色體及 RNA 聚合酶的構型有著顯著的貢獻的話，那麼後四者的實驗結果應要與第一個很不一樣，甚至後四者的響應可能會趨近一致。. 2.3. 類核的螢光標記於 2.2.1 節介紹的螢光抑制操作系統，雖然能夠標定基因使我們能夠得到染色體位點的資訊，但最多也只能同時提供我們 2 至 3 個基因位點的訊息。而我們若希望能夠同時確認基因表現對染色體整體分布的影響，就需要能標記整體類核的方法。其中被廣泛使用的方法之一，就是使用 DAPI 對類核進行染色。 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)是一種可以與非特定序列 DNA 結合的藍色螢光染劑，它可以穿透完整的細胞膜並與雙股 DNA 進行結合，因此可以使我們看到染色體整體的分布型態。但 DAPI 在活體細胞的使用有較嚴格的濃度限 - 17 -.

(28) 制，也可能會對大腸桿菌細胞的生理狀態產生未知的影響，因此 DAPI 更常被應用在標本細胞的類核標記上[20]。另一個常被使用的標定方法，是以螢光蛋白標定類核黏附蛋白。藉著類核黏附蛋白數量眾多且會與 DNA 廣泛結合的特性，我們便可以觀察類核在細胞空間中的分布情形。依據前文所提到的，Hu 蛋白便是一個會黏附在 DNA 上，具有協調基因轉錄作用並穩固超螺旋結構的類組織蛋白。因此，在本實驗中我們會以青藍色的螢光蛋白 mTurquoise，對 Hu 的次單元蛋白 HupA 進行標記。. - 18 -.

(29) 圖 2.1 螢光抑制操縱系統的運作機制抑制子會主動辨認並與操縱基因結合，我們利用此特性設計出抑制子螢光融合蛋白，融合蛋白就會有較高的機率，在系統被抑制之前先附著在事先於目標基因一側添加的數十個重複操縱基因，藉此我們就可以得到基因位點的訊息。. - 19 -.

(30) 第三章實驗材料與方法如前文所提及，本次實驗主要會分為兩大部分： ֍ 第一部分，在不同環境營養條件下，同時觀察目標基因位點以及 RNA 聚合酶的空間分布情形。此部分所使用的菌株會同時含有類核、RNA 聚合酶、目標基因鄰近啟動子一側的標記，以及帶有抑制子螢光融合蛋白系統的質體。 ֎. 第二部分，在不同環境營養條件下，同時記錄目標基因位點上下游的運動軌跡。此部分所使用的菌株會同時含有類核、目標基因位點上游下游的標記，以及帶有抑制子螢光融合蛋白系統的質體。. 此次實驗我們藉由改變細胞所處環境的營養密度，進而改變細胞的基因表現程度。值得一提的是，我們為了降低細胞內部的環境組成成分會對實驗結果造成影響，因此我們只在實驗前一小段時間進行更換細胞所處在的環境，並且盡量限縮觀察的時間，以避免細胞因位處在不同的培養液中，致使細胞內的環境組成相差太多。本章主要說明實驗的材料製備以及實驗步驟流程。第一節會說明樣品的製備方式；第二節說明實驗的流程與條件；第三節說明從拍攝的影像中，初步得到物理資訊的方式。 3.1. 樣品製備我們對大腸桿菌進行基因修改的流程，主要如下： I.. 連接出含有欲進行基因改造序列片段的質體。在此我們會選擇帶有複製起點R6K𝛾的質體，因該質體只能在勝任細胞 BW25141 中存活，便不會被誤轉型至我們欲進行基因改造的菌株內。 - 20 -.

(31) II.. 利用聚合酶連鎖反應技術(polymerase chain reaction,PCR)或者是以限制酶辨認限制切位，將帶有基因改造序列片段從質體中取下。在本實驗當中，我們將帶有重複操縱基因序列的基因，都是以 HindIIIHF 及 NheI-HF 兩限制酶取下基因改造序列片段。. III. 最後以 Red 同源基因重組技術，將步驟 II 所取得的片段置換進大腸桿菌的染色體中。於 3.3.1 節會介紹含有抑制子螢光融合蛋白系統的質體製備；3.3.2 節，介紹基因位點追蹤的菌株製備，即是標定基因上下游位點的菌株；3.3.3 節，介紹基因位點定位的菌株製備，即是標定 RNA 聚合酶和基因位點的菌株 3.1.1. 質體 pLT3-10 (Pcm:: gmR, Ptet::tetR-yfp::TSAL2, Plac::lacI-mScarlet::B1006)：如 2.2.1 節所述，此質體主要會生成兩種抑制子螢光融合蛋白，TetR-YFP 以及 LacI-mScarlet。質體上主要將螢光抑制子基因 tetR-yfp、lacI-mScarlet 與複製起點 colE1，以及 gmR (慶大黴素 Gentamicin, Gm 的抗藥性蛋白的基因)等基因串接而成。因其屬於多套數質體，所以可以為細胞提供足夠的融合蛋白，並且當細胞中的融合蛋白達到一定濃度時，就會與自身啟動子前端的操縱序列結合，關閉 tetR-yfp、lacImScarlet 的基因表達。 3.1.2. 基因位點追蹤的菌株Ｏ. TCH3 (hupA-mturquoise::FRT::yjaH)：此菌株是先以 MG1655 的菌株植入雙色抑制子螢光融合蛋白系統序列 yciH::FRT::Ptet::tetR-yfp::TSAL2, PparABCb:: parBb-mcherry::B1006::osmB 形成 YJL2 突變株。再以 YJL2 作為奠基植入 hupA-mturquoise::FRT::kanR::FRT::yjaH 形成 TCH3K 添加類核標記的突變株。 - 21 -.

(32) 再轉型 pCP20A 的質體將 kanR (康黴素 Kanamycin, Kan 的抗藥性蛋白的基因)進行剃除，也就是說只保留 hupA-mturquoise::FRT::yjaH 的序列，最後再將 pCP20A 剃除，便得到 TCH3 突變株。而此接下來的菌株都是奠基在 TCH3 進行下一步的基因改造。 I.. MH2912KTCL (mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA, barA1882-2757::FRT::cmR::FRT::lacOx90::gudD449-1341)：此菌株是以 TCH3 的菌株在 relA 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列，將原基因中 mazE::relA 的序列置換成 mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA 形成 MH2909KT 突變株。再以 MH2909KT 作為奠基在 relA 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列，原基因中 barA1882-2757:: gudD449-134 的序列置換成. barA1882-2757::FRT::cmR::FRT::lacOx90::gudD449-134 形成. MH2912KTCL 突變株。註：只要含有重複操縱基因序列的菌株，我們都沒有進行將抗藥性蛋白基因剔除的工作，因為在這個操作進行的過程中，容易造成操縱基因序列的縮短或丟失，使我們的基因位點成像無法有足夠好的對比度。最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH2912KTCL，就完成我們觀察標定 relA 基因上下游的菌株。 II. MH3210KTCL (ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD, mug::ileX::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yqjH)：此菌株是以 TCH3 的菌株在 rpoD 基因的上游植入康黴素的抗藥性蛋白的基因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列，將原基因中 ttdT::tsaD 的序列置換成 ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD 形成 MH3207KT 突變株。. - 22 -.

(33) 再以 MH3207KT 作為奠基在 rpoD 基因的下游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列，原基因中 mug::yqjH 的序列置換成 mug::ileX::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yqjH 形成 MH3210KTCL 突變株。最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3210KTCL，就完成我們觀察標定 rpoD 基因上下游的菌株。 III. MH3424KTCL (yhdZ::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rrfF::thRV, yrdA::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yrdB)：此菌株是以 TCH3 的菌株在 rrnD 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列，將原基因中 yhdZ::rrfF::thRV 的序列換成 yhdZ::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rrfF::thRV 形成 MH3421KT 突變株。再以 MH3427KT 作為奠基在 rrnD 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列，原基因中 yrdA::yrdB 的序列置換成 yrdA::FRT::cmR::FRT::lacOx90::yrdB 形成 MH3424KTCL 突變株。最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3424KTCL，就完成我們觀察標定 rrnD 基因上下游的菌株。 IV. MH3917CLKT (glmU::FRT::cmR::FRT::lacOx90::atpC, atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG)：此菌株是以 TCH3 的菌株在 atp 基因的下游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列，將原基因中 glmU::atpC 的序列換成 glmU::FRT::cmR::FRT::lacOx90::atpC 形成 MH3913CL 突變株。再以 MH3913CL 作為奠基在 atp 基因的上游植入康黴素的抗藥性蛋白的基因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列，原基因中 atpI::rsmG 的序列置換 atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG 形成 MH3917CLKT 突變株。最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3917CLKT，就完成我們觀察標定 atp 基因上下游的菌株。 - 23 -.

(34) V.. MH3935CTKL (rbsR::FRT::cmR::FRT::tetOx56::hrsA, aspT::trpT::FRT::kanR::FRT::lacOx90::hdfR)：此菌株是以 TCH3 的菌株在 rrnC 基因的上游植入氯黴素的抗藥性蛋白的基因及 56 個重複的操縱基因 tetO 序列，將原基因中 rbsR::hrsA 的序列換成 rbsR::FRT::cmR::FRT::tetOx56::hrsA 形成 MH3931CT 突變株。再以 MH3931CT 作為奠基在 rrnC 基因的下游植入康黴素的抗藥性蛋白的基因及 90 個重複的操縱基因 lacO 序列，原基因中 aspT::hdfR 的序列置換成 aspT::trpT::FRT::kanR::FRT::lacOx90::hdfR 形成 MH3935CTKL 突變株。最後再轉型 pLT3-10 質體進入 MH3935CTKL，就完成我們觀察標定 rrnC 基因上下游的菌株。. 3.1.3. 基因位點定位的菌株Ｏ. AYT2C (rpoC4025-4221-PAmcherry::FRT::cmR::FRT::PjyaZ)：此菌株是為了標定 RNA 聚合酶的突變株，是以 TCH3 作為奠基之下，植入 rpoC4025-4221-PAmcherry::FRT::cmR::FRT::PjyaZ 形成 AYT2C 突變株。而接下來都會以 AYT2C 作為基礎進行下一步的目標基因鄰近啟動子一側的標記。註：我們想像中基因被旺盛表達時，RNA 聚合酶會主動搜尋基因的啟動子序列，因此轉錄因子們應該會更傾向聚集在鄰近啟動子的那一側，故我們在此部分選擇標定的基因位點，是在基因上下游位點的標記中，相對比較靠近基因啟動子序列的那一個位點。然而，由於我們在挑選基因位點標定的切入點時，有考慮盡量不要影響到基因啟動子及其他基因的序列，以避免更動了基因表現的行為或造成其他生理機制的變化，因此距離啟動子更近一些的位點，不一定是基因位點的上游標記。. - 24 -.

(35) I.. MHR2909KT (mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA)：此菌株是參照 relA 下游的標記位點(相距啟動子序列~ 2.3 kb )，將 AYT2C 中 mazE::relA 的序列置換成 mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA 形成 MHR2909KT 突變株。再轉型 pLT3-10 質體到 MHR2909KTCL 中，就完成我們觀察 RNA 聚合酶與 relA 基因位置訊息的菌株。. II. MHR3207KT (ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD)：此菌株是參照 rpoD 上游的標記位點(相距啟動子序列~ 3 kb)，將 AYT2C 中 ttdT::tsaD 的序列置換成 ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD 形成 MHR3207KT 突變株。再轉型 pLT3-10 質體到 MHR3207KT 中，就完成我們觀察 RNA 聚合酶與 rpoD 基因位置訊息的菌株。 III. MHR3427KT (yrdA::FRT::kanR::FRT::tetOx56:: yrdB)：此菌株是參照 rrnD 上游的標記位點(相距啟動子序列~ 1.8 kb)，將 AYT2C 中 yrdA::yrdB 的序列置換成 yrdA::FRT::kanR::FRT::tetOx56::yrdB 形成 MHR3427KT 突變株。再轉型 pLT3-10 質體到 MHR3427KT 中，就完成我們觀察 RNA 聚合酶與 rrnD 基因位置訊息的菌株。 IV. MHR3920KT (atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG)：此菌株是參照 atp 上游的標記位點(相距啟動子序列~ 1.5 kb)，將 AYT2C 中 atpI::rsmG 的序列置換成 atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG 形成 MHR3920KT 突變株。再轉型 pLT3-10 質體到 MHR3920KT 中，就完成我們觀察 RNA 聚合酶與 atp 基因位置訊息的菌株。. - 25 -.

(36) V.. MHR3931KT (rbsR::FRT::kanR::FRT::tetOx56::hrsA)：此菌株是參照 rrnC 上游的標記位點(相距啟動子序列~ 2.4kb)，將 AYT2C 中 rbsR::hrsA 的序列置換成 rbsR::FRT:: kanR::FRT::tetOx56::hrsA 形成 MHR3931KT 突變株。再轉型 pLT3-10 質體到 MHR3931KT 中，就完成我們觀察 RNA 聚合酶與 rrnC 基因位置訊息的菌株。. 3.2. 實驗流程本節會介紹關於實驗的工具及實驗條件和步驟。3.2.1 節，介紹在觀測前的實驗養菌條件和流程；3.2.2 節，介紹實驗所使用的光學儀器和觀測條件及觀測步驟。 3.2.1. 觀測前的樣品準備工作 ֍ 樣品菌株：本實驗中所有的大腸桿菌樣品菌株，會在進行觀測前一天從冷凍養菌管中抽取 2 μl 的菌液，稀釋至 1/1000 倍在 LB 混和培養液(30 μg/ml Kan, 34 μg/ml Cm, 10 μg/ml Gm, LB 培養液)，置入37 °C 的培養箱，以 240 rpm 搖晃培養 1820 小時之後，再稀釋至 1/50 倍於 EZ − M9 混和培養液(30 μg/ml Kan, 34 μg/ml Cm, 10 μg/ml Gm, 75% EZ 培養液, 25% M9 培養液)中，繼續置入培養箱中培養。當細胞濃度培養到OD600 = 0.4 ~ 0.6 (菌液對分光光度計 Termo scientific Multisskan go 發射出 600 nm 的光，吸收度值達到 0.4 ~ 0.6。初始養菌濃度 OD600 ~0.05)時，取出500 μl的菌液以 4000 rpm 的轉速離心 1~2 分鐘後，將上清液倒掉，並加入 50 μl 相同的培養液回溶菌胎，使菌液濃縮十倍以利數據的蒐集與累積。濃縮後的菌液便可以進行以下操作： a. 欲進行觀測 RNA 聚合酶及目標基因位點位置的菌株，會各自取出 0.2~0.3 μl 菌液分別點在 EZ 及 M9 的洋菜膠(配置方法於下段補充)上， - 26 -.

(37) 點在 EZ 洋菜膠（營養密度高）上的菌株須立即進行觀測。而點在 M9 洋菜膠（營養密度低）上的菌株，需靜置 20 ~ 30 分鐘左右（此時細胞已經進行調節基因表現），方可以開始進行觀測。 b. 欲進行追蹤基因為點上下游軌跡的菌株，則需先混入少量的螢光小球，以便之後進行軌跡校正（於 3.3 節中做說明），接續的步驟則與 a 部分相同。 ֎ 洋菜膠：為了細胞在我們進行觀測時不會在液體中游動，我們使用洋菜膠覆蓋在菌液上，使細胞能固定在我們聚焦的玻片表面。再進行實驗觀察前，我們會將洋菜膠粉(SeaPlaqueR Agarose low melting temperature agarose)以最終濃度 2%的量混入 EZ 或 M9 的培養液中，並將洋菜膠溶液用加熱器加熱至70 °C，直到粉末完全溶解，再取~15 μl 的洋菜膠溶液點在乾淨且均勻塗滿真空油（為了防止膠體沾黏）的載玻片上，再以 18 × 18 mm的蓋玻片覆蓋，使膠體呈現厚度均勻的薄圓盤狀，於室溫下靜置 45~60 分鐘後，就會冷卻凝固成有彈性的洋菜膠片。成型的洋菜膠片需在盡量在1 ~ 1.5 小時內使用完畢，否則會使得膠片過乾，而使得膠體表面有不平滑的紋路，嚴重影響實驗的觀測。 3.2.2. 觀測的條件和步驟本次實驗中所有的影像都是使用油鏡倒立式螢光顯微鏡(IX71, OLYMPUS) 以及放大倍率為 100 倍的油浸接物鏡(60X / NA 1.3, OLYMPUS, JAPAN)進行觀察。並使用電子倍增電荷耦合元件相機(EMCCD digital camera,HAMAMATSU ImageEM)偵測與接收光子訊號，成像的影像像素大小為160 nm × 160 nm。在進行觀測 RNA 聚合酶與基因位點位置的實驗中，我們會先以波長488 nm 的激發光激發 YFP，以曝光時間 0.05 秒，連續拍攝 15 張後再進行平均，得到目標基因位點的位置影像。再以波長 405 nm 以及 561 nm (~ 0.5 kW/cm2 )的激發光同時激活激發 PAmCherry，以曝光時間 0.05 秒，連續拍攝 1 分鐘，得到 RNA - 27 -.

(38) 聚合酶的單分子影像。最後再以波長 405 nm 激發光激發 mTurquoise 和白光照射，以曝光時間 0.05 秒，連續拍攝 15 張後再進行平均，得到類核空間分布和細菌的輪廓相位差成像。比較需要注意的是，再進行 RNA 聚合酶的單分子影像的拍攝前，為了得到更好的對比度，我們會先用波長 561nm 激發光照射將非 PAmCherry 的紅色螢光物質都進行光漂白，才開始進行 RNA 聚合酶單分子影像的拍攝。在進行追蹤基因位點上下游軌跡的實驗中，我們會先以波長488 nm 和 561 nm的激發光交替激發 YFP 和 mScarlet，以拍攝時間間隔 0.25 秒，曝光時間 0.2 秒，交替拍攝 100 秒，各得到 200 張的基因上下游位點的影像。最後再以波長 405 nm 激發光激發 mTurquoise 和白光照射，以曝光時間 0.05 秒，連續拍攝 15 張後再進行平均，得到類核空間分布和細菌的輪廓相位差成像。. 3.3. 影像分析 3.3.1. 單分子定位分析為了得到 RNA 聚合酶的單分子定位資訊，我們會將錄製的影像經由額外安裝的 ImageJ 插件 ThunderSTORM，進行點擴散函數的定位，使用的計算方法如 2.1.1 節所介紹。我們設定將原影像的像素大小除以 8 倍得到次像素的定位資訊，故分析出超解析影像的像素大小為20 nm × 20 nm，輸出的位置資訊會是以奈米為單位呈現，我們便利用輸出定位座標和精確度，以 MATLAB 進行下一步的篩選和計算統計。本次所使用的聚類分析演算法 DBSCAN，就是直接使用 MATLAB 內建指令執行。分析的結果會在第四章進行說明與探討。 3.3.2. 單分子追蹤分析我們剛由實驗中所錄製的影像，因為是兩個激發光頻道交替拍攝，所以我們便先利用 ImageJ 將基因位點上下游的影像分開來。單頻道基因位點的影像會再使用 Image 的插件 TrackMate，來得到影像中每個基因位點的軌跡資訊。其精神 - 28 -.

(39) 主要是先選定一個直徑大小（與影像中直接觀看的位點亮點的直徑大小差不多）和亮度閾值，並在影像中以此直徑大小的圓進行搜尋，使得圓內的中心值即是圓圈範圍內的出現發射光點的機率為最高，並再藉由每一張定位到的位置，找尋下一張最靠近且不超過我們所給定偏移量的定位點依序進行串接。而後再做一些條件篩選，便可以得到影像檔中每個位點的軌跡資訊。再使用 MATLAB 找尋兩個頻道間軌跡的配對，而如同前文所述，我們在菌液中混入螢光小球，使得一個畫面具有數個螢光小球位點。我們將畫面中基因位點的軌跡減去螢光小球的平均軌跡，藉此對軌跡進行修正，排除因為拍攝影像過程中的視野滑動所造成的位移。得到修正後的軌跡，會再進行下一步的方均位移、速度自相關、速度互相關等計算，分析結果會在第四章進行說明與探討。. - 29 -.

(40) 圖 3.1 樣品標記的相對位置所有的菌株都共同具有類核標記，以及攜有融合蛋白系統的質體。RNA 聚合酶以及基因位置觀測實驗的樣品，都會使用光激活蛋白標記 RNA 聚合酶，並在靠近目標基因啟動子端進行標定。雙位點軌跡追蹤的實驗樣品則會在目標基因上下游做雙色的標定。. - 30 -.

(41) 表 3.1 質體表質體. 複製起點. pLT3-10. ColE1. 說明. 抗藥基因. Pcm:: gmR, Ptet::tetR-yfp::TSAL2, Plac::lacI-mScarlet::B1006. gmR. 表 3.2 菌株表菌株. 說明. 抗藥. 目標. 基因. 基因. -. non. -. -. non. -. -. cat. -. 質體. （親代）. YJL2 (MG1655). TCH3 (YJL2). AYT2C (TCH3). MH2912KTCL. yciH::FRT::Ptet::tetR-yfp::TSAL2, PparABCb::parBb-mcherry::B1006::osmB hupA-mturquoise::FRT::yjaH rpoC4025-4221-PAmcherry::FRT:: cmR::FRT::PjyaZ mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA, 1882-2757. barA (TCH3). MH3210KTCL (TCH3). R. ::FRT::cm ::FRT::. pLT3-10. 449-1341. lacOx90::gudD. ttdT::FRT::kanR::FRT::tetOx56::tsaD, mug::ileX::FRT::cmR::FRT::lacOx90::. pLT3-10. yqjH. MH3424KTCL (TCH3). yhdZ::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rrfF::. pLT3-10. thRV, R. yrdA::FRT::cm ::FRT::lacOx90::yrdB. MH3917CLKT (TCH3). MH3935CTKL (TCH3). glmU::FRT::cmR::FRT::lacOx90::atpC,. pLT3-10 atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG rbsR::FRT::cmR::FRT::tetOx56::hrsA, aspT::trpT::FRT::kanR::FRT::lacOx90. pLT3-10. ::hdfR. MHR2909KT (AYT2C). mazE::FRT::kanR::FRT::tetOx56::relA. - 31 -. pLT3-10. cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR. relA. rpoD. rrnD. atp. rrnC. relA.

(42) MHR3207KT R. (AYT2C). ttdT::FRT::kan ::FRT::tetOx56::tsaD. pLT3-10. yrdA::FRT::kanR::FRT::tetOx56::yrdB. pLT3-10. atpI::FRT::kanR::FRT::tetOx56::rsmG. pLT3-10. rbsR::FRT:: kanR::FRT::tetOx56::hrsA. pLT3-10. MHR3427KT (AYT2C). MHR3920KT (AYT2C). MHR3931KT (AYT2C). - 32 -. cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR cat, aphA, gmR. rpoD. rrnD. atp. rrnC.

(43) 第四章實驗結果與討論為了能夠了解基因表現對該基因周邊的 RNA 聚合酶分布的影響，我們在第一部分的實驗，會先觀察在基因旺盛表達與非旺盛表達之下，RNA 聚合酶在基因位點周圍的群聚情形是否會產生變化。也可以了解 RNA 聚合酶整體的群聚現象會不會有所改變。而為了要了解基因表現對染色體運動的影響，在第二部分實驗，會觀測目標基因上下游在基因旺盛表達與非旺盛表達之下，會不會有不一樣的運動狀態。而我們所選定的幾個目標基因，會不會也因為彼此之間基因表達的旺盛程度不同，使得基因運動狀態有不同的趨勢。本章 4.1 節會探討基因表現與 RNA 聚合酶分布情形的關聯；4.2 節會討論基因表現對基因位點運動行為產生的影響，以及最後探討是否與 4.1 節的結果互相呼應。 4.1. 基因表現對 RNA 聚合酶分布的影響根據前人的實驗，已經可以知道 RNA 聚合酶在細胞空間中的分布範圍會與類核的分布範圍相似，但 RNA 聚合酶則會有局部群聚的行為發生。當細胞處在不同營養密度環境時，這個群聚的現象似乎也會有所改變。在本實驗中，我們想了解 RNA 聚合酶的群聚現象，與細胞的基因表現程度會不會有關聯。因此我們量測目標基因以及 RNA 聚合酶的位置，進行空間上的比對與分析。於 4.1.1 節中，我們會探討 RNA 聚合酶自身的群聚現象，並與類核和隨機分布模型進行比較；4.1.2 節，我們會從目標基因的角度出發，觀察 RNA 聚合酶在基因周圍的聚集情形。 4.1.1. RNA 聚合酶的群聚現象我們重複了前人的實驗，同樣觀察了 RNA 聚合酶的群聚現象。而為了更好的去描述細部的聚集團結構和行為，我們藉由單分子定位顯微術，得到了 RNA 聚合酶的位點資訊。為了進一步確認我們所觀察到的群聚現象與隨機分布不同， - 33 -.

(44) 我們計算每個位點貢獻在細胞空間中的機率分布，藉此重建出 RNA 聚合酶的機率分布影像。並再將 RNA 聚合酶的機率分布影像，分別與類核的影像以及分子在細胞質內隨機分布的模擬影像進行關聯性分析。結果發現無論當細胞處在營養或不營養的環境中，RNA 聚合酶與類核分布的相關性，都會比 RNA 聚合酶與隨機分布來的更有關聯(圖 4.2)。這也再一次印證了 RNA 聚合酶的分布範圍，會與類核分布範圍相似的行為。我們也可以觀察到當細胞處在營養環境時，RNA 聚合酶與隨機分布的相關性會有變得更低的趨勢。然而營養環境的變動，卻沒有對細胞的 RNA 聚合酶與類核分布的相關性造成明顯的區別。這也說明，當細胞處於營養密度高的環境，會使得 RNA 聚合酶以及類核的分布一同變得更為集中。 (圖 4.1) 接著，我們使用 DBSCAN 對 RNA 聚合酶進行聚類分析，並依據聚集團內部的分子數佔整體分子數的比例進行統計，結果發現約有 78%的分子都會參與聚集團，並且大多數都以小聚集團的形式出現在細胞內(圖 4.3 A 和 B)。我們再依據 RNA 聚合酶到細胞骨架的最短距離進行統計，發現 RNA 聚合酶相對於隨機分布，都會有明顯向細胞骨架靠近的現象，且大聚集團（聚集團內部的分子數佔整體分子數的比例> 2%）更傾向出現在細胞骨架上(圖 4.4)。我們也針對聚集團的迴轉半徑大小、細胞中聚集團的數量進行統計(圖 4.3 C 和 D)，並且都與隨機分布進行比較，結果也證實了我們所觀察到的群聚行為與隨機分布都有很大的不同。而我們也觀察到當細胞處於較營養的環境中，RNA 聚合酶會有較多的分子參與聚集團，而聚集團裡的分子數比例也會比較多，然而細胞中所含的聚集團數量則會稍微變少，只是差異並不是非常的顯著。綜合以上的分析，我們會發現細胞在營養環境的快速變動下，對於 RNA 聚合酶的數量以及聚集團的形式不會立即產生太大的差異，但在整體的分布中，則. - 34 -.

(45) 會明顯的與類核一同在細胞骨架的方向上產生變動，而這就很可能意味著 RNA 聚合酶的分布情形，也許更容易受到類核整體分布的改變而產生相對應的變化。 4.1.2. 基因位點周圍的 RNA 聚合酶我們猜想如果基因的表達會為 RNA 聚合酶提供群聚的力量，那麼當基因被旺盛表達時，基因的周圍應該會存在更多的 RNA 聚合酶，抑或及聚集團。因此我們選定了五個目標基因位點並對靠近啟動子的一端進行標定。而除了 relA 之外，其餘的四個目標基因 rpoD, rrnD, atp, rrnC，都是當細胞處於營養環境中，更會被旺盛表達的基因。故在我們的想像中，當我們改變細胞處在的環境時，我們或許能看到這四個基因與 RNA 聚合酶的空間相對位置，會產生不太一樣的變化。因此，基於 RNA 聚合酶的位置資訊，我們先以每一隻菌各自的 RNA 聚合酶空間密度作為條件，模擬分子在細胞質間隨機分布的狀態。接著再以目標基因的位置為中心，統計在不同的距離範圍之內，RNA 聚合酶的數量會是隨機分布分子數量的幾倍。如圖 4.6 所示，結果我們會發現五個基因位點附近的 RNA 聚合酶，都會比隨機分布的數量還來的高出許多倍，這也再次印證了 RNA 聚合酶的分布與隨機分布不同。然而，與我們想像中不一樣的是，除了 rrnD 和 atp 在營養環境中會有更多的 RNA 聚合酶群聚在基因周圍，其餘目標基因周圍的 RNA 聚合酶數量都沒有明顯的變化。根據之前的研究提及，除了 rrnC 之外，其餘的 6 個核醣體 RNA 基因（包括 rrnD）在細胞空間中的位置都會彼此互相靠近[25]。雖然 rrnC 與 rrnD 同屬核醣體 RNA 基因序列，都是在營養環境中會被細胞旺盛表達的基因，基因的特性應該相似。然而實驗結果卻告訴我們，RNA 聚合酶在營養環境中，會更傾向群聚在 rrnD 的周圍，而 rrnC 則否。這也很可能表示，單個基因的旺盛表達並不足以有對 RNA 聚合酶的群聚產生很大的影響，必須是由許多個都需要被旺盛表達且在空間上彼此互相靠近的基因，才可以讓 RNA 聚合酶的群聚現象有明顯差異。 - 35 -.

(46) 也就是說造成 RNA 聚合酶群聚的因素，很可能還是跟染色體自身的構型比較相關，而這個結果也會與上部分的結果一致。 4.2. 基因表現對染色體運動的影響我們知道在前人的實驗中就可以得知，基因表現與染色體構型會存在著關聯性，目前來說染色體的構型會影響基因表現，已經是一個大家比較公認的結果。然而對於基因表現是如何對染色體構型產生影響，轉錄作用又會提供什麼樣的力量，這部分仍是比較需要更多的實驗來進行詮釋。為了要量化基因表現具體會為染色體帶來什麼尺度的影響，我們分別追蹤目標基因上下游的位點，藉由得到基因位點的軌跡進行運動行為的分析與探討。於 4.2.1 節中，討論基因上下游兩位點之間的平均距離與染色體構型的關係；4.2.2 節，探討基因位點擴散行為的趨勢；4.2.3 節，說明基因軌跡速度互相關的分析結果。 4.2.1. 基因位點上下游的相對距離我們想初步了解，當基因被旺盛表現時周圍的染色體局部結構是不是就會有什麼不同，因此在我們想像中，如果染色體的局部結構有改變，那麼空間中基因位點的相對距離應該也會產生變化。我們的做法是先算出每個時刻基因上下游位點的相對距離再進行平均，就可以得到五個目標基因各自條件下的上下游平均相對距離(圖 4.7）。我們可以從結果看出，當細胞處於營養環境底下時，基因上下游位點的相對距離會有稍微變小的趨勢，這也說明此時細胞內的染色體會變得更加擁擠了，此一結果也可以與第一部份實驗結果相呼應。這代表當細胞處於營養密度高的環境底下，染色體的整體分布以及局部的結構都會變得更加聚集緊實。 4.2.2. 基因位點上下游的擴散運動我們進一步再針對基因的擴散運動行為進行討論。藉由計算位點各自的方均位移與延遲時間的關係，各自取對數後再進行線性擬合，得到方均位移與延遲時 - 36 -.