七、、、、Rhodamine 123/calcein-AM 螢光染劑法螢光染劑法螢光染劑法螢光染劑法 (MDR1/MRP1 functional assay) MDR1 本身並不會發出螢光，但其進入細胞後被細胞內 esterase 作用變成 calcein 才方為 MRP1 的受質，且可發出螢光被偵測。
以冰冷的 PBS 沖洗細胞，並用 trypsin 將細胞收集下來、離心、打散，最後裝
入 falcon 上機專用的試管中。
以 FL1 的 channel 接受 calcein 所發出的波長的螢光，並記錄其螢光強度，比 較有無加入 MK571 的組別螢光強度的變化[53, 54]。
2.5 統計檢定統計檢定統計檢定統計檢定
本研究的數據接假設為遵守常態分布，以 Office 2010 軟體 Excel 做變異數分 析，來檢定各組數據的差異性，並用學生氏 t 檢定(Student’s t-test)進行全組數據的 比較及兩兩組別的差異分析。以*表示 p value <0.05，認定數據間有顯著差異。圖 表上數值由平均數(mean) ±標準差(standard deviation)表示。
第三章
(0.145 µM)、MCF-7/ADR-8 (0.170 µM)、MCF-7/ADR-16 (0.215 µM)、MCF-7/ADR-32
(0.275 µM)、MCF-7/ADR-64 (0.366 µM)、MCF-7/ADR-128 (0.388 µM)、MCF-7/ADR-256
(0.575 µM)、MCF-7/ADR-512 (1.72 µM)、MCF-7/ADR-1024 (10.3 µM)(表 1)。
3.2 各種抗藥性細胞之型態變化各種抗藥性細胞之型態變化各種抗藥性細胞之型態變化各種抗藥性細胞之型態變化
將 各 種 不 同 MCF-7 細 胞 株 型 態 以 影 像 記 錄 下 來 ， 可 發 現 幾 個 特 點 ： MCF-7/Wild-Type 細胞間連結較緊密，形狀較寬短，當細胞數目眾多而擁擠時，細 胞與細胞間會產生堆疊現象，而 MCF-7/ADR-1、MCF-7/ADR-2、MCF-7/ADR-4、 MCF-7/ADR-8、MCF-7/ADR-16、MCF-7/ADR-32、MCF-7/ADR-64、MCF-7/ADR-128、 MCF-7/ADR-256 這 幾 株 細 胞 在 外 型 上 並 沒 有 與 MCF-7/WT 有 太 大 差 異 。 從
MCF-7/ADR-512 開始細胞外型開始有些微變化，細胞形狀拉長，且細胞間間隔較疏
鬆，堆疊的現象也減少。到了 MCF-7/ADR-1024細胞時，其外型與 MCF-7/ADR 相 似，形狀較長分支較多，細胞間不堆疊且在顯微鏡下觀看可發現其較透光，與培 養皿底部貼附較緊。由形狀來判斷，MCF-7/ADR-1024幾乎可說與 MCF-7/ADR 相 同，但仍需更進一步在基因表現型態的分析與比較才能確認此兩種細胞的異同(圖 1)。
3.3 移除移除移除移除 Doxorubicin 512 nM 時時時，時，，MCF-7/ADR， -512之外型之變化之外型之變化 之外型之變化之外型之變化
在培養細胞之過程中，發現只有 MCF-7/ADR-512 在加藥與未加藥的情況下會
有不同的細胞外觀。在加藥時，MCF-7/ADR-512細胞邊界較清晰，外型較健康、完 整；將藥物移除後，細胞邊界消失成雲朵狀，無法判斷外型，且此時細胞開始有 些許的死亡，生長情況變差，而其他株 MCF-7 抗藥性細胞並沒有這種情形。以 MCF-7/ADR-512前後兩株細胞 MCF-7/ADR-256及 MCF-7/ADR-1024做對照，這兩株 細胞在加藥時或不加藥的狀態下，細胞外觀與生長情況並不會有所改變(圖 2)。 doxorubicin 有抗藥性。以 RT-PCR 及西方點墨法得到的結果發現，MDR1 mRNA 及 其 蛋 白 一 直 到 MCF-7/ADR-1024 細 胞 時 才 有 大 量 表 現 ， 在 此 之 前 甚 至 連 MCF-7/ADR-512都沒偵測到 MDR1 mRNA 之訊號。此結果顯示 MCF-7/ADR-1024才 算是真正的 MCF-7/ADR 細胞，為 doxorubicin 篩選 MCF-7/WT 細胞之終點(圖 3)。
3.5 以以以以 Real-time PCR 及西方點墨法及西方點墨法及西方點墨法及西方點墨法分析分析分析 MDR1 之外的分析 之外的之外的之外的 ABC transporter MRP1 mRNA 及蛋白及蛋白及蛋白及蛋白之表現變化情況之表現變化情況之表現變化情況之表現變化情況
根據文獻，雖然在 MCF-7/WT 及 MCF-7/ADR 中的 MRP1 mRNA 及蛋白量都 相當少，但以 Real-time PCR 精確分析後發現在 MCF-7/ADR-32、MCF-7/ADR-64、 MCF-7/ADR-128、MCF-7/ADR-256、MCF-7/ADR-512中 MRP1 的 mRNA 表現量都有 明顯的增加，其增加的倍數(與 MCF-7/WT 相比)分別是：MCF-7/ADR-32 為 95 倍、
MCF-7/ADR-64 為 234 倍、MCF-7/ADR-128 為 777 倍、MCF-7/ADR-256 為 2132 倍、
MCF-7/ADR-512 為 140 倍。MRP1 mRNA 表現量在 MCF-7/ADR-1024細胞中又降至 僅有 MCF-7/WT 的 2 倍，而 MCF-7/ADR 也只有 MCF-7/WT 的 12 倍。特別值得注 意的是，作為正向控制組的 MCF-7/VP 細胞，在過去的文獻中指出其為對 etoposide (VP-16)具抗藥性的 MCF-7 細胞，表現大量的 MRP1 運輸蛋白，在此圖中其 MRP1
mRNA 表現量為 MCF-7/WT 的 64 倍，遠低於 MCF-7/ADR-256的 2132 倍(圖 4)。
在測定 MDR1 運輸蛋白的功能方面，使用 rhodamine123 作為螢光染劑，其為 MDR1 的受質，可經由細胞膜擴散進入細胞內，再被 MDR1 運輸出細胞外。加入 20 µL 的 MDR1 抑制劑 verapamil 可使 rhodamine 留在細胞中。因此若是有表現 MDR1 的細胞， 以流 式細胞儀 可偵測到 有 加入 verapamil 的組 別，其細 胞中 rhodamine 訊號會比其未加 verapamil 時強。結果發現在 MCF-7/WT、MCF-7/ADR-512
兩株細胞中，有無加入 verapamil 似乎都不影響 rhodamine 在細胞中的殘留量(圖 5A 及 5B)；而在 MCF-7/ADR-1024及 MCF-7/ADR 中，有加 verapamil 的組別其細胞中 rhodamine 的量均比未加 verapamil 高(圖 5C 及 5D)，顯示這兩株細胞有表現 MDR1，且其表現的 MDR1 有運輸功能。在測定 MRP1 運輸蛋白的功能方面，使 用 calcein-AM 作為螢光染劑，calcein-AM 進入細胞內後，被細胞中的 esterase 作 用完轉變為可發螢光之 calcein，且 calcein 為 MRP1 的受質，可被 MRP1 運輸至細 MCF-7/ADR-512、MCF-7/ADR-1024 細胞中的 MRP1 表現量相當少，因此在加入 MK571 後，細胞內螢光值比各自未加 MK571 時變高了約 1.6 倍(MCF-7/ADR-512 )
及 1.7 倍(MCF-7/ADR-1024 )(圖 6D 及 6E)。作為正向控制組的 MCF-7/VP 細胞也與 結果中看到隨著對 doxorubicin 的抗藥性程度越高，Bcl-2 的 mRNA 表現量也逐漸 降低，至 MCF-7/ADR-1024細胞時表現量只有 MCF-7/WT 的 0.1 倍。c-FLIP mRNA 隨著 MCF-7 細胞對 doxorubicin 的抗藥性程度越高，BRCA1/2 的表現有降低的趨 勢，在 MCF-7/ADR-1024及 MCF-7/ADR 中的 BRCA1/2 幾乎沒有 mRNA 的表現。
另外，同樣為腫瘤抑制基因的 p53 蛋白擁有多種功能，其中一項也是可調控 DNA 損傷的修補，但有研究指出在 MCF-7/ADR 中的總 p53 表現量比 MCF-7/WT 高，且在 ADR 細胞中的 p53 有 21 缺失的突變(codon 126-133 at exon 5)。在圖 9 可
看到在隨著 MCF-7 細胞對 doxorubicin 的抗藥性程度變高的過程中，野生型 p53 的 mRNA 表現量在 MCF-7/ADR-1024及 MCF-7/ADR 中大量減少，且具 21 bp deletion 的突變型 p53 在 MCF-7/WT 中原本相當少量，在 MCF-7/ADR-16至 MCF-7/ADR-256 等的 E-cadhrin RNA。N-cadherin、vimentin 也是在 MCF-7/ADR-1024細胞中才大量 表現，MCF-7/ADR-1024之前的細胞雖然有些有 N-cadherin、Vimentin 的基因表現但
量並不多。轉錄因子 Snail 的 mRNA 表現量在隨著 MCF-7 細胞對 doxorubicin 的抗 藥性程度越高的過程中並沒有太大的改變，但轉錄因子 ZEB1、ZEB2、Twist1、Slug 等 轉 錄 因 子 的 mRNA 在 MCF-7/ADR-1024 之 前 表 現 量 都 相 當 少 ， 直 到 MCF-7/ADR-1024才有上升的趨勢(圖 13)。
3.11 以以以以 RT-PCR 分析分析分析分析 ABC 轉運蛋白轉運蛋白轉運蛋白轉運蛋白 BCRP 之之之之 mRNA 在不同抗藥性程度的在不同抗藥性程度的在不同抗藥性程度的在不同抗藥性程度的 MCF-7 中之表現量中之表現量中之表現量中之表現量
雖然 BCRP 也常為造成癌細胞具有抗藥性的原因之一，但在本篇實驗中發現 BRCP 的 mRNA 表現量在隨著 MCF-7 細胞對 doxorubicin 的抗藥性程度越高的過 程中並沒有太大的改變(圖 14)。
3.12 以以以以 RT-PCR 分析促進細胞增生轉錄因子分析促進細胞增生轉錄因子分析促進細胞增生轉錄因子分析促進細胞增生轉錄因子 ER-α 及蛋白激酶及蛋白激酶及蛋白激酶 PKCα 之及蛋白激酶 之之之 mRNA 在在在在 不同抗藥性程度的
不同抗藥性程度的 不同抗藥性程度的
不同抗藥性程度的 MCF-7 中之表現量中之表現量中之表現量 中之表現量
先前文獻指出 MCF-7/WT 為 ER-α positive 細胞，而 MCF-7/ADR 為 ER-α negative 細胞，但 ER-α 的 mRNA 表現量在隨著 MCF-7 細胞對 doxorubicin 的抗藥 性程度越高的過程中直到 MCF-7/ADR-1024才大量減少至幾乎不表現，與 ADR 細胞 一樣變成 ER-α negative (圖 15)。PKCα 之 mRNA 及蛋白被報導過在有抗藥性的細 胞中會有較高的表現，實驗中，PKCα mRNA 表現量從 MCF-7/ADR-16開始有逐漸 上升的趨勢，到了 MCF-7/ADR-1024及 MCF-7/ADR 時分別為 MCF-7/WT 的 1.4 及 1.5 倍左右。
第四章
胞，在強大的藥物壓力下篩選出表現 MDR1 且對 doxorubicin 有抗藥性的細胞[51]，較近的研究則有人以較低的 doxorubicin 濃度(低於 MCF-7/WT 的 IC50)持續刺激 MCF-7 細胞，得到較低程度抗藥性且沒有表現 MDR1 的細胞[55]。也有研究先以 低濃度( 10 nM) doxorubicin 作為刺激 MCF-7/WT 的起始濃度，待其生長穩定後再 增加藥物濃度，耗時約 31 個月，直到其篩選的細胞也表現 MDR1 為止[52]。但這 幾篇研究通常只分析最終表現 MDR1 的抗藥性細胞，或者有些只分析了在未表現 MDR1 前的較低程度抗 doxorubicin 細胞。因此本實驗室以 doxorubicin 篩選了一系 列 MCF-7 抗藥性細胞，將不同程度抗藥性由低至高的 MCF-7/ADR 細胞分別列出 來探討，分析當 MCF-7/WT 被 doxrubicin 刺激轉變為 MCF-7/ADR 的過程中，有 哪些基因的表現量產生變化，並推論除了 MDR1 的表現之外，尚有哪些基因可能 也參與多重抗藥性的發展。
一開始以 1 nM 之 doxorubicin 為起始濃度篩選 MCF-7/WT 細胞，每當細胞生 長穩定即增加兩倍濃度，得到了 MCF-7/ADR-1、MCF-7/ADR-2、MCF-7/ADR-4、 MCF-7/ADR-8、MCF-7/ADR-16、MCF-7/ADR-32、MCF-7/ADR-64、MCF-7/ADR-128、 MCF-7/ADR-256、MCF-7/ADR-512、MCF-7/ADR-1024共 11 種不同程度之 doxorubicin 抗藥性細胞。首先測定每種細胞之 IC50 值，以作為日後判別每一株細胞的依據。
在前面幾株低程度抗藥性細胞 MCF-7/ADR-1、MCF-7/ADR-2、MCF-7/ADR-4、 MCF-7/ADR-8 中之 IC50 並沒有與 MCF-7/WT 有太大變化，顯示這幾個濃度的 doxorubicin 對 MCF-7 細 胞 的 抗 藥 性 程 度 並 沒 有 太 大 的 影 響 及 篩 選 作 用 ， MCF-7/ADR-32開始至 MCF-7/ADR-256細胞的 IC50比 MCF-7/WT 上升了約 3-6 倍，
這個時期的細胞在加藥情況下達到穩定生長的所需時間變長，大約需要兩個月才
能正常增生；至 MCF-7/ADR-512的 IC50上升了 MC-/WT 的 10 倍(IC50為 1.72 µM)， EMT 相關基因的表現有相關性，上皮細胞的標記 E-cadherin 的抑制轉錄因子 ZEB1、ZEB2、Twist1、Slug 在 MCF-7/ADR-1024時 mRNA 表現量增加，使 E-cadherin mRNA 表現量減少許多，間質細胞標記 N-cadherin 及 vimentin 在 MCF-7/ADR1024
-時增加許多，因此由此推測 MCF-7/ADR-1024可能已變成與間質細胞類似的型態，
在培養細胞的過程中發現 MCF-7/ADR-512有特別的現象，在加 doxorubicin 512 nM 的狀態下其生長可以穩定，外型也漸轉變為類似 MCF-7/ADR 細胞。一旦把藥 物抽離後，從約第二天開始細胞的形狀開始改變，類似雲朵狀、細胞邊界無法辨 識，再過幾天則開始有飄浮的死亡細胞，對照 MCF-7/ADR-256 及 MCF-7/ADR-1024
細胞在加藥及未加藥時並沒有此變化，由此現象推測 MCF-7/ADR-512 細胞可能為 MCF-7/WT 轉變為 MCF-7/ADR 的過渡態不穩定時期，在此時期的細胞中可能有許 多基因表現正在改變，細胞顯得特別脆弱。
4.3 不同不同不同不同 ABC 運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義
4.3 不同不同不同不同 ABC 運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義運輸蛋白出現的時間點可能具有某些特殊意義