我們應用三明治酵素免疫分析法於微陣列晶片上，發展檢測糖尿病腎病變生 物標記的晶片，盼未來能夠藉由此晶片針對糖尿病腎病變進行早期的篩檢與診斷，
這樣的生物檢測方法，靈敏度好壞對於檢測結果是相當重要的，故我們透過使用 訊號放大系統及田口實驗設計法，期望能夠降低偵測極限，使微陣列晶片具有更 有高的檢測實力。以下分為微陣列技術、酵素免疫分析法、訊號放大系統及田口 實驗設計法，四大部分來進行介紹。
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1.2.1 微陣列技術 (Microarray Technology)
微陣列技術最早的概念是 1982 年由 Augenlicht 及 Kobrin 所提出的 DNA 微 陣列[9]，他們於濾紙 (nitrocellulose filter)上進行基因序列的篩選，微點大小約 1-2 mm，而蛋白質微陣列概念的出現則是 1983 年由 Chang 所提出[10]，直到 1995 年由 Patrick O. Brown 等人發展出裝置微型化(miniaturized)的 cDNA 微陣列技術 [11]，使用基材為玻璃載玻片，能於 3.5 mm x 5.5 mm 的範圍內，利用點陣機點陣 (non-contact)，利用壓電晶體或其他推進方法將樣品噴到基材上[16, 17]。
微陣列晶片能同時偵測數千個參數、裝置微小化、樣品需求量低且快速又具 有高靈敏度[12, 16, 18-20]，依基材上探針的材質大致可分為基因晶片和蛋白質晶 片，基因晶片的基本概念建立在雜交反應 (hybridization)上，將晶片上已固定的 核酸探針與樣品進行反應，達到辨識基因序列的目的[21]，而蛋白質晶片的製作 方式與基因晶片雷同，差異在作用對象改為蛋白質，但是由於蛋白質容易失去活 性且結構較為複雜，故在實際運用上，較基因晶片困難許多。透過挑選蛋白質種 類、改良式蛋白質微陣列、阻斷非專一性抗體鍵結、基材表面處理、抗體結構選 定、最佳化設計參數等方法[20, 22-24]來改善以前蛋白質晶片存在的一些問題，
例如:表面處理不佳、交叉反應 (cross-reactivity)、專一性、蛋白質的純化、品質 的控制、固定化的方向性等[22-25]。
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1.2.2 酵素免疫分析法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)
1966 年由 Wide 及 Jerker Porath 所提出[26]，ELISA 利用抗原和抗體產生專 一性結合，配合酵素連結進行呈色反應作為檢測方法，首先將抗原或抗體利用吸 附或是共價鍵結的方式固定在固態的基材上，通常是使用 96 或 384 孔盤當作基 底，透過 blocking 降低非專一性鍵結，洗去未鍵結的物質後，再加入接有酵素的 抗原或抗體，鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase)、山葵過氧化物酶 (horseradish peroxidase)和 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)是最常用的三種酵素，最後加入這些 酵素的受質 (substrate)進行呈色的反應，若要反應更為專一，則可以利用生物素 (biotin)與卵白素 (streptavidin)之間的高親和力取代酵素-受質的反應；因為實驗操 作簡易，已成為廣泛使用的免疫分析法之一，這種方法可以進行高通量的篩檢[27]，
可用於藥物篩檢、食品工業、臨床疾病診斷…等，主要分為直接法(direct)、間接 法(indirect)、三明治法(sandwich)及競爭法(competitive)[28]，如圖 1-1 所示。
圖 1-1 四種酵素免疫分析法
1.直接法:
可用於測定抗原總量，固定抗原後加入標記抗體；操作簡單，不需利用二級抗體，
可減少交互作用，但此標記抗體的專一性非常重要。
2.間接法:
(A) 直接法 (B) 間接法 (C) 三明治法 (D) 競爭法
標記抗體 抗體 抗原 標記抗原 螢光染劑
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主要用來檢測抗體量；固定已知抗原，加入待測抗體，再加入標記抗體；更換不 同的已知抗原，可用同一種標記抗體檢測各種與不同抗原相對應的抗體，可降低 成本。
3.三明治法:
可用於偵測分泌性的產物如細胞激素 (cytokines)，最常用於偵測樣本中的抗原量；
固定捕獲抗體 (capture antibody)，依序加入待測抗原、標記偵測抗體 (detection antibody)，四種方法中，此法擁有最高靈敏度，因為是透過二次的判定結果，但
1.滾輪式擴增法 (Rolling-Circle Amplification, RCA)
RCA 這項技術於 1995 年由 Yale 大學的 Paul Lizard 教授所發明[29]，2000 年經由 Schweitzer 等人首次提出將 RCA 應用在蛋白質晶片上[30]，RCA 是一種 訊號放大的方法，能提高實驗的靈敏度，將訊號提升一千倍以上；使用時須添加 DNA 引 子 (primer) 、 環 狀 DNA 及 DNA 聚 合 酶 (polymerase) 及 核 苷 酸 (nucleotides)[31]，DNA 引子和抗體連接後與環狀 DNA 結合，複製出一長條單股 DNA，最後以半抗原標記或螢光標記的核甘酸、酵素標記的互補核甘酸序列進行
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雜交等方式做訊號的偵測[30](圖 1-2)，步驟大約 45 分鐘可完成；此方法需要較 多的化學試劑且步驟較為繁雜，並非每間實驗室都能方便使用[32]。
圖 1-2 RCA 訊號放大示意圖
(A) 引子的 5’端與抗體結合 (B) 接有引子的抗體會與對應之目標分子結合 (C) 環狀 DNA 與引子產生雜交後，透過 DNA 聚合酶和核苷酸開始了複製的 過程 (D) 接有引子的抗體上因複製而產出一條單股的 DNA (E) 螢光分子 鍵結於 DNA 長鏈 [31]