(一) 前言
多數亞硝胺具有強烈的致癌性質，廣泛的存在食物、香菸及檳榔中，以香煙中的濃度較高 [Hecht, 2014; Hoffmann et al., 1994]。食物中的亞硝胺來源主要有三大來源：(1) 含亞硝酸鹽食 物與含胺類食物混合食用形成。(2) 直接食用或曝露含亞硝胺的食物。(3) 含硝酸鹽的蔬菜或 食物，由腸胃道細菌代謝後，產生亞硝酸鹽；或蛋白質食物經腸胃細菌代謝成硝酸鹽，經由唾 液分泌，由口腔細菌分解為亞硝酸鹽，可能會在在腸胃道中合成亞硝胺。在飲食中出現的典型 亞硝胺約有 8 種，包括 NDEA、NDMA、NDPA、 NDBA、NMEA、NMor、NPip 及 NPyr，
其中最早被發現也是最常出現的為 N-亞硝基二甲胺 (NDMA)，因此 NDMA 也是研究亞硝胺毒 性及致癌性的代表性化合物。在動物實驗中，亞硝胺有強烈肝毒性會引起肝炎、肝硬化，而且 會引起口腔、食道、鼻、氣管、肺、肝及胰臟等癌症[Jakszyn & Gonzalez, 2006]。亞硝胺對核 酸及蛋白質具有強烈的修飾作用 (modification)，在 DNA、RNA 及蛋白質分子上形成烷基化內 轉體(alkylated adduct)，在 DNA 上所累積之烷基化內轉體未被清除修補，普遍被認為是亞硝胺 造成多種癌症形成的重要機制[Verna et al., 1996: Shuker & Bartsch, 1994]。
除 DNA 修飾作用之外，亞硝胺曝露在蛋白質上所引發的烷基化修飾作用及可能之生理影 響，則較少被探討。近年來，蛋白質烷基(甲基化)在癌細胞生長、轉移及訊號傳遞途徑上均扮 演重要角色。蛋白質發生甲基化的位置通常在精胺酸 (arginine) 及離胺酸 (lysine)殘基上，蛋 白質發生甲基化將直接影響其分子穩定性及酵素活性[Egorova et al., 2010; Yang et al., 2009]，
或間接影響與蛋白質或 DNA 之交互作用 (interaction)，也可能造成蛋白質在細胞內的分佈改 變，進而調節細胞內訊息傳遞及基因之表現，例如甲基化組蛋白(histone)將造成與 DNA 鍵結 能力之改變，進而抑制或增強特定基因之表現程度[Liu et al., 2014]；修克蛋白 70 (HSP70)甲基 化後，將由細胞質為主分佈轉變為以細胞核分佈為主[Cho et al., 2012]。另外，許多的研究 報告也指出：多種腫瘤抑制蛋白也發生甲基化作用且改變其功能，它們包括 BRCA1 及 P53 蛋 白質[Guendel et al., 2010; Jansson et al., 2008]，這些數據指出：亞硝胺所導致的蛋白質烷(甲)基 化，在其所誘發的癌症及病變上可能扮演重要的角色，相當值得研究加以探討了解。
82 含有10% FBS、1% Penicillin-Streptomysin)培養液及DMEM(內含10% FBS、1% non-essential amino acids,1% Penicillin-Streptomycin)培養液進行培養，培養環境為內含5% CO2的恆濕37°C培 養箱中。培養基每二日更換一次，細胞生長達八成滿時進行稀釋分盤，稀釋比為5:1。 (FlexStation® 3 Benchtop Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, Germany)測量波長 590 nm 處的吸光值，作為細胞數目之判斷依據。
3.2 彗星分析法
彗星分析(Comet Assay)廣泛應用於單細胞 DNA 損傷的測量。細胞經 NDMA 處理後，以 trypsin 分解方式收集細胞，並且製成細胞凝膠玻片，每片細胞玻片含約 1×105個細胞。將細胞 玻片的蓋玻片小心移除，浸入細胞溶解液(2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris base、200 mM NaOH、34.1 mM N-Lauroylsarcosine sodium salt、1% Triton X-100、10% DMSO)中，進行細胞 膜溶解 1 小時，將細胞玻片取出並以大量 RO 水清洗，排列於內含約 2 公升電泳液約(1 mM EDTA、300 mM NaOH，pH 13)的電泳槽中，浸泡 20 分鐘，進行 DNA 雙股解旋，然後以起始 安培數為 300 mA、電壓為 25 伏特，進行電泳 20 分鐘，電泳結束後以中和液(400 mM Tris base，
pH 7.4)沖洗膠片 3~5 次，使 DNA 雙股復原，最後以 μL μg/mL)染色細胞 DNA，
蓋上蓋玻片，置於暗盒中，隔日以螢光顯微鏡觀察，並利用 Comet assay III 軟體(Perceptive Instruments, UK)分析細胞 DNA 之拖曳長度百分比及亮度的積分為 Tail Moment (TM)值，作為 DNA 傷害程度的判斷。
3.3 蛋白質甲基化分析
細胞經處理後，以細胞溶解液瓦解細胞，收集總細胞溶解物(whole cell lysate)並以離心方 式去除細胞殘渣，以BSA為標準定量總細胞溶解物之蛋白質濃度，小量分裝後冷凍等待分析。
蛋白質甲基化利用抗賴氨酸(lysine)甲基化及抗精氨酸(arginine)抗體之西方轉漬方法進行測量。
蛋白質甲基化之圖譜分析則利用抗賴氨酸甲基化及抗精氨酸抗體之二維西方轉漬方法進行測 量。進一步確認特定蛋白質甲基化，將採用免疫沉澱方法，先把NDMA甲基化的蛋白質以抗賴 氨酸抗體及蛋白質G凝膠球(protein A bead)沉澱分離，經二維電泳後，再以特定蛋白質之抗體(抗
83
GRP75及抗vimentin抗體)進行測量。
3.4統計分析
各組詴驗所得數據以帄均值加減標準偏差 (Mean ± SD) 方式表示；詴驗統計分析採用 Microsoft Office Excel 2010 電腻統計套裝軟體中的 Student’s t-test 進行統計分析，並以 P＜0.05 作為詴驗數據間是否達到顯著性差異之標準檢測。
(四) 結果
4.1 N-亞硝基二甲胺之細胞毒殺性及基因毒性
人類臍靜脈内皮 EA.hy926 细胞 EA.hy926 及人類正常肝細胞 WRL-68，分別處理 0、1、5 mM N-亞硝基二甲胺(NDMA)24 小時或 48 小時，都不會明顯造成細胞增生抑制，進而降低其 細胞數目，其活細胞比例相對於未加藥對照組均在 90%以上(圖一)。以慧星分析測量 NDMA 在 EA.hy926 及 WRL-68 細胞之基因毒性，結果卻發現 NDMA 處理造成極為明顯的 DNA 傷害，
在低濃度(< 0.01 mM)即可造成強烈的細胞核 DNA 傷害數值(Tail Moment)(圖二)，其作用敏感 性至少是細胞毒殺性的 500 倍以上，此種低細胞毒性-高遺傳毒性特色與 NDMA 已知的強烈致 癌性是相互吻合的。另外，這種作用特色在人類臍靜脈内皮 EA.hy926 细胞 及人類肝細胞均極 為相似，間接說明 NDMA 在細胞中的代謝活化機制，可能普遍性的存在不同型態細胞中，至 少在血管內皮細胞及肝細胞都明顯存在此一活化系統。先前研究報告指出 NDMA 在人類細胞 中主要是被細胞色素 P450 酵素(CYP2E1 及 CYP2A6)活化形成烷化物(Kusida et al., 2000)。在 人類臍靜脈内皮 EA.hy926 细胞 (HUVEC)中也被偵測到有恆常性表達多種細胞色素 P450 酵素，
包括 CYP1A1、CYP1A2、CYP2E1 及 CYP3A，這些酵素對循環性毒物前體的代謝命運的決定 具有重要的角色(Farin et al., 1994)。綜合上述數據對 NDMA 在人體中之代謝及毒性的轉變過程，
提供重要運作模型的解釋：NDMA 被吸收進入血流，在血管內皮細胞可進行明顯的代謝活化，
造成血管內皮細胞的損傷，運行至肝臟將再次進行代謝活化，甚至累加性(additive)造成肝細胞 損傷，最終造成肝癌的形成。肝細胞中 CYP450 酵素的表現，包括 CYP2E1 及 CYP2A6 都可能因 特定毒物的曝露而增加其表現量，如乙醇及尼古丁(Rahnasto-Rilla, 2012; Yongvanit et al., 2012)，
也支持我們上述所提出的解釋模型。進一步了解 CYP2E1 及 CYP2A6 在 NDMA 造成人類臍靜 脈内皮 EA.hy926 细胞 及肝細胞遺傳毒性的角色，仍需進一步詴驗來加以證明。
84
圖一、N-亞硝基二甲胺在人類血管內皮及人類正常肝細胞所造成的細胞毒殺性。人 類臍靜脈内皮 EA.hy926 细胞 (EA.hy926)及人類正常肝細胞(WRL-68)v 細胞，分別 處理不同濃度 N-亞硝基二甲胺(N-Nitrosodimethylamine, NDMA) 24 小時，細胞毒殺 性以結晶紫染色法進行測量。將對照組之數值設為 100%。數據為三次詴驗帄均值 ± 標準機差。
圖二、N-亞硝基二甲胺在人類血管內皮及人類正常肝細胞所造成的遺傳毒性。人類 臍靜脈内皮 EA.hy926 细胞 (EA.hy926)及人類正常肝細胞(WRL-68)，分別處理不同 濃度二甲基亞硝胺(N-Nitrosodimethylamine, NDMA)24 小時，細胞遺傳毒性以慧星分 析方法進行測量。數據為三次詴驗帄均值 ± 標準機差。
4.2 二甲基亞硝胺在人類內皮細胞造成之蛋白甲基化
以不同濃度 NDMA (0、1 mM、5 mM)分別處理細胞 24 小時，以對抗非對稱型二甲基精胺 酸(asymmetrica arginine dimethylation)抗體，測量細胞內蛋白質甲基化在一維 SDS-PAGE 之圖 譜，結果發現 NDMA 處理在分子量 32 kDa 蛋白質處有明顯的甲基化訊號，而且隨 NDMA 處