多重抗體微陣列晶片

我們將 TNFα、α1AT、Cystatin C 和 E-Cadherin 這四種蛋白質同時進行微陣列 晶片的製作，以原本的實驗參數和由田口法挑選出的最佳參數進行實驗，計算出最 低偵測極限以及繪製標準曲線，最低偵測極限的改善程度以百分比表示，計算公式 如下:

^{LODafter−LODbefore}

LOD_before

× 100

實驗總結果之數據如表 3-5、3-6 所示，偵測極限的變化趨勢以圖 3-20,21,22 表示，

而偵測極限的改變程度由表 3-7 以百分比呈現。我們分別針對無添加訊號放大組的 結果以及有添加訊號放大組的結果，探討田口法前、後使用的實驗參數是否能改善 晶片的靈敏度;除此之外，也針對使用訊號放大系統對於晶片靈敏度的影響情況進行 描述。

表 3-5 田口法前、後實驗參數比較表

*α1AT 的 cAb 濃度皆維持 72 μg/ml，田口法前後都沒有改變

56 1

10 100 1000

TNFα α1AT Cystatin C E-Cadherin

Limit of detection (pg/ml)

Assay before after

1 10 100

TNFα α1AT Cystatin C E-Cadherin

Limit of detection (pg/ml)

Assay before after

表 3-6 最低偵測極限實驗總數據比較表

圖 3-20 無訊號放大組-田口法前、後偵測極限比較圖

圖 3-21 訊號放大組-田口法前、後偵測極限比較圖

57 1

10 100 1000

TNFα α1AT Cystatin C E-Cadherin

Limit of detection (pg/ml)

Assay without TSA with TSA

圖 3-22 參數優化後有、無訊號放大組偵測極限比較圖

表 3-7 田口法與訊號放大系統對於最低偵測極限的改變程度表

*負號表示方向，表示偵測極限變小；數值越大表示差異越大

58

1.無訊號放大組

由這組實驗我們能得知田口法的使用對於無訊號放大系統晶片的影響力，透過 實驗結果分析，我們發現 TNFα、Cystatin C 和 E-Cadherin 的捕獲抗體濃度為 500 μg/ml 時的效果較好，而 α1AT 則是 72 μg/ml；四種蛋白質的偵測極限都有因為偵測 抗體濃度的改變而有降低，TNFα、α1AT、Cystatin C 和 E-Cadherin 依序改變程度為 16.91 %、62.64 %、66.43 %、89.73 %，而其標準曲線如圖 3-23 所示。

圖 3-23 無訊號放大組-田口法前、後標準曲線比較圖

R²=0.968 R²=0.989

R²=0.867 R²=0.831

R²=0.881 R²=0.909

R²=0.971 R²=0.987

In te n si ty (a .u .)

Concentration (pg/ml)

59

2.訊號放大組

由這組實驗我們能得知田口法的使用對於訊號放大系統晶片的影響力，實驗結 果顯示，透過田口法挑選過的實驗參數對於偵測極限有降低的效果，TNFα、α1AT、

Cystatin C 和 E-Cadherin 依序影響程度為 70.52 %、24.08 %、79.00 %、78.93 %，而 其標準曲線如圖 3-24 所示。由以上實驗可知田口法對於優化實驗的參數是有一定 程度的效果。

圖 3-24 訊號放大組-田口法前、後標準曲線比較圖

R²=0.979 R²=0.949

R²=0.902 R²=0.907

R²=0.977 R²=0.982

R²=0.964 R²=0.958

In te n si ty (a .u .)

Concentration (pg/ml)

60

3.訊號放大系統的影響情況

我們將優化過後有、無訊號放大組的實驗進行比較，主要目的在於判斷訊號放 大系統的使用與否對於晶片偵測極限的影響，實驗結果顯示，四種蛋白質使用訊號 放大系統後整體的螢光強度都有所提升(圖 3-25)，而偵測極限亦有降低，由此可知，

訊號放大系統能確實夠提升整體的訊號強度也能降低偵測極限。

圖 3-25 參數優化後有、無訊號放大組標準曲線比較圖

R²=0.949 R²=0.989

R²=0.907 R²=0.831

R²=0.982

R²=0.909

R²=0.958

R²=0.987

In te n si ty (a .u .)

Concentration (pg/ml)

61 定在微點的表面區域，以至於 tyramide 鍵結的空間變小，結構不易和周邊的 tyrosine 結合，而濃度為 250 μg/ml 時，有較多的空間能讓 tyramide 鍵結，故 CapAb 濃度為

62

或許會影響實驗的結果，關於這個部分應該要再設計更多的實驗進行驗證，雖然這 樣就失去了田口法簡單、快速的核心意義，但也許能因此探討是否田口法適用於蛋 白質微陣列晶片這樣複雜的生物檢測實驗。

3.田口法結果一致性

我們發現搭配訊號放大系統後，選擇重要因子一致性相對於無訊號放大組的低，

推測可能原因為訊號放大系統會使晶片整體的標準差提高，使整個實驗的穩定性沒 有無訊號放大組好，也許未來能夠針對 tyramide 濃度進行調整，來降低整體實驗的 標準差。

63

四、結論