(一) 前言
食物中原本就自然存有微量的 N-nitrosamines，但食物中的 N-nitrosamines 主要因人為加工 而大量產生，例如啤酒、醃漬肉品、起司加工品及魚等[Tricker et al., 1991]。尤其是醃漬或加
一般自然界原水中幾乎不含 N-nitrosamines，但原水經由消毒後，飲用水中可發現 NDMA 顯著 升高，最高可測出 65 ng/L (美國飲用水 NDMA 標準為 10 ng/L) [Nawrocki and Andrzejewski, 2011]。飲水在生活中不可或缺且食品製程皆會使用到飲水，飲用水中 N-nitrosamines 的暴露 貢獻也應考量。
雖然食物中的 N-nitrosamines 種類很多，1970 年至今有不少報導食物中 N-nitrosamines 濃 度的文獻，但常只有 NDMA、NDEA、NPyr 及 NPip 被納入分析，主要的原因是直到現在食 品 N-nitrosamines 的分析方法依然沒有進步[Crew, 2010]。目前國際上食品中的 N-nitrosamines 的分析方法以氣相層析熱能分析儀 (GC-TEA) 及氣相層析質譜儀 (GC-MS) 為主，這些分析 方法常遭遇特異性及靈敏度不足、前處理複雜及分析時間過長等問題。
亞硝胺的暴露來源可分為外在暴露及體內生成暴露。外在暴露除了目前已知的食物中
N-nitrosamines 外 ， 香 菸 煙 霧 、 化 妝 品 及 職 業 場 所 ( 如 橡 膠 製 程 ) 等 也 會 帶 來 外 因 性 N-nitrosamines 暴露。體中內生性 N-nitrosamines 暴露係由於人類經由食物及飲用水暴露到硝酸
鹽或亞硝酸鹽，它們進入人體後可與體內胺類作用生成 N-nitrosamines。因此量測人體內 (如 尿液或血液) 的 N-nitrosamines，所代表的是外在暴露及體內生成 N-nitrosamines 的總合。特別 是以非侵入性的方法 (尿液) 評估 N-nitrosamines 在體內的劑量，對於 N-nitrosamines 的暴露及 健康風險評估有很大的幫助。(二) 研究目的
本子計畫將運用”連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀”開發食物中亞硝胺快速分析法，應 用在各式代表性食品的 N-nitrosamines 分析，研究結果將可提供相關單位作為管制標準制定的 重要參考。同時本研究也將建立一套「on-line SPE LC-MS/MS」分析系統，搭配手動固相萃取 (off-line SPE) ， 以 量 測 尿 液 中 的 亞 硝 胺 。 藉 由 此 生 物 偵 測 工 具 可 逐 年 觀 察 國 人 體 內
N-nitrosamines 濃度的改變，作為政府單位在管制食品 N-nitrosamines 或其前驅物 (硝酸鹽或亞
硝酸鹽) 成效的直接證據。30
(三) 研究方法
(1) 建立 on-line SPE LC-MS/MS 分析食品 N-nitrosamines:
下表為 9 種亞硝胺在 MS/MS 的最佳化偵測條件。
表一、Tandem mass spectrometry parameters for the nine N-nitrosamines
31
由於 9 種亞硝胺在不同的游離源下各自的敏感度不同(如表二)。表三及表四分別為大氣壓 力化學離子化法(atmospheric pressure chemical ionisation, APCI)及電灑離子化法(electrospray ionization, ESI)於 on-line SPE LC 的層析條件。NDMA、NMEA、NPyr 及 NMor 在 APCI 下有 較佳的敏感度。而 NDPA、NDBA 和 NDPhA 在 ESI 下有較佳的敏感度。NDPhA 因熱不穩定 在 APCI 中易裂解難以偵測此外 NDEA 和 NPip 在兩種離子源感度差異不大，但分析中發現 NDEA 和 NPip 在 APCI 離子源下食品基質干擾嚴重，所以 NDEA 和 NPip 未來分析皆在 ESI 離子源下。圖一及圖二分別是 9 種亞硝胺標準品在 APCI 及 ESI 的游離源下的層析圖譜。
表二、9 種亞硝胺在 APCI 與 ESI 離子源下偵測極限 (LOD) 比較
Compound APCI ESI
LOD (ng/mL) LOD (ng/mL)
NDMA 0.32 6.51
NMEA 0.27 1.36
NPyr 0.41 1.13
NMor 0.02 0.39
NDEA 0.39 0.93
NPip 0.71 0.89
NDPA 0.29 0.17
NDBA 0.13 0.04
NDPhA ND 0.007
32
表三、Column-switching programming and the gradients for both online SPE cleanup and LC separation for the APCI source
Eluent I (trap column) Eluent II(analytical column) Time
a 5% (v/v) acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid.
b 75% (v/v) acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid.
c 10% (v/v) acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid.
d 80% (v/v) acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid.
33
表四、Column-switching programming and the gradients for both online SPE cleanup and LC separation for the ESI source
Eluent I (trap column) Eluent II (analytical column) Time
a 5% (v/v) methanol containing 1 mM (v/v) ammonium acetate.
b 75% (v/v) methanol containing 1 mM (v/v) ammonium acetate.
c 10% (v/v) methanol containing 1 mM (v/v) ammonium acetate.
d 80% (v/v) methanol containing 1 mM (v/v) ammonium acetate.
34
圖一、Online SPE LC-APCI-MS/MS chromatograms of nine N-nitrosamines and their isotope internal standards from a calibration standard
6.1
35
圖二、 Online SPE LC-ESI-MS/MS chromatograms of nine N-nitrosamines and their isotope internal standards from a calibration standard
6.2
36 NaCl (20 g/100 mL) 溶液充分混合，以 ChemElut column (20 mL, Agilent technologies Inc.) 進
將啤酒（或黑麥汁）倒入燒杯中靜置於 4°C冰箱
37
行吸附萃取，最後使用二氯甲烷沖提待測物，沖提液經氮氣吹拂濃縮，以 on-line SPE LC-MS/MS 進行分析。
圖四、固態樣本前處理程序
(四) 結果與討論
(1) 以 on-line SPE LC-MS/MS 搭配同位素稀釋法同時分析啤酒中 9 種亞硝胺: 由於麥芽飲品 (如啤酒及黑麥汁) 是國人廣泛飲用的飲料而醬油是國人日常生活使用频率極高的調味品。
我們因此選擇啤酒、黑麥汁及醬油作為首要液體食品亞硝胺分析對象。初步檢驗結果發現 15 種市售品牌啤酒皆檢測出 NDMA，其濃度也最高 (0.248-0.559 ng/mL)。檢出率其次為 NDPhA (檢出率:80%; ND-0.026 ng/mL)、NPYR (檢出率:60%; ND-0.263 ng/mL) 及 NDEA (檢出率:53%; ND-0.396 ng/mL)。其他亞硝胺如 NMEA、NPip、NMor、NDPA 及 NDBA 則皆未檢出 (低於 LODs)。9 種亞硝胺檢測結果整理如下表五。圖五為典型的啤酒亞硝胺 on-line SPE LC-MS/MS 層析圖譜檢測出 NDMA 及 NDPhA 為例。
表五、15 種市售啤酒亞硝胺含量 (ng/mL)
Source/Sample NDMA NPyr NDEA NDPhA Taiwan B1 0.364 0.263 0.104 0.006
B2 0.32 ND ND 0.006
B3 0.344 0.094 ND 0.013 China B4 0.484 ND 0.106 0.006
以食物均質機將樣本切碎並均質化
稱取 10 g 樣本加入 20 µL 同位素內標準品
加入 10 mL 0.1 N NaOH，在室溫下以超音波震盪處理 5 分鐘 再加入 20 mL 甲醇，將樣本放置培養箱中震盪萃取 60 分鐘
樣本離心後以預先用甲醇 (5 mL) 清洗過的玻璃微纖維濾紙過濾
取 15 mL 濾液加入 5 mL NaCl (20 g/100 mL) 均勻混合後，將樣本通過 ChemElut 萃取管柱
靜置吸附 20 分鐘後，以 40 mL 二氯甲烷沖提並收 集沖提液；以氮氣吹拂濃縮至 0.1 mL，等候分析
38
B5 0.403 ND 0.103 0.026
B6 0.248 ND ND 0.009
B7 0.419 ND 0.06 ND
Japan B8 0.409 0.259 0.073 0.011
B9 0.421 0.216 ND ND
B10 0.548 0.155 ND 0.014 Korea B11 0.3 0.085 0.396 0.011 Malaysia B12 0.507 ND 0.141 0.01
B13 0.448 0.23 ND 0.005 Netherlands B14 0.467 0.162 0.042 0.022 Belgium B15 0.559 0.195 ND ND
ND: Not detected
圖五、on-line SPE LC-MS/MS 檢測出啤酒含 NDMA、NDPhA
(2) 以 on-line SPE LC-MS/MS 搭配同位素稀釋法同時分析黑麥汁中 9 種亞硝胺: 5 種市售黑 麥汁 9 種亞硝胺檢測結果整理如下表六。檢驗結果發現 5 種市售品牌黑麥汁皆檢測出 NDMA (0.18-0.274 ng/mL)、NDBA (0.013-0.178 ng/mL) 及 NDPhA (0.035-0.358 ng/mL)。
39
其次為 NMEA 及 NPyr (檢出率:20%)。其他亞硝胺如 NDEA、NPip、NMor 及 NDPA 則皆 未檢出。圖六為典型的黑麥汁亞硝胺 on-line SPE LC-MS/MS 層析圖譜檢測出 NDMA、
NDBA 及 NDPhA。
表六、5 種市售黑麥汁亞硝胺含量 (ng/mL)
Source/Sample NDMA NMEA NPyr NDBA NDPhA Taiwan M1 0.18 ND ND 0.014 0.035
M2 0.226 ND ND 0.013 0.039 M3 0.274 ND ND 0.026 0.049 Germany M4 0.195 ND 0.139 0.178 0.358 Netherlands M5 0.217 0.004 ND 0.028 0.086
ND: Not detected
圖六、on-line SPE LC-MS/MS 檢測出黑麥汁含 NDMA、NDBA 及 NDPhA
40
(3) 以 on-line SPE LC-MS/MS 搭配同位素稀釋法同時分析醬油中 9 種亞硝胺: 4 種市售醬油 9 種亞硝胺檢測結果整理如下表七。不論是純釀造醬油或化學醬油皆無檢測出 NDMA、NPip、
NMor 及 NDPA 。 但 所 選 的 市 售 醬 油 皆 驗 出 NDBA (0.01-0.197 ng/mL) 及 NDPhA (0.05-0.222 ng/mL)。圖七為典型純釀造醬油亞硝胺 on-line SPE LC-MS/MS 層析圖譜檢測 出 NDBA 及 NDPhA。
表七、市售醬油亞硝胺含量 (ng/mL)
Sample NMEA NPyr NDEA NDBA NDPhA 純釀造醬油 S1 0.029 0.512 ND 0.197 0.222 純釀造醬油 S2 ND ND 0.642 0.072 0.170 化學醬油 S3 0.016 ND ND 0.010 0.087 化學醬油 S4 ND 0.787 0.192 0.167 0.050 ND: Not detected
圖七、on-line SPE LC-MS/MS 檢測出醬油含 NDBA 及 NDPhA
41
(4) 以 on-line SPE LC-MS/MS 搭配同位素稀釋法同時分析肉類及魚類製品中 9 種亞硝胺:肉 類及魚類熟食製品隨機購自傳統市場、早餐店及超市共 22 個樣本。以圖八為例，火腿經 前處理後以 on-line SPE LC-MS/MS 可檢驗出 NDMA, NPyr, NPIP, NDPA, NDBA。如表八 所示，魚肉類中以 NDMA 及 NDBA 檢出率最高，其次為 NPyr 及 NMor，NPip、NDPA 及 NDPhA 有少數檢出，其他亞硝胺 NDEA 及 NMEA 則皆未檢出。火腿在 9 種亞硝胺的 檢出率最高，其中 NPyr 及 NPip 可能來自於辛香料的添加，例如辣椒及胡椒含有 pyrrolidine 及 piperidine 在與肉類中的亞硝酸鹽在加熱過程中反應生成 NPyr 及 NPip (Herrmann et al., 2015)。此外我們以測詴詴紙檢測發現 22 個樣本中有 4 個樣本 nitrite 超標 (> 70 mg/kg)。
Intensity, cps NDPA-d14
145→97
Intensity, cps NPip-d10
125→78
Intensity, cps NPyr-d8
109→62
Intensity, cps NDMA-d6
81→46
42
表八、魚肉類製品中亞硝胺分析結果
樣本名稱 來源 濃度 (g/kg)
亞硝酸鹽超標 NDMA NPyr NMor NPip NDPA NDBA NDPhA
香腸 1 (Sausage 1) ×國市場 0.07 ND ND ND ND 2.44 0.06
−
香腸 2 (Sausage 2) ×國市場 ND ND ND ND ND 1.43 0.09
−
香腸 3 (Sausage 3) ××醫學大學學生餐廳 0.19 ND ND ND ND 1.72 0.02
−
火腿 1 (Ham 1) ×爺早餐店 1.24 1.35 ND 6.03 0.11 1.84 ND
+
火腿 2 (Ham 2) 早餐× 0.25 2.59 0.38 ND 0.15 1.79 ND
+
培根 1 (Bacon 1) ×爺早餐店 0.31 1.12 ND ND ND 5.42 ND
+
培根 2 (Bacon 2) 早餐× 0.09 3.80 0.49 ND ND 3.22 ND
−
臘腸 1 (Pepperoni 1) ×國市場 1.48 ND ND ND ND 2.06 ND
−
臘腸 2 (Pepperoni 2) ×國市場 0.59 ND ND ND ND 2.40 ND
−
熱狗 1 (Hot dog 1) ×爺早餐店 0.50 ND 0.04 ND ND 1.58 ND
−
熱狗 2 (Hot dog 2) 早餐× ND ND 0.06 ND ND 1.55 ND
+
熱狗 3 (Hot dog 3) ×家便利商店 ND 0.48 0.13 ND ND 1.25 ND
−
煙燻鮭魚 (Smoked salmon) ×青超市 0.41 ND ND ND 0.16 1.70 0.08
−
亞硝酸鹽測詴詴紙：Medi-Test URYXXON® Stick 10 (+)：高於 TFDA 限制濃度 (70 mg/kg)
(−)：低於 TFDA 限制濃度 (70 mg/kg)
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表八續、魚肉類製品中亞硝胺分析結果
樣本名稱 來源 濃度 (g/kg)
亞硝酸鹽超標 NDMA NMor NPip NDPA NDBA NDPhA
生豬肉 ×國市場 0.32 0.06 1.35 ND 1.72 0.02
−
鯛魚排 裕×屋 0.40 ND ND ND 1.33 ND
−
烤秓刀魚 裕×屋 0.25 0.03 ND ND 1.74 ND
−
燒女子小魚 裕×屋 1.19 ND ND ND 1.50 ND
−
草魚乾 ×國市場 ND ND ND ND 3.14 ND
−
四破魚乾 裕×屋 0.17 ND ND ND 2.14 ND
−
海鰻魚乾 ×國市場 ND ND ND ND 2.56 ND
−
沙丁魚 ×國市場 0.56 0.02 ND ND 1.81 ND
−
烏魚子 漁市場 ND ND ND ND 3.47 ND
−
*亞硝酸鹽測詴詴紙：Medi-Test URYXXON® Stick 10 (+)：高於 TFDA 限制濃度 (70 mg/kg)
(−)：低於 TFDA 限制濃度 (70 mg/kg)
*ND: Not detected
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(5) 以 on-line SPE LC-MS/MS 搭配同位素稀釋法同時分析人體尿液中 9 種亞硝胺:
為了解一般國人尿液中亞硝胺濃度分布情形，我們收集健康成人共 112 人，包含吸菸者 55 人及非吸菸者 57 人。尿液樣本經手動固相萃取純化濃縮後以 on-line SPE LC-MS/MS 分析。結果如下表九所示， 9 種亞硝胺以 NDMA 及 NDPhA 檢出率最高(~100%)，其次為 NDEA、NPYR、NDBA 及 NMEA。過去研究從未量測 NDPhA，本研究首次在尿液中檢 驗出 NDPhA 且檢出率達 100%。NDPhA 在國際癌症研究署(IARC)被歸類是 goup 3 (證據 有限無法認定是致癌物)，但在 US EPA 被認定是疑似致癌物(probable human carcinogen) [US EPA, 1986]。本研究 NDPhA 的量測結果值得進一步追蹤。
9 種亞硝胺尿液帄均濃度最高的則是 NDMA (0.55-0.58 ng/mL)，其次為 NPYR (0.27-0.3 ng/mL)、NDEA (0.12-0.14 ng/mL)。NMEA、NPIP、NDBA 及 NDPhA 帄均濃度皆小於 0.1 ng/mL。先前研究指出菸草及香菸煙流中含有 NDMA、NMEA、NPIP 及 NPYR [Adams et al., 1987]，但我們研究發現吸菸者與非吸菸者尿液中 9 種亞硝胺並無顯著不同。其可能原 因是吸入的亞硝胺有高達 30%會被呼出，而其餘的亞硝胺進入體內後會快速地被代謝。只 有非常少的部分會以亞硝胺原態排入尿液[Streeter et al., 1990]。此外各品牌香菸所含的亞 硝胺含量都不同(4.1-31.1 ng/cigarette，Adams et al. 1987)也可能影響結果。本研究成果已 發在知名期刊 Journal of Hazardous Materials [Hu et al., 2016]
表九、人體尿液中 9 種亞硝胺濃度 Healthy subjects: smokers
(n = 55)
Healthy subjects: non-smokers (n = 57) ND, not detectable; NM, not measured. aNumbers of samples with detectable concentrations.
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(6) 探討小鼠口服暴露亞硝胺後經尿液的排出量:
為了探討食入暴露亞硝胺後在尿液中的排出量，我們將 ICR 品系雄性小鼠施予 10 mg/kg bw 的 NDMA 劑量，並收集 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60 及 72 小時的尿液(下圖九)。以 on-line SPE LC-MS/MS 分析尿液中 NDMA，可發現暴露 NDMA 的 6 小時內就完全排出體外(下圖十)。
與原始的 NDMA 餵食劑量比較，尿液中的 NDMA 排出量僅占 0.02%；亦即絕大部分 (99.98%)的 NDMA 在體內被代謝或以其他途徑排出體外。
圖九、小鼠餵食 NDMA 後於不同時間點收集尿液(n=4)
圖十、小鼠餵食 NDMA 後在不同時間點尿液中的 NDMA 排出量變化
接著本研究進一步將 ICR 小鼠施予各種不同的亞硝胺，以觀察尿液中的亞硝胺排出 量佔餵食劑量的比例。如下圖十所示，我們將小鼠餵食 NDMA 高低劑量、NDEA、NMor、
NMEA 及 NDPA 並於 24 小後收集尿液以 on-line SPE LC-MS/MS 分析。結果顯示餵食各 種亞硝胺後，24 小時的尿液中可測出相對應的亞硝胺，如下圖十一所示。與原始的各種
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NDMA(L) NDMA(H) NDEA NMEA NMOR NDPA
NDMA(L) NDMA(H) NDEA NMEA NMOR NDPA