第三章 材料與方法
第二節 實驗一 材料方法
一、 氧化炸油的製備
將新鮮黃豆沙拉油（Soybean oil，簡稱 SB；統一大豆沙拉油，全程充氮未 添加維生素 A、D、E，三公升裝，統一食品公司）3 公升倒入口徑 40 cm，深 度 11 cm 的炒菜鍋（屬於鐵鍋，可加速油質的氧化）中，以瓦斯爐火加熱，利 用溫度計控制油溫維持在 205 ± 5 ℃，供油炸麵片。麵片製作原料為 1.5 公斤低 筋麵粉（日正優質低筋麵粉）、200 公克白砂糖（台糖精緻細砂）、5 公克發粉（日 正小蘇打粉）與 600 毫升水混勻，以攪拌器攪打成麵糰，再以桿麵棍桿成厚度 0.15 公分的麵皮，切割成長 10 公分、寬 4.5 公分的麵片，切開中間反摺成巧果 狀，再投入前述熱油鍋中，每次一片，油炸至麵片呈金黃色後取出，再換下一 片，炸過之麵片於網架上瀝乾油後丟棄。每天連續油炸六小時後熄火冷卻，隔 天再炸，連續四天，共油炸 24 小時，即得實驗炸油（Oxidized frying oil，簡稱 OFO），此炸油回收率約 65％。炸油冷卻後過濾殘渣，再將炸油分裝充氮氣，
置於 -20 ℃ 保存，供飼料配製以及炸油品質之測定。
第三章 材料與分法
二、 油脂品質分析
(一) 酸價 (Acid Value, AV)
1. 原理
中和 1 克油脂中游離脂肪酸所需氫氧化鉀的毫克數。
2. 方法
稱取適量之油脂樣品ω克(約5 g)，加入酒精及乙醚(1:1)混合劑20 mL，混 合均勻使油脂樣品完全溶解，再加入2~3滴的 phenolphthalein 指示劑，以 0.1 N 的 KOH 酒精溶液滴定至指示劑產生粉紅色並保持30秒為滴定終點。
3. 計算
AV【KOH (mg) /oil (g) 】= [56.108 ×(a – b) ×N ×F] /ω a：KOH 溶液消耗量(mL)
b：空白試驗
N：KOH 的當量濃度 F：KOH 溶液的力價
第三章 材料與分法
(二) 共軛雙烯測定
1. 原理
油脂氧化時，會產生 conjugated diene ，其在 233 nm 會有吸光； UV 233 nm 吸光值即代表產生 conjugated diene 的比例。
2. 方法
於定量瓶中精稱適量的油脂樣品ω克(約0.1 g)，以 n-hexane 稀釋至定量 V 毫升；以 n-hexane 作為 blank 對照，測溶液於233 nm 的吸光值，並掃描 200-400 nm 的吸光值變化。
3. 計算
A 233 (Abs. / g) = OD233 ×V/ω A：233 nm 吸光值
V：定量體積(mL) ω：油脂樣品稱取量(g)
第三章 材料與分法
三、 試驗飼料配製
實驗飼料的基本組成是依據 AIN-93 M 配方調製而成。飼料成份包括蔗糖
（Sucrose）、酪蛋白（Casein purified high＞85％ protein，MP Biomedicals）、
玉米澱粉（Corn starch，Seoul Korea）、纖維素（Alpha cellulose non-nutritive bulk）、 AIN-93 礦物質混合物、 AIN-93 M 維生素混合物、胱胺酸
（L-Cystine）、膽鹼（Choline bitartrate，41.1％ Choline）及抗氧化劑
tert-Butylhydroquinone（TBHQ）。將各種粉狀材料依照表 3-1 比例先行混合 均勻，再依配方比例分別拌入 4％新鮮黃豆油（LF）、20％新鮮黃豆油（HF）
或炸油（HO），飼料過篩後密封置於－20℃冷凍保存，以供動物飼養實驗。
由於高脂飼料所含高卡路里會降低小鼠攝食量，因此將其營養素成分（重 量百分率） 比例作適度調整，我們將高脂飼料中 Casein、Fiber、Vitamin mixture 及 Mineral mixture 的含量提高，使高脂與低脂飼料之營養素含量與 熱量比值相當（包含：蛋白質 / 熱量、維生素 / 熱量、礦物質 / 熱量、及纖 維素 / 熱量 比值）。
第三章 材料與分法
表 3-1 實驗一之小鼠實驗飼料組成
Table 3-1 Composition of test diets used in the feeding experiment
飼料組成
LF HF HO
g/ kg diet
Corn starch 620.692 414.692 414.692
Sucrose 100 100 100
Choline bitartrate（SIGMA） 2.5 2.5 2.5 tert-Butylhydroquinone（SIGMA） 0.008 0.008 0.008
Calorie density（kcal / g） 3.8 4.53 4.53 Protein / total calorie（ g / 100 kcal） 3.68 3.68 3.68 Vitamin / total calorie（ g / 100 kcal） 0.26 0.26 0.26 Mineral / total calorie（ g / 100 kcal） 0.92 0.92 0.92 Fiber / total calorie（ g / 100 kcal） 1.32 1.32 1.32
第三章 材料與分法
四、 動物飼養
實驗動物採用來自國家實驗動物中心 6 週齡（體重約 20 g） C57BL/ 6J 品 系的雄性小鼠。給予 Chow diet 餵食一週作為適應期後，依體重隨機分為三組：
LF、HF 及 HO ，依前述之方式分別餵食含 4％（LF）、20％ 新鮮黃豆油（HF）
及 20％ 炸油（HO）。
實驗動物在適應期及正式期，皆為將 2～3 隻小鼠飼養於一不鏽鋼細網籠 中。動物房溫度維持於 25±2 ℃，光照及黑暗各 12 小時（0800-2000 為光照期，
其餘為黑暗期）。飼料及飲水均充足供應使其能自由攝取，每週紀錄一次動物體
重，飼養九週後犧牲。
第三章 材料與分法
五、 口服葡萄糖耐受試驗（Oral glucose tolerance test, OGTT）
(一) 原理
給予 C57BL/6J 小鼠以口服餵食一定劑量之葡萄糖配製之糖水，進行 OGTT 期間檢測不同時間點之全血血糖值與禁食血清胰島素值，比較各組間全 血血糖值之變化情形與禁食血清胰島素值。若 OGTT 血糖上升與血糖變化之 曲線下面積增加可反映出週邊組織對葡萄糖產生耐受性不良。 OGTT 所檢測 之血清胰島素值通常比血糖值來的敏感，當血糖值無明顯差異時是因胰島素分 泌增加而能以平衡血液中之血糖值到正常範圍。若有胰島素不正常升高的現象 可視為胰島素敏感性降低及胰臟 β 細胞功能不良的證據。不過，胰臟 β 細胞功 能不良不一定都能藉由 OGTT 偵測出， OGTT 也可能誤判胰臟功能不良。因 此，可另作腹腔注射胰島素耐受測試（ITT）作比對。採血時間點為：0 分鐘（未 餵食葡萄糖）、餵食葡萄糖後之第 30、60、90、120 分鐘。
第三章 材料與分法
(二) 藥品配製
口服葡萄糖給予量
藥品 需要量（g） 最終濃度
D-(+)-Glucose Anhydrous Mixed anomers（Sigma）
27 1.5 M
加二次水 80 mL 加熱溶解，待溶液冷卻後定量至 100 mL，分裝至 50 mL 離心 管備用。
(三) 給予 mice 劑量
目標劑量 ＝ 1.5 g / kg body weight
因此每隻小鼠依照個別體重來給予 1.5 M 糖水。
Body weight（g）× 1.5 （mg / g Body weight）
＝ 1.5 M 糖水（μL）
0.27（mg / μL ）
第三章 材料與分法
(四) 方法
動物在給予試驗飼料八週時進行口服葡萄糖耐受測試，於採血前將老鼠禁 食 12-14 hr。在試驗當天進行眼窩採血，先採集 0 分鐘血液，給糖後，再採集 30、60、90、120 分鐘之血液，將採集好的血放於冰上，隨後以 4500 rpm
（centrifuge 5810, Eppendorf）之轉速，於 4℃下離心 15 分鐘，取出上層血清 分裝至新的 1.5 mL 離心管中，置於– 20 ℃冷凍保存，供日後分析禁食狀態下血 清中胰島素之用，血清葡萄糖濃度之測試需在當天 24 hr 內用市售試劑套組測 量。
六、 動物犧牲與樣品收集
實驗動物犧牲前予以禁食 12-14 hr，在犧牲當天先進行眼窩採血，隨即以乙 醚將動物迷昏後迅速取出胰臟、肝臟，秤重記錄後立即投入液態氮中，保存於 -80℃，供日後 RNA 之抽取及其他化學分析用。
七、 血糖分析
(一) 原理
Glucose + O2 + H2O2 GOD Gluconic acid + H2O2 2 H2O2 + 4-Aminophenazone POD Quinoneimine + 4 H2O
第三章 材料與分法
測定 Quinoneimine（紅紫色）在 500 nm 的吸光值。
(二) 方法
採用市售試劑組(RANDOX GL2623, Amtrim, UK)。取 4 μL Samples 或 Glucose standard (5.55 mmol/L )於 96 孔透明盤中，加入 200 μL 反應試劑(含 Phosphate buffer pH 7、MOPS buffer pH 7、4 - aminophenazone、Phenol、
Peroxidase、glucose oxidase)，混合均勻後，在室溫下反應 25 分鐘，以 4 μL 二次水加 200 μL 反應試劑做為 Blank，測定 500 nm 之吸光值，即可得樣品血 清之葡萄糖含量。
(三) 計算
A sample
Glucose conc. (mmol/L) ＝ --- × Standard 濃度 ( 5.55 mmol/L ) A standard
八、 禁食血清胰島素含量測定
(一) 原理
此商業套組（LINCO, Rat/Mouse insulin ELISA kit）為利用固態雙向免疫 酵素結合原理測定，利用兩個具專一性之單株抗體與胰島素分子上特定抗原結合
第三章 材料與分法
於反應槽中，再以 Buffer 清洗未結合之酵素標定抗體，以降低非專一性反應，
而後加入 Peroxidase 之受質 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine 反應呈色，最後以強 酸中止反應，讀取其吸光值（A450 nm）即可套入標準曲線換算出胰島素濃度。
(二) 方法
以二次水將 Wash buffer concentrate 製備成 Wash buffer。其它試劑市售套 組皆配好可直接使用。Well 中先以 300 μL 的 Wash buffer 清洗 3 次。加入 10 μL 的 Assay buffer 到 blank 和 sample 的 well 中，接著加入 10 μL Matrix soultion 到 Blank、Standard 和 Quality control 1、2 的 Well 中。將 10 μL 的 Standard、
Blank、Quality control 1、2、Sample 加入 Well 中，再加入 Detection antibody。
貼上膠膜於室溫下搖晃反應 2 小時。吸出 Well 中的溶液以 300 μL 的 Wash buffer 清洗 3 次。加入 100 μL 的 Enzyme soultion，貼上新的膠膜於室溫下搖晃反應 30 分鐘。吸出 Well 中的溶液以 300 μL 的 Wash buffer 清洗 6 次。加入 100 μL 的 Substrate solution（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine），於室溫下避光反應 15 分鐘。加入 100 μL 的 Stop solution(含 Hydrochloric acid solution)，慢慢地輕拍 plate 確定混合均勻(或放在 Microplate vortex 上混勻)。測量 450 nm 之吸光值(波 長校正設定 590 nm)，以標準曲線來換算 Sample 內 Insulin 濃度。
(三) 計算
將 Standard 的吸光值與濃度利用 ELISA reader（μQuant）中 4 - Parameter 之標準曲線方程式，求得 Standard curve，藉以換算出檢體之胰島素濃度。
第三章 材料與分法
九、 分離胰臟小島
(一) 方法
犧牲前將小鼠禁食，用乙醚迷昏小鼠後予以剖開，將膽管近十二指腸處用 動脈夾拑住，由膽管注入 2 ml 濃度為 1.2 mg/ml collagenase solution。
此處用動脈 夾夾住以免 collagenase 從此處流 失。
Collagenase 從此注入
第三章 材料與分法 Histopaque 上層，接著以 200 g、25 min.、室溫的條件離心，islets會分佈在兩 層溶液界面處，將交界處的溶液吸出至 15 毫升離心管，再用 HBSS 加至 15 ml
第三章 材料與分法
存，在 2 周內完成 insulin 測定。
十一、 Islet 總胰島素含量
將取得的 islet pellet 回溶於 75 μL acid/ethanol (0.18 M HCl in 70%
ethanol) 溶液中，在冰上以超音波震盪的方式震破，再以 10000 g、15 min.、4 ℃ 的條件離心，將上清液取出並計算其體積，立即放入- 80 ℃存放，以便日後測 定。待測量前再加入鹼(6 mM NaOH)中和(先前所算得體積可用來計算加入鹼中 和所需的量)，
相較於水萃法，酸萃取法測得小島內總胰島素含量較高，測定前 samples 須稀釋約 1 千倍左右，稀釋液用 insulin kit 內附之 Assay buffer。
十二、 抗氧化與過氧化物質測定
(一) 總抗氧化能力
1. 原理
此商業套組(Cayman, Antioxidant Assay Kit)的抗氧化分析可用來測定血 漿、血清、尿液、唾液或細胞分解液中的總抗氧化能力。此套組所測得結果為 結合水溶性及脂溶性物質之抗氧化能力，包括維生素、蛋白質、脂質、
第三章 材料與分法
ABTS•+ 的生成量可得知樣品的抗氧化能力（測定波長 750 nm 或 405 nm 的 吸光值）。在反應的條件下，樣本中的抗氧化物質造成 750 nm 或 405 nm 上 吸光度的降低，而降低的量跟抗氧化物質的濃度成正比。樣本中抗氧化物質防 止 ABTS 的氧化是與 Trolox 作比較，Trolox 為水溶性的 tocopherol 類似 物，並定量為 millimolar Trolox equivalents。
反應式： HX-FeIII + H2O2 ·X-[FeIV=O] + H2O ABTS + ·X-[FeIV=O] ABTS·+ + HX-FeIII
在此方程式中，HX-FeIII 是 metmyoglobin 而 ·X-[FeIV=O] 是 ferryl myoglobin。ABTS·+ 為水溶性的 chromogen ，會呈色。
2. 方法
樣品製備 －
將 islets pellet 加入 75 μl assay buffer 後在冰上以超音波震盪震破細胞，接著 以 4℃、10000 g、15 min. 的條件離心，取上清液至新 eppendorf 並放置於冰 上，若非當天測試則需放入- 80 ℃，可穩定保存一個月。
製備 Trolox 標準品：拿七個乾淨玻璃試管並標示1-7。加入重組的 Trolox 及 Assay Buffer 至試管中如下圖所示。
第三章 材料與分法
Tube Final
Reconstituted Trolox (μl)
Assay Buffer (μl) Concentration (mM Trolox)
1 0 500 0 Metmyoglobin 和 150 μl Chromogen。
b. 樣品槽 - 加入 10 μl 樣品、10 μl Metmyoglobin 和 150 μl Chromogen 至 兩個槽（二重複）。為獲得再現性結果，樣品抗氧化物含量需落在標準曲線 內，必要時可用 Assay Buffer 將樣品稀釋至標準曲線範圍內。
c. 每槽加入 40 μl hydrogen peroxide working solution 後反應開始作用，加
c. 每槽加入 40 μl hydrogen peroxide working solution 後反應開始作用，加